一種海洋廣鹽性綠藻分離淡化培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種海洋廣鹽性綠藻分離淡化培養(yǎng)方法，其特征為：所述的海洋廣鹽性綠藻分離淡化方法步驟如下：a、將從海洋中采集的水樣稀釋后直接涂布于蒸餾水配制的瓊脂培養(yǎng)基上，在適應(yīng)的條件下培養(yǎng)出單藻落；b、將上述培養(yǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)移到新的瓊脂培養(yǎng)基上通過劃線方法進(jìn)一步純化；c、將上述劃線純化的單藻落接入液體培養(yǎng)基放在適宜的條件下放大培養(yǎng)出單種藻。本發(fā)明的方法經(jīng)多種海洋綠藻分離淡化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，是一種操作簡單有效，效率較高的方法，很適應(yīng)于大量篩選海洋廣鹽性綠藻中推廣應(yīng)用，有利于篩選優(yōu)質(zhì)的藻類資源，大幅度提高優(yōu)質(zhì)藻種篩選效率。
【專利說明】一種海洋廣鹽性綠藻分離淡化培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到微藻的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說是一種用于廣鹽性綠藻快速分離篩選及淡化的培養(yǎng)方法。
技術(shù)背景
[0002]微藻是一種分布廣、生長快微型光合水生生物，其光能利用率比大田作物高幾倍到幾十倍，可以利用微藻開發(fā)各種食品、化學(xué)藥品及人類健康的生物活性物質(zhì)等各種產(chǎn)品，如胡蘿卜素、蝦青素、藻膽素、脂肪酸、多糖類、維生素、乙醇和生物柴油等產(chǎn)品。以上各種產(chǎn)品極具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0003]鑒于以上藻類的優(yōu)良特點(diǎn)及較高的商業(yè)價(jià)值，以此對藻類的應(yīng)用和選擇具有重要意義，優(yōu)良藻種的選擇顯得更為重要。優(yōu)良的藻種首先要具備生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、所需活性物質(zhì)含量較高。鹽度的廣泛適應(yīng)性是微藻適應(yīng)性強(qiáng)和商業(yè)化的重要指標(biāo)之一，現(xiàn)有幾種商業(yè)化的藻類(如鹽藻，雨生紅球藻)皆滿足生長速度快和所需活性物質(zhì)含量較高，但對于鹽度的適應(yīng)性較差，在培養(yǎng)過程中極易因鹽度的變化而導(dǎo)致培養(yǎng)失??；海洋中含有豐富的微藻種質(zhì)資源，為從海洋中選擇廣鹽性微藻提供了有利條件，現(xiàn)有技術(shù)首先將微藻分離后用海水培養(yǎng)，然后通過逐步加淡水的方式淡化，用時(shí)較長，效率較低且操作盲目性較大，不適合大量篩選廣鹽性藻類。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種海洋廣鹽性綠藻快速分離篩選及淡化的培養(yǎng)方法，它可豐富現(xiàn)有廣鹽性藻的種類及淡化方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種海洋廣鹽性綠藻分離淡化培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的海洋廣鹽性綠藻分離淡化方法包括如下步驟:a、采集的海水為海灣內(nèi)或入?？谔?，將采集的海水用蒸餾水稀釋10后后直接涂布于蒸餾水配制的瓊脂培養(yǎng)基上，在20-28度，光照1000-4000LUX的條件下根據(jù)單藻落得生長速度培育7-20天，直到單藻落達(dá)到1mm左右的時(shí)候再進(jìn)行轉(zhuǎn)培養(yǎng)；b、將上述達(dá)到1mm左右的的單藻落用牙簽或者接種環(huán)轉(zhuǎn)移到新的蒸餾水配制的瓊脂培養(yǎng)基上，通過劃線方法進(jìn)一步將藻類純化，在20-28度光照1000-4000LUX的情況下培養(yǎng)7-20天；C、將上述瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的菌落再次接入蒸餾水配制的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)10天左右，生長出來的微藻就實(shí)現(xiàn)分離與淡化的效果。
