專利名稱：白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶的基因序列及其氨基酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種蛇毒蛋白纖溶酶編碼基因序列及其氨基酸序列。
背景技術：
纖溶酶是指能專一降解纖維蛋白凝膠的蛋白水解酶，是纖溶系統(tǒng)中的一個重要組份。體內(nèi)凝血和纖溶兩系統(tǒng)是相互依存緊密相聯(lián)的。機體一旦產(chǎn)生凝血反應，也幾乎同時激活了纖溶系統(tǒng)，使體內(nèi)多余的血栓移去，并通過負反饋效應使體內(nèi)纖維蛋白原的水平降低，從而避免纖維蛋白的過多凝聚。蛇毒纖溶酶的分布是十分廣泛的，有報道稱幾乎所有的響尾蛇毒均有纖溶組分。Fuffado等曾檢測了 9種矛頭蝮蛇蛇毒發(fā)現(xiàn)均含有纖溶活性。迄今為止已從蝰科眼鏡蛇科及游蛇科的多種蛇毒中獲得了純化的纖溶酶，其中分布最廣，含量最豐富的是蝰科中的蝮亞科蛇毒纖溶酶，能直接降解纖維蛋白原的Aa或80鏈，使其即 使在凝血酶存在下也不凝固，大多數(shù)可以溶解纖維蛋白根據(jù)它優(yōu)先降解纖維蛋白原Aa或
肽鏈分為a纖溶酶和0纖溶酶。纖溶酶一般只作用于A a或80肽鏈。根據(jù)纖溶酶結構特點還可分為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。目前國內(nèi)臨床上所使用的纖溶酶均為從動物體內(nèi)提取，純度不高，具有一定的抗原性，進入人體后，可能誘發(fā)一系列的抗原抗體反應，已有報道注射纖溶酶導致固定性藥疹及重癥多形紅斑藥疹，且不能實現(xiàn)靜脈注射給藥，使藥物不能最大限度發(fā)揮作用。經(jīng)過多年的臨床實踐，發(fā)現(xiàn)白眉蝮蛇蛇毒類纖溶酶有最好的療效。然而蛇毒資源是非常有限的，如果通過基因工程來獲得產(chǎn)品，則是一個很有前途的途徑。為了今后基因工程產(chǎn)品的開發(fā)，對白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶進行基因序列測定是一項有意義的研究課題。為此，本發(fā)明的目的是通過測定白眉蝮蛇蛇毒類纖溶酶N端的一段氨基酸序列，根據(jù)這段序列及其它蛇種纖溶酶在結構上的同源性，設計并合成上下游寡核苷酸引物，然后從白眉蝮蛇蛇毒腺中分離有關的m RNA作為模板，經(jīng)反轉錄獲得c DNA，用PCR法擴增和克隆了纖溶酶的全基因，分析測定基因的全序列。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶的編碼基因序列。本發(fā)明的另一個目的是提供白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶的氨基酸序列。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案I、總 RNA 提取切下蛇頭，立即取出毒腺，與液氮中速凍，置于-70°C備用，采用酸性硫氰酸月瓜 _ 釀 _ 氯仿一步法(參閱 Chomczynski P. et al. Analytical Biochemistry. 1987,162 156)抽提毒腺總RNA。2、引物設計依據(jù)，引物合成的方法根據(jù)測定的纖溶酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，結構為VIGGDECNINEHRSL，設計了上游寡核苷酸引物，即5’ GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA 3’ ；根據(jù)其它蛇種纖溶酶結構上的同源性(Arinos Magalhaes. , Beatriz Campos Brasil Da Fonsecaa, et al, 1993. Thecomplete amino acid sequence of a thrombin-like enzyme/gyroxin analogue fromvenom of the bushmaster snake(Lachesis muta muta).Eur. J. Biochem. 251,845 853.)在3’端的保守區(qū)段設計了下游寡核苷酸引物，即5’TCACGGGGGGCATGTCA 3’。引物在上海生工生物技術有限公司合成，引物見圖2。3、反轉錄、PCR擴增和基因克隆以白眉蝮蛇毒腺總RNA為模板，下游引物為引物作反轉錄。反轉錄試劑盒購自天根生化科技有限公司，操作按其說明書進行。從前步所得c DNA為模板，以合成的上下游引物進行PCR擴增。PCR擴增出一條約700bp的DNA片段，見圖3瓊脂糖凝膠電泳圖譜。采用 天根生化科技有限公司的膠回收試劑盒回收該PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物插入pGEM-Teasy載體(質(zhì)粒載體購自Promega公司)，并轉入DH 5 a大腸感受態(tài)細胞,經(jīng)藍白斑篩選和酶切鑒定，獲得10個陽性克隆。將陽性重組克隆經(jīng)pGEM-T easy載體克隆位點上、下游通用引物進行DNA測序，得到本發(fā)明的的白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶編碼基因的DNA (mRNA)序列。