專利名稱：一種源于土壤稀有放線菌的抗真菌化合物分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥的生產(chǎn)方法，特別涉及一種源于土壤稀有放線菌的抗真菌化合物分離制備方法。
背景技術(shù)：
目前，從發(fā)酵液中分離抗生素粗產(chǎn)物的方法主要有兩類，一種是溶劑萃取法，該方法主要利用一些與水不互溶的有機(jī)溶劑，如ニ氯甲烷、こ酸こ酷、正丁醇等從發(fā)酵液中萃取有效成分；另ー種方法主要是通過(guò)吸附法，如利用大孔樹(shù)脂或活性炭等材料從發(fā)酵液中吸附獲得有效成分。溶劑萃取法需要消耗大量的有機(jī)溶剤，不僅造價(jià)高昂，而且對(duì)環(huán)境造成較大危害；大孔樹(shù)脂雖然可經(jīng)再生后循環(huán)利用多次，但是其自身成本及使用后的處理成本仍不能忽視。本發(fā)明需要探索出ー種適用于本化合物的獨(dú)特的分離制備方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從一種土壤稀有放線菌發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)ー種抗真菌農(nóng)用抗生素，并且探索出一種成本低廉、勞動(dòng)強(qiáng)度低、而且有效成分收率可達(dá)95%以上的抗真菌化合物分離制備方法。即在抗生素粗產(chǎn)物的獲得方法上，摒棄了目前常用方法，極大降低了生產(chǎn)成本和人工成本，而且環(huán)境污染小。在獲得粗提物的基礎(chǔ)上，繼續(xù)開(kāi)發(fā)出ー套完整的產(chǎn)物精制方法，按照本方法可獲得純度高達(dá)98%以上的產(chǎn)物。本發(fā)明從ー種土壤稀有放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中，分離出一種大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌化合物，該化合物的分子式為=C4tlH6tlN2O11 ;分子量為744. 9113，共由40個(gè)碳原子、60個(gè)氫原子、2個(gè)氮原子和11個(gè)氧原子組成。一種源于土壌稀有放線菌的抗真菌化合物分離制備方法，其特征在于包括如下步驟
(1).將接種有本化合物產(chǎn)生菌的成熟培養(yǎng)基斜面，分別經(jīng)ー級(jí)液體擴(kuò)繁培養(yǎng)基和ニ級(jí)液體擴(kuò)繁培養(yǎng)基擴(kuò)繁后接種于發(fā)酵液中，在回旋式恒溫?fù)u床上于150轉(zhuǎn)/min-180轉(zhuǎn)/min、26°C _30°C條件下恒溫培養(yǎng)90— 96小時(shí)；
(2).收集步驟(I)中的發(fā)酵液于容器中，在攪拌條件下加酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液至pH=2. 0-3. 5范圍，靜置分層后，離心收取下層沉淀物，即可獲得原始粗提物；
(3).將離心獲得的原始粗提物用丙酮在攪拌條件下抽提2-3次，毎次抽提時(shí)間為3-4小吋，每次抽提完畢后，采用抽濾法收集丙酮抽提液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40°C _45°C水浴條件下，蒸干抽提液中的丙酮，剰余水相于40°C -50°C下鼓風(fēng)烘干；
(4).用丙酮復(fù)溶步驟(3)中水相烘干物，抽濾，分別收集丙酮和濾渣，將濾渣用丙酮再溶解一次，合并兩次的丙酮抽濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40°C _45°C水浴條件下，濃縮丙酮抽濾液至無(wú)沉淀析出，根據(jù)最終剰余的丙酮體積，加入10-15倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH=8. 0-8. 5，加入1/6至1/5體積的非極性大孔樹(shù)脂，在攪拌條件下吸附3_5小時(shí)，待吸附完成后，抽濾，收集大孔樹(shù)脂；(5).根據(jù)收集到的大孔樹(shù)脂體積，向其中加入5-10倍丙酮體積占80%-90%的丙酮水溶液，調(diào)節(jié)PH=8. 0-9. 0，在攪拌條件下解吸附2-4小時(shí)，抽濾，收集解吸液，大孔樹(shù)脂在同樣條件下再解吸附一次，合并兩次的解吸液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40°C _45°C水浴條件下，蒸掉解吸液中的丙酮，保存水相；
(6).將剩余水相轉(zhuǎn)入分液漏斗中，在振搖條件下，用與水相等體積的こ酸こ酯萃取2-3次，靜置分層后，分取上層こ酸こ酷，將分取的こ酸こ酯轉(zhuǎn)入旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40°C -45°C水浴條件下蒸干；
(7).向步驟(6)中的旋蒸瓶中逐漸滴加こ酸こ ，直至剰余物完全溶解，根據(jù)滴加入的こ酸こ酯體積，再加入50-60倍的正己烷，互溶均勻后 放置于-10°C -0°C低溫下8-15小時(shí)，進(jìn)行重結(jié)晶，采用抽濾法，去除結(jié)晶析出的沉淀物，保留抽濾液；
(8).將步驟(7)中抽濾液轉(zhuǎn)入旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40°C—45°C水浴條件下蒸干，向旋蒸瓶中逐漸滴加こ酸こ酷，直至旋蒸瓶中剰余物完全溶解，根據(jù)滴加入的こ酸こ酯體積，，繼續(xù)向旋蒸瓶中加入100倍-200倍的正己烷，互溶均勻后，放置于-io°c -0°C低溫下8-15小時(shí)，進(jìn)行重結(jié)晶，待析出沉淀后，采用抽濾法收集析出沉淀物，所得物質(zhì)即為通式