[0006]我們用這種方法分離并淡化了大約30種海洋綠藻，30種海洋綠藻的成功分離及淡化培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)表明，此方法是一種有效的，效率高的方法，適合于海洋廣鹽性藻類分離、淡化、篩選，有較高的應(yīng)用價(jià)值，為篩選廣適應(yīng)性的藻類提供了有效的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1為海水稀釋后直接涂板的藻類菌落生長效果圖。[0008]圖2為轉(zhuǎn)移劃線培養(yǎng)后的藻類實(shí)體生長效果圖。
[0009]圖3為分離純化后的微藻在淡水液體培養(yǎng)基內(nèi)的生長效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0011]本發(fā)明一種海洋廣鹽性綠藻快速分離篩選及淡化的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的一種海洋廣鹽性綠藻快速分離篩選及淡化的培養(yǎng)方法包括如下步驟:a、將從海洋中采集的水樣用蒸餾水稀釋直接涂布于蒸餾水配制的瓊脂培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿含有瓊脂培養(yǎng)及15-40ml。其瓊脂培養(yǎng)基組成如下:溶液20ml包含K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g；KNO3 0.2g; 土壤抽提液100ml，瓊脂0.96-1.5g;b、將上述培養(yǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)移到新的瓊脂培養(yǎng)基上通過劃線方法進(jìn)一步純化；C、將上述劃線純化的單藻落接入液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基的組成如下:溶液20ml包含K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g ; KNO3
0.2g; 土壤抽提液100ml，a步驟中將海水水樣用10倍的蒸餾水稀釋，取水樣0.1-1ml直接涂與瓊脂培養(yǎng)基上，放在溫度20-28光照1000-4000Lux的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)7_20天，a步驟和b步驟中瓊脂培養(yǎng)是15-40ml，是液體培養(yǎng)加入0.8%-1.5%的瓊脂后在121度滅菌20分鐘后分裝到各個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌封口膜密封備用，C、步驟中液 體培養(yǎng)基是用蒸餾水配置好在121度高壓滅菌20分鐘后冷卻備用，液體培養(yǎng)基體積為100ml。
[0012]實(shí)施例1 一種海洋廣鹽性綠藻快速分離篩選及淡化的培養(yǎng)方法。
[0013]具體步驟操作如下:a、從沿海或河流入?？谔幱?00ml的白色塑料瓶，在海水表層或海水不深于3m處取回水樣，取回來的水樣放入15玻璃試管內(nèi)，海水水樣1ml，用9ml的蒸餾水進(jìn)行稀釋，用移液槍吸取稀釋的水樣0.1-1ml滴在瓊脂培養(yǎng)基上，用玻璃棒將水滴涂抹均勻后，用封口膜將培養(yǎng)皿封存好，放在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件2 O - 2 8度，光照1000-4000Lux,培養(yǎng)7-20天(參考圖1)。瓊脂培養(yǎng)基組分為:溶液20ml包含K2HPO4 0.02g;MgSO4.7H20 0.02g ; KNO3 0.2g; 土壤抽提液 100ml，瓊脂 0.96-1.5g。
[0014]等待a中的藻落漲到Imm左右時(shí)，用消毒后的牙簽或者接種環(huán)在無菌操作臺內(nèi)將單藻落用劃線的方法接種到新的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)(參考圖2)，在培養(yǎng)箱內(nèi)溫度20-28度，光照1000-4000Lux范圍內(nèi)培養(yǎng)。
[0015]等到所劃線藻生長到如圖2狀態(tài)時(shí)，同樣在無菌操作臺中用消毒后的牙簽或者接種環(huán)將上述的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移到蒸餾水配置的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基組分為溶液20ml包含 K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g ; KNO3 0.2g; 土壤抽提液 100ml。