使用DNAMAN軟件，根據(jù)這個蛇毒纖溶酶編碼基因的DNA(mRNA)序列，得出該蛇毒纖溶酶的蛋白質(zhì)的一級結構(氨基酸序列)。本發(fā)明的優(yōu)點在于白眉蝮蛇是我國特有的蛇種，其纖溶酶的活力及療效遠優(yōu)于其他來源的纖溶酶，然而蛇毒資源有限，本發(fā)明克隆得到纖溶酶基因并測定其基因序列，為今后開發(fā)研制基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了良好的條件。下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，并非對沒發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作的任何本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
圖I白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶的核苷酸和氨基酸序列。a :纖溶酶的核苷酸序列；b :纖溶酶的氨基酸序列。圖2合成的寡核苷酸上游引物和下游引物。圖3PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。I :纖溶酶的PCR產(chǎn)物；2 :陰性對照；3 DL2000Markero圖4幾種蛇毒來源的纖溶酶的氨基酸組成。圖5去糖后纖溶酶的SDS-PAGE電泳圖。I :去糖后的纖溶酶；2 :蛋白標準Marker。
具體實施例方式實施例II、總 RNA 提取切下蛇頭，立即取出毒腺，于液氮中速凍，置于_70°C備用。取出IOOmg毒腺組織，加Iml溶液D (含4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，p H7. 0 ;5 %十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl),0. IM P -巰基乙醇)，在組織勻漿器中充分勻漿后，將勻漿液轉入IOml離心管中，再加入0. Iml 2M的乙酸鈉(pH4)，Iml的水飽和酚和0. 2ml的氯仿異戊醇(49 I)混合物，充分振蕩混勻后，在冰上靜置15min。樣品在日立冷凍離心機(Hitach Centrifuge20PR-52D)以IOOOOg于4°C離心20min，吸取上層水相，與等體積異丙醇混勻，置_20°C冷凍至少I小時。以IOOOOg離心20min收集沉淀并溶于0. 3ml溶液D，加入0. 03ml2M乙酸鈉和
0.3ml異丙醇，混勻，置于_20°C冷凍I小時。以IOOOOg離心20min收集沉淀再溶于0. 3ml焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過的H20，再加入0. 03ml乙酸鈉和0. 75ml乙醇，混勻，置于_20°C冷凍I小時，以IOOOOg離心20min收集沉淀，用75%洗滌RNA沉淀，自然干燥后將RNA溶于DEPC處理過的水中，分裝，置于_70°C備用。2、引物設計依據(jù)，引物合成的方法本發(fā)明根據(jù)測定的纖溶酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，結構為VIGGDECNINEHRSL，設計上游寡核苷酸引物為5’ GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA 3’ ；根據(jù)其它蛇種纖溶酶結 構上的同源性(Arinos Magalhaes. ,Beatriz Campos Brasil Da Fonsecaa, et al, 1993.The complete amino acid sequence of a thrombin-like enzyme/gyroxin analoguefrom venom of the bushmaster snake(Lachesis muta muta). Eur. J. Biochem. 251,845853.)在3’端的保守區(qū)段設計了下游寡核苷酸引物，即5’ TCACGGGGGGCATGTCA 3’。引物在上海生工生物技術有限公司合成，引物見圖2。3、反轉錄、PCR擴增和基因克隆以白眉蝮蛇毒腺總RNA為模板，上述的下游引物為引物作反轉錄。反轉錄試劑盒購自天根生物科技有限公司，操作按其說明書進行。從前步所得c DNA為模板，以上述的上下游引物進行PCR擴增。反應的總體積為30iil，其中3iil 10XPCR緩沖液，d NTP的終濃度為0.2m M和0. 3 y I Taq DNA聚合酶(購自Takara公司)。反應條件為95°C變性5min，然后95°C變性30s，59°C退火40s，72°C延伸30s，進行40個循環(huán)；最后72°C保溫lOmin。取8 反應產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖電泳檢查。PCR擴增出一條700bp左右的DNA片段，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見圖3。