專利名稱：一種重組蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地說是一種利用鼠腹腔轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器制備重組蛋白的方法。
背景技術(shù)：
重組蛋白的制備是現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)鏈中的重要組成部分，目前許多重組蛋白的制備是通過原核表達(dá)。該方法雖然可快速、大量制備，但真核細(xì)胞的蛋白絕大數(shù)有翻譯后修飾，如二硫鍵和糖基化，這在原核表達(dá)都沒有修飾，因而產(chǎn)物活性大大降低。真核表達(dá)系統(tǒng)目前有體外(In Vitro)和體內(nèi)(In Vivo)兩種。In Vitro即用細(xì)胞培養(yǎng)的方法,雖然現(xiàn)在不斷在開發(fā)新的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器，但其仍然成本高、產(chǎn)量低。In Vivo即用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如轉(zhuǎn)基因牛乳腺生物反應(yīng)器，是目前生產(chǎn)高活性重組人蛋白的最好方法之一；但該方法先要制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，技術(shù)要求聞、成本也聞，而且制備一個(gè)新蛋白周期長、風(fēng)險(xiǎn)聞、靈活性差。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種利用鼠腹腔轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器制備重組蛋白的方法，以簡便方法，提高產(chǎn)率，降低成本。為此，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種重組蛋白的制備方法，其特征在于，將重組蛋白基因克隆至真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至鼠腹水細(xì)胞系；經(jīng)體外篩選、克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系后，鼠腹腔注射；以鼠腹腔作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)重組蛋白的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器，在形成腹水后抽取腹水，并從腹水中提取純化重組蛋白。所述的鼠腹水細(xì)胞系為大、小鼠腹水細(xì)胞系，所述的鼠腹腔為大、小鼠腹腔。本發(fā)明采用鼠腹腔作為轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器，整合了體外和體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)又可克服兩者的缺點(diǎn)；利用本發(fā)明制備的重組蛋白，不僅簡便、高效、快速、適用性好，而且成本低、產(chǎn)率高、重組蛋白天然活性好；本發(fā)明無須制備轉(zhuǎn)基動(dòng)物，而且腹水可隨時(shí)凍存復(fù)蘇以及注射傳代制備進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)，既達(dá)到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的生產(chǎn)量，又免去了制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過程及其以后的維護(hù)。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
小鼠腹腔轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器制備重組人肝細(xì)胞生長因子(hHGF)的方法將重組人肝細(xì)胞生長因子(hHGF)克隆至真核表達(dá)載體pSP-His的His標(biāo)簽的讀碼框內(nèi)，并轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌細(xì)胞系H22 ;經(jīng)Zeocin篩選、克隆多個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系H22/hHGF后，用WB和ELISA檢測各克隆系目的基因的蛋白表達(dá)水平；選取高表達(dá)克隆細(xì)胞系，小鼠腹腔注射；7_14天后抽取腹水，并用His的親和Ni柱分離純化目的蛋白hHGF，檢測、計(jì)算產(chǎn)量得 O. 87mg/100ml。
實(shí)施例2
大鼠腹腔轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器制備重組人白血病抑制因子(hLIF)的方法將重組人重組人白血病抑制因子(hLIF)克隆至真核表達(dá)載體pSP-His的His標(biāo)簽的讀碼框內(nèi)，并轉(zhuǎn)染至大鼠腹水細(xì)胞系Walker 256 ;經(jīng)Zeocin篩選、克隆多個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系Walker 256/ hLIF后，用WB和ELISA檢測各克隆系目的基因的蛋白表達(dá)水平；選取高表達(dá)克隆細(xì)胞系，大鼠腹腔注射；10-18天后抽取腹水，并用His的親和Ni柱分離純化目的蛋白hLIF，檢測、計(jì)算產(chǎn)量得O. 53mg/100ml。實(shí)施例3
小鼠腹腔轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器制備重組凝血因子VDI (FVDI)的方法將重組人凝血因子珊克隆至真核表達(dá)載體pSP-His的His標(biāo)簽的讀碼框內(nèi)，并轉(zhuǎn)染至 小鼠肝癌細(xì)胞系H22 ;經(jīng)Zeocin篩選、克隆多個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系H22/ F VDI后，用WB和ELISA檢測各克隆系目的基因的蛋白表達(dá)水平；選取高表達(dá)克隆細(xì)胞系，小鼠腹腔注射；7-14天后抽取腹水，并用His的親和Ni柱分離純化目的蛋白凝血因子珊，檢測、計(jì)算產(chǎn)量得
O.92mg/100ml。
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白的制備方法，其特征在于，將重組蛋白基因克隆至真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至鼠腹水細(xì)胞系；經(jīng)體外篩選、克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系后，鼠腹腔注射；以鼠腹腔作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)重組蛋白的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器，在形成腹水后抽取腹水，并從腹水中提取純化重組蛋白。
2.按權(quán)利要求I所述的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的鼠腹水細(xì)胞系為大鼠腹水細(xì)胞系或小鼠腹水細(xì)胞系。
3.按權(quán)利要求I或2所述的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的鼠腹腔為大鼠腹腔或小鼠腹腔。·
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組蛋白的制備方法?，F(xiàn)有的方法中，有的成本高、產(chǎn)量低；有的技術(shù)要求高、成本也高，而且制備一個(gè)新蛋白周期長、風(fēng)險(xiǎn)高、靈活性差。本發(fā)明的特征在于，將重組蛋白基因克隆至真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至鼠腹水細(xì)胞系；經(jīng)體外篩選、克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系后，鼠腹腔注射；以鼠腹腔作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)重組蛋白的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器，在形成腹水后抽取腹水，并從腹水中提取純化重組蛋白。利用本發(fā)明制備重組蛋白，不僅簡便、高效、快速、適用性好，而且成本低、產(chǎn)率高、重組蛋白天然活性好。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102719476SQ20121016173
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者范春雷 申請(qǐng)人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)