(1)所示的目標(biāo)產(chǎn)物
權(quán)利要求
1.一種源于土壤稀有放線菌的抗真菌化合物分離制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1).將接種有本化合物產(chǎn)生菌的成熟培養(yǎng)基斜面，分別經(jīng)ー級(jí)液體擴(kuò)繁培養(yǎng)基和ニ級(jí)液體擴(kuò)繁培養(yǎng)基擴(kuò)繁后接種于發(fā)酵液中，在回旋式恒溫?fù)u床上于150轉(zhuǎn)/min-180轉(zhuǎn)/min、26°C _30°C條件下恒溫培養(yǎng)90— 96小時(shí)； (2).收集步驟(I)中的發(fā)酵液于容器中，在攪拌條件下加酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液至pH=2. 0-3. 5范圍，靜置分層后，離心收取下層沉淀物，即可獲得原始粗提物； (3).將離心獲得的原始粗提物用丙酮在攪拌條件下抽提2-3次，毎次抽提時(shí)間為3-4小吋，每次抽提完畢后，采用抽濾法收集丙酮抽提液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40°C _45°C水浴條件下，蒸干抽提液中的丙酮，剰余水相于40°C -50°C下鼓風(fēng)烘干； (4).用丙酮復(fù)溶步驟(3)中水相烘干物，抽濾，分別收集丙酮和濾渣，將濾渣用丙酮再溶解一次，合并兩次的丙酮抽濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40°C _45°C水浴條件下，濃縮丙酮抽濾液至無(wú)沉淀析出，根據(jù)最終剰余的丙酮體積，加入10-15倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH=8. 0-8. 5，加入1/6至1/5體積的非極性大孔樹(shù)脂，在攪拌條件下吸附3_5小時(shí)，待吸附完成后，抽濾，收集大孔樹(shù)脂； (5).根據(jù)收集到的大孔樹(shù)脂體積，向其中加入5-10倍丙酮體積占80%-90%的丙酮水溶液，調(diào)節(jié)pH=8. 0-9. 0，在攪拌條件下解吸附2-4小時(shí)，抽濾，收集解吸液，大孔樹(shù)脂在同樣條件下再解吸附一次，合并兩次的解吸液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40°C _45°C水浴條件下，蒸掉解吸液中的丙酮，保存水相； (6).將剩余水相轉(zhuǎn)入分液漏斗中，在振搖條件下，用與水相等體積的こ酸こ酯萃取2-3次，靜置分層后，分取上層こ酸こ酷，將分取的こ酸こ酯轉(zhuǎn)入旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40°C -45°C水浴條件下蒸干； (7).向步驟(6)中的旋蒸瓶中逐漸滴加こ酸こ酷，直至剰余物完全溶解，根據(jù)滴加入的こ酸こ酯體積，再加入50-60倍的正己烷，互溶均勻后，放置于-10°C -0°C低溫下8-15小時(shí)，進(jìn)行重結(jié)晶，采用抽濾法，去除結(jié)晶析出的沉淀物，保留抽濾液； (8).將步驟(7)中抽濾液轉(zhuǎn)入旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40°C—45°C水浴條件下蒸干，向旋蒸瓶中逐漸滴加こ酸こ酷，直至旋蒸瓶中剰余物完全溶解，根據(jù)滴加入的こ酸こ酯體積，，繼續(xù)向旋蒸瓶中加入100倍-200倍的正己烷，互溶均勻后，放置于-io°c -0°C低溫下8-15小時(shí)，進(jìn)行重結(jié)晶，待析出沉淀后，采用抽濾法收集析出沉淀物，所得物質(zhì)即為通式(I)所示的目標(biāo)產(chǎn)物 H3%9H]|CHI 。HiCx 'CHi,HO rジIX/\I_ \ nuジ、 ΛΜ·\ill O OH 0Z-、ィ、へすスス, J'I1 も L3 L Im I νO 分子式為=C4ciHfwN2O11 ;其中包括一個(gè)內(nèi)酯環(huán)及其附屬側(cè)鏈部分、糖環(huán)及其側(cè)鏈部分及脂肪側(cè)鏈 部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種源于土壤稀有放線菌的抗真菌化合物分離制備方法。本發(fā)明從一種土壤稀有放線菌發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)一種抗真菌農(nóng)用抗生素，在抗生素粗產(chǎn)物的獲得方法上，采用丙酮替代最常見(jiàn)的甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，由于丙酮易于蒸發(fā)，使得蒸發(fā)過(guò)程節(jié)省了大量電能消耗，不僅降低了生產(chǎn)成本，而且節(jié)約了生產(chǎn)時(shí)間。按照本方法可獲得通式(Ⅰ)所示的目標(biāo)產(chǎn)物，其純度高達(dá)98%以上。
文檔編號(hào)C12P17/16GK102660597SQ201210168548
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者劉紅梅, 周莉, 曹仁林, 沈躍, 蔡彥明, 陳志永, 高尚賓, 黃永春 申請(qǐng)人:農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所