[0016]將上述接種到IOOml三角燒瓶內(nèi)培養(yǎng)7-20天，等到藻類生長到如圖3的狀態(tài)，然后通過顯微鏡檢驗(yàn)藻類的純度和形態(tài)。
[0017]通過上述方法我們將已經(jīng)分離純化的藻類進(jìn)行ISsrDNA的分子鑒定
通過這種方式我們已經(jīng)分離出28個(gè)藻類:0urococcus sp.C24, Scenedesmusobtususgene, Chlorella sp.CCAP 222/18, Chlorella sp.KMMCC FC-21, Chlorella sp.CB 2008/110
Micractinium sp.CCAP 248/14, Scenedesmus armatus var.subalternans,Chlorellasorokiniana, Chlorellaceae sp.M7,Monoraphidium contorturnstrain AS6-3,Chlorella sp.CB 2008/110, Nannochloris sp.,Sphingomonas sp.Frlj Desmodesmus pannonicus，Chlorella vulgaris strain KMMCC FC—42，Desmodesmusintermedius,Hindakiafal lax strain CCAP 222/30, Chlorella sp.CB2008/110，Mychonastes rotundus strain CCAP 260/14， Chlorella vulgaris strainKMMCC FC-42, Chlorella sp.CB 2008/110, Chlorella sp.KMMCC FC-21, RaphidonemaspiculiformeChlorella sp.，CCAP 222/18，Chlorella sp.CB 2008/110，Micractiniumsp., CCAP 211/92Monoraphidiumcontortum strain AS6-3，Scenedesmusobliquus (斜生柵藻)。
[0018] 上述所分離出的藻種現(xiàn)在保存于北京大學(xué)深圳研究院環(huán)境與能源藻類工工程研發(fā)及應(yīng)用 實(shí)驗(yàn)室。
【權(quán)利要求】
1.一種海洋廣鹽性綠藻分離淡化培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的廣鹽性綠藻的分離培養(yǎng)方法包括如下步驟:a、將從海洋中采集的水樣稀釋后直接涂布于蒸餾水配制的瓊脂培養(yǎng)基上，在適應(yīng)的條件下培養(yǎng)出單藻落；b、將上述培養(yǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)移到新的瓊脂培養(yǎng)基上通過劃線方法進(jìn)一步純化；C、將上述劃線純化的單藻落接入液體培養(yǎng)基放在適宜的條件下放大培養(yǎng)出單種藻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋廣鹽性藻類的分離淡化培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟a中的海水為海灣處或入?？谔幒Ｋ龅南♂層盟疄檎麴s水，稀釋濃度為原海水的10倍。
3.根據(jù)權(quán)利I所述的一種海洋廣鹽性藻類的分離淡化培養(yǎng)方法，其瓊脂培養(yǎng)基組成如下:溶液 20ml 包含 K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g ; KNO30.2g; 土壤抽提液 100ml，瓊脂0.96-1.5 ;土壤抽提液的制備方法:土壤取自無污染、無施肥的、無噴灑化學(xué)藥物的樹林內(nèi)土壤，將土壤取出一些雜物等在空氣中風(fēng)干用2-4_的篩子過濾，加入兩倍體積的蒸餾水高壓滅菌15分鐘用whatman Nol過濾后方可使用。
4.根據(jù)權(quán)利I所述的一種海洋廣鹽性藻類的分離淡化培養(yǎng)方法，其特征在于:a步驟和c步驟中所述的是以培養(yǎng)條件為:溫度20-28度，光照1000-3000Lux。
5.根據(jù)權(quán)利I所述的一種海洋廣鹽性藻類的分離淡化培養(yǎng)方法，其特征在于:按步驟中所述的瓊脂培養(yǎng)基和c 步驟中所述的液體培養(yǎng)基所用水均為蒸餾水。
【文檔編號】C12N1/12GK103451102SQ201210169713
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月29日
【發(fā)明者】張善發(fā), 汪光義, 邵聰, 劉 英 申請人:北京大學(xué)深圳研究生院