專利名稱：玉米wus1基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物學和基因工程技術領域，具體地說，涉及玉米基因啟動子及其應用，尤其是在啟動植物組織表達目的基因中的用途。
背景技術：
植物基因工程的目的是將外源基因導入受體植物后使其正確而有效地表達，而適合的啟動子是外源基因有效表達的關鍵因素。目前，已有許多不同來源的啟動子被用于植物品質改良基因工程、抗病育種基因工程以及植物生物反應器等基因工程領域。這些啟動子中一大類是從根癌農(nóng)桿菌中分離出來的，另一大類為植物本身來源的啟動子。但是上述啟動子控制的目的基因表達量往往較低，所以在植物植物遺傳轉化中通常選用植物病毒啟動子。在植物基因表達中廣泛應用的啟動子主要是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟 動子。但是從病毒中克隆出來的基因啟動子序列應用到植物基因工程中可能存在潛在的生物不安全性，因此，從植物本身克隆活性強的啟動子勢在必行。目前已經(jīng)從植物中克隆的可高效表達的組成型啟動子主要有水稻肌動蛋白基因(actinl)啟動子和玉米泛素基因(ubiquitin)啟動子,種類較少。玉米WUS (wuschel)基因編碼一轉錄因子，它的存在使周圍細胞具有干細胞的特征，與之相關的信號系統(tǒng)近年逐步被闡明。在莖尖分生組織內WUS和CLV (clavata)之間形成一個反饋調節(jié)環(huán)，使得干細胞保持自我更新，維持莖尖的頂端優(yōu)勢。在胚胎分生組織內，CLV3的表達只依賴于WUS的存在，而在胚以后的發(fā)育中，CLV3的表達受到WUS和STM(shootmeristemless)的雙重調節(jié)，啟動器官發(fā)生。在花分生組織中，WUS和LFY (leafy)共同激活AG (agamous)基因的表達，WUS受AG的反饋抑制。由WUS建立的信號體系還參與胚珠的發(fā)育。當WUS蛋白和生長素共存時，可以高效啟動體細胞胚的發(fā)生。細胞對WUS信號的感應性與細胞所處的微環(huán)境有關，WUS在不同環(huán)境條件下可以啟動不同的下游基因表達。WUS基因啟動子的克隆一方面將有利于玉米發(fā)育機制的研究，另一方面將可能提供另一種可啟動目的基因高效表達的植物自身啟動子。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種分離的多核苷酸。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種上述多核苷酸的用途。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種重組載體。本發(fā)明的第四個目的是，提供一種遺傳工程化的宿主細胞。本發(fā)明的第五個目的是，提供一種制備轉基因植物的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是
一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸選自下列中的一種a)由SEQ ID NO. 3所不的序列構成的核苷酸序列；或10與a)中所限定的核苷酸序列互補的核苷酸序列。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是如上所述的多核苷酸在啟動植物組織表達目的基因中的用途。所述的植物組織是根、托葉、葉和/或莖。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是
一種重組載體，所述的重組載體含有如上所述的多核苷酸，作為啟動子元件。所述的重組載體還含有與所述的多核苷酸可操作地連接的目的基因。為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術方案是
一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有如上所述的重組載體；或其基因組中整合有外源的如上所述的多核苷酸。為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術方案是
一種制備轉基因植物的方法，所述的方法包括下列步驟a)提供含有作為啟動子元件的如上所述的多核苷酸以及與所述多核苷酸可操作地連接的目的基因的構建物山)將所述構建物導入植物細胞、組織或器官；c)篩選出導入了所述構建物或染色體中整合有所述構建物的植物細胞、組織或器官；d)使所述的植物細胞、組織或器官再生成植株。所述的植物為作物。所述的植物為禾本科植物。所述的禾本科植物選自水稻、玉米、小麥、大麥或高粱。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明克隆得到了 WUSl基因啟動子，并證明該啟動子能啟動目的基因在水稻的根、托葉、葉和莖中表達，與轉化PCAMBIA1301載體的陽性對照比較表明，該啟動子驅動目的基因表達的效率與(CaMV) 35S啟動子相當，是一種新的可用于植物基因工程的來源于植物的啟動子，生物安全性強；同時，該啟動子的克隆對于玉米發(fā)育機制的研究具備重要的參考價值。