產(chǎn)物用天根生化科技有限公司的膠回收試劑盒進行膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物插入pGEM-T easy載體(質(zhì)粒載體購自Promega公司)，連接體系lOiil，其中PCR產(chǎn)物liil，pGEM-T easy載體0. 5，T4連接酶liil，2X連接緩沖液5 yl，dd H20 2. 5iU，4°C過夜。將連接產(chǎn)物轉入DH 5a大腸感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選和酶切鑒定，獲得10個陽性克隆。將陽性重組克隆經(jīng)pGEM-T easy載體克隆位點上、下游通用引物進行DNA測序，得到本發(fā)明的的白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶編碼基因的DNA(mRNA)序列。使用DNAMAN軟件，根據(jù)這個蛇毒纖溶酶編碼基因的DNA(mRNA)序列，得出該蛇毒纖溶酶的一級結構(氨基酸序列)。實施例2生物活性測定I、纖溶酶活力定性測定纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉變成纖維蛋白，在試管中形成乳白色凝塊，加入含纖溶酶樣品，纖溶酶作用于纖維蛋白，使之轉變成可溶性的小分子肽和氨基酸，凝塊溶解，呈液體狀態(tài)，凝塊溶解所需時間與纖溶酶活性大小相關。依據(jù)中華人民共和國藥典二部1995年版，略有改進，試管中加入150ul 6. 5mg/ml的Fg，再加入400ulGBSB緩沖液(明膠-巴比妥-Nacl緩沖液)和IOOul待測樣品置37°C恒溫水浴中，3分鐘后加入3u/ml T IOOul和I. 5u/ml Pg lOOul，盡快混勻，37°C繼續(xù)保溫，觀察試管中凝塊形成之后不同時間的不同溶解程度。結果向纖維蛋白中加入提取后的纖溶酶后，纖維蛋白轉變成可溶性的小分子肽和氨基酸，凝塊溶解，呈液體狀態(tài)，證明該蛋白酶具有纖溶酶活性，稱之為蛇毒類纖溶酶。比活的定量測定纖維蛋白平板上打上直徑I. 5mm的小孔，將待測樣品配制成合適濃度，微量進樣器取幾滴在孔內(nèi)，加蓋，37°C 12小時后測量溶圈直徑，與標準曲線對照即可得知待測樣品的酶活。尿激酶標準曲線精確配制尿激酶標準濃度分別為5，10，20，40，60，80u/ml每個濃度取10ml，點在已配置好的平板上，加蓋后，37°C恒溫12小時后取出量取每個溶圈的互相垂直的兩個直徑(mm)，不同時日反復測定5次，然后求得平均值列入表中，以標準尿激酶濃度(u/ml)為橫坐標，溶圈的直徑乘積(_ 2)為縱坐標，做尿激酶標準曲線。作為測活的兩種方法，試管法和平板法對纖溶物質(zhì)均有一定的敏感性，較好的重 復性和穩(wěn)定性。試管法操作簡便、快速，但定量性較差，適于中間產(chǎn)物的活性測定。平板法敏感、定量法好于試管法，適于最終產(chǎn)物的活力測定。但這兩種方法對于纖溶酶的活力測定都有不足之處。尿激酶是激活纖維蛋白溶酶，而我們提取出的纖溶酶是直接溶解纖維蛋白，作用機制并不完全相同。但目前國內(nèi)外尚無纖溶酶標準品，以尿激酶作為標準品是較現(xiàn)實的方法之一。實施例3氨基酸組成測定于小試管中加一定量樣品，加Iml 6mol/L HCl及一滴巰基乙醇,減壓封管。在105-110°C烘箱中水解24小時，打開封管，抽出HCl氣體，在氨基酸自動分析儀L-8500上測
氨基酸組成。該蛇毒纖溶酶的氨基酸組成，與同源性其他蛋白對比情況見圖4。由本發(fā)明得到的蛇毒纖溶酶的氨基酸序列，其氨基酸組成與測定值一致。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方案及實驗例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶的編碼基因序列，具有序列表中SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
2.一種白眉蝮蛇蛇毒纖溶酶的氨基酸序列，具有序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一種為克隆權利要求1、2所述的白眉蝮蛇蛇毒類纖溶酶基因而設計的人工合成寡核苷酸引物，其特征在于該引物序列如下 上游引物5 ’ GTTATTGGTGGCGATGAATGTAATATC 3， 下游引物5’ GCACGTACTGTGGGGG 3’
全文摘要
從白眉蝮蛇中分離純化得到纖溶酶，測得該酶N端10個氨基酸的序列，據(jù)此設計上游引物；然后根據(jù)與其它蝮屬蛇毒纖溶酶3’端非編碼區(qū)同源性較高區(qū)域設計下游引物。從毒腺中抽提總RNA，用PCR擴增出該基因，克隆后經(jīng)全序列測定表明該成熟蛋白的c DNA編碼708個核苷酸，即236個氨基酸。該基因的成功克隆及基因序列測定為開發(fā)基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造良好條件。
文檔編號C12N9/68GK102719461SQ20121015299
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權日2012年5月16日
發(fā)明者宋夢薇, 張雅楠, 王云鵬, 羅云波, 許文濤, 馬骉, 黃昆侖 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學, 北京賽升藥業(yè)股份有限公司