專利名稱：一種重組凡納濱對(duì)蝦Fortilin蛋白及酵母轉(zhuǎn)化體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞膜穿透性重組凡納濱對(duì)蟲下Fortilin蛋白和表達(dá)該蛋白畢赤酵母表達(dá)菌株，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦是世界上養(yǎng)殖產(chǎn)值最大的水產(chǎn)種類之一，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中也占有舉足輕重的地位。隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，由于集約化養(yǎng)殖水域生物負(fù)載過大等多方面問題，導(dǎo)致了對(duì)蝦病害流行，其中，對(duì)蝦病毒感染引發(fā)的病害造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也威脅著整個(gè)海