附圖I是PMD18-T載體圖譜。附圖2是pCAMBIA1301載體圖譜。附圖3是轉基因植株各組織的⑶S染色結果，表達⑶S的細胞經(jīng)染色呈藍色，A-D分別是轉化p-ZmPwl載體水稻的根、托葉、葉、莖的GUS染色結果；E_H分別是轉化PCAMBIA1301載體水稻的根、托葉、葉、莖的GUS染色結果；I_L分別是未轉化水稻的根、托葉、葉、莖的⑶S染色結果。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例I
I、材料
本實施例中所用方法如無特別說明均為本領域的技術人員所知的常規(guī)方法；所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，測序由Invitrogen公司進行；PCR試劑盒、連接試劑盒和載體構建過程中的核酸內切酶均購自于自寶生物工程有限公司，質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購于全式金生物技術有限公司，具體操作方法均參照試劑盒說明書進行；Trans5a化學感受態(tài)細胞、EH105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞購于全式金生物技術有限公司；PMD18-T Vector和pCAMBIA1301購于寶生物工程有限公司，載體圖譜分別如圖I和圖2所示；YEP液體培養(yǎng)基配方為牛肉浸膏10 g，酵母提取液10 g，NaCl 5 g，pH 7.0，對應的固定培養(yǎng)基添加I. 5%的瓊脂；愈傷誘導培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、液體共培養(yǎng)基、固體共培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基均為水稻遺傳轉化常用培養(yǎng)基。2、方法和結果
2.1玉米基因的獲得
首先在NCBI網(wǎng)站(http://www. ncbi.nlm.nih. gov)中以關鍵詞“fKS7”搜索基因，獲得玉米ri/分基因表達的核苷酸序列。
2. 2玉米WUSl基因啟動子ZmPWl的克隆
將啟動WUSl表達的啟動子命名為ZmPWl，根據(jù)WUSl上游長度為528 bp的核苷酸序列設計擴增該片段的引物，上游加歷HI (AAGCTT)酶切位點，下游加Afco I (CCATGG)酶切位點，引物序列如下上游引物(SEQ ID NO. 1):5’-CGCAAGCTTCCAAAATGTAGT GATGCA-3’；下游引物(SEQ ID NO. 2) :5’ - TGCCATGGATGCCTCAGCAGC TGGTCA -3’。提取玉米(Zea mays L. )B73基因組DNA并以此為模板，在SEQ ID NO. I和SEQ ID
NO. 2的引導下，進行PCR擴增，PCR反應體系為
ToXPCRBuffer|5μ L
TbmMdNTPsI μ L
上游引物_1μ
ΙΟμΜ下游引物_I μ L
至~米Β73基因組DNAIOpg —
DNAPolymerase (21Ι/μ )O. 5 μ L
IdH2O139. 5~
PCR反應條件為預變性94°C，5分鐘；變性:94°〇，30秒，退火571，40秒，延伸72°C，I分鐘，變性至延伸總共循環(huán)34次；延伸完全72°C，10分鐘。反應結束后，PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化528 bp的目的片段即啟動子ZmPWl，將其克隆到載體pMD18-T Vector，得到重組質粒載體pMD18_ZmPWl，再將該重組質粒載體轉化到TranS5a化學感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆，測序，測序結果表明啟動子ZmPWl具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。2. 3 WUSl基因啟動子ZmPWl表達載體的構建
將用PCR擴增得到并克隆于PMD18-T載體上的ZmPWl片段用Hind III和Afco I酶切并回收，與用相同酶切PCAMBIA1301載體回收的片段連接，構建表達載體p-ZmPWl，其載體構建圖具體是hpt :潮霉素抗性基因，在該基因上游有一 nos啟動子；ZmPWl :啟動子ZmPWl ；gus glucoronidase基因，即⑶S報告基因；nos :終止子,在其下游是⑶S報告基因。取純化后I μ g的p-ZmPWl質粒DNA加入到200 μ L ΕΗ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，混勻；冰浴5分鐘后轉入液氮中速凍I分鐘，接著移至37°C水浴5分鐘，加入I mL YEP液體培養(yǎng)基，28°C，250 rpm預表達4-5小時；10000 rpm離心30秒，棄上清，加入O. ImL YEP液體培養(yǎng)基，重新懸浮細胞；涂布于含100 μ g/mL卡那霉素(Kanamycin, Kan)和50 μ g/mL利福平的YEP固體平板上，28°C培養(yǎng)約48小時。挑取平板上長出的單菌落，接種于含100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，最后提取質粒。所提質粒先用SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2進行PCR初步鑒定，再用Hind III和Afco I酶切驗證。2. 4農(nóng)桿菌介導水稻遺傳轉化
通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法和共培養(yǎng)法將含有目的基因ZmPWl的農(nóng)桿菌導入植物受體材料水稻中花11號。
2. 4. I水稻成熟胚愈傷組織的誘導培養(yǎng)與繼代培養(yǎng)
去殼的水稻成熟種子先用ddH20洗4-5次，再用70%乙醇浸泡1-2分鐘，然后用含有1/1000吐溫的20%次氯酸鈉浸泡30分鐘，期間不停的搖晃，進行表面滅菌，之后用無菌水沖洗3-4次，再將成熟種子放在無菌濾紙上吸干水分后，放在愈傷誘導培養(yǎng)基上，28°C弱光培養(yǎng)。約10-15天后，將愈傷組織轉入繼代培養(yǎng)基上，在相同條件下繼代培養(yǎng)。每兩周繼代培養(yǎng)一次，繼代兩次后，挑取色澤淡黃的愈傷組織用于共培養(yǎng)。2.4.2用于轉化水稻的農(nóng)桿菌菌液的準備
將含有P-ZmPWl的農(nóng)桿菌接種于YEP液體培養(yǎng)基(含有100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL利福平)中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl=O. 6-1.0 ;室溫下5000 rpm離心5分鐘收集菌體，隨后將其懸浮于液體共培養(yǎng)基中，調整菌體濃度至0D_=0. 4，即為轉化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。2. 4. 3農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織
挑選狀態(tài)較好(繼代培養(yǎng)5-7天、色澤淡黃)的愈傷組織放入25 mL無菌三角瓶中，力口入適量農(nóng)桿菌懸浮液以保證有足夠的菌液與材料接觸，280C，150 rpm搖床上培養(yǎng)20-30分鐘，之后倒掉菌液，將愈傷組織放在無菌濾紙上吸去多余菌液，隨即轉移至鋪有一層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上，22 °C暗培養(yǎng)2-3天。2. 4. 4抑菌處理
用ddH20清洗愈傷組織3-4次至清洗液清亮，棄去清洗液，用無菌濾紙吸干，轉入含有500mg/L頭孢霉素和200mg/L羧節(jié)青霉素的溶液中振蕩滅菌半個小時以上，用無菌濾紙吸干，轉至鋪兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中干燥處理24-72小時；再將愈傷組織轉移至加有500mg/L頭孢霉素和50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，28°C光照培養(yǎng)約30天。2. 4. 5抗性愈傷組織的分化
從篩選后長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色致密的潮霉素抗性愈傷轉至含有50mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先28°C暗培養(yǎng)3天，然后轉至30°C全光照條件下培養(yǎng)，一般經(jīng)過15-20天左右，有綠點出現(xiàn)。30-40天后進一步分化出小苗。2.4.6生根、壯苗和移栽
待抗性愈傷組織分化出的小苗高度大于3cm時，移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3周。選擇高15cm以上、根系發(fā)達的小苗，用溫水洗去培養(yǎng)基，在溫室內移栽入土。水面以不淹沒小苗為度，晴天需要遮蔭到小苗成活(以吐水為準)。待轉基因小苗生長健壯后移入田中生長。2.5轉基因水稻的的鑒定
以提取的轉基因水稻總DNA為模板，用PCAMBIA1301載體抗性篩選基因潮霉素的上游引物和下游引物配對擴增潮霉素基因，初步鑒定轉基因植株。用于檢測潮霉素抗性基因的引物序列如下上游引物(SEQ ID NO. 4) :5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’ ；下游引物(SEQ IDNO. 5) :5’ -TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’。2. 6轉基因水稻各組織的⑶S染色
初步鑒定為轉基因植株后，接著對轉基因植株進行GUS組織染色。取轉基因水稻的根、托葉、葉片、莖四種待檢測的植物組織于離心管中，加入⑶S緩沖液浸沒組織塊，再加入5%(v/v)用量的⑶S染色液，混勻后37°C下保存16-24小時。葉片等綠色材料轉入70%乙醇溶液中脫色2-3次，直至陰性對照材料呈白色。染色結果如圖3所示，肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景下的藍色小點即為GUS表達載體p-ZmPWl的表達區(qū)域，結果表明啟動子ZmPWl能驅動基因在水稻的根、托葉、葉片、莖中表達，與35s啟動子效果相當。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種分離的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸選自下列中的ー種 a)由SEQID NO. 3所示的序列構成的核苷酸序列；或b)與a)中所限定的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.如權利要求I所述的多核苷酸在啟動植物組織表達目的基因中的用途。
3.根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的植物組織是根、托葉、葉和/或莖。
4.ー種重組載體，其特征在于，所述的重組載體含有如權利要求I所述的多核苷酸，作為啟動子元件。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體還含有與所述的多核苷酸可操作地連接的目的基因。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞 含有如權利要求4或5所述的重組載體；或 其基因組中整合有外源的如權利要求I所述的多核苷酸。
7.ー種制備轉基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步驟 a)提供含有作為啟動子元件的如權利要求I所述的多核苷酸以及與所述多核苷酸可操作地連接的目的基因的構建物； b)將所述構建物導入植物細胞、組織或器官； c)篩選出導入了所述構建物或染色體中整合有所述構建物的植物細胞、組織或器官； d)使所述的植物細胞、組織或器官再生成植株。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的植物為作物。
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的植物為禾本科植物。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的禾本科植物選自水稻、玉米、小麥、大麥或高粱。
全文摘要
本發(fā)明提供了玉米WUS1基因啟動子，其具有如SEQIDNO.3所示的序列構成的核苷酸序列或與SEQIDNO.3所示的序列互補的核苷酸序列；本發(fā)明還提供了含有所述啟動子的載體和宿主細胞；本發(fā)明還公開了所述啟動子的用途。其優(yōu)點在于克隆得到了WUS1基因啟動子，并證明該啟動子能啟動目的基因在水稻的根、托葉、葉和莖中表達，與轉化pCAMBIA1301載體的陽性對照比較表明，該啟動子驅動目的基因表達的效率與(CaMV)35S啟動子相當，是一種新的可用于植物基因工程的來源于植物的啟動子，生物安全性強；同時，該啟動子的克隆對于玉米發(fā)育機制的研究具備重要的參考價值。
文檔編號C12N15/84GK102703450SQ201210163590
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權日2012年5月24日
發(fā)明者姜翠萍, 曹建剛, 朱蘇文, 段思宇, 程備久, 竹榮梓, 項艷 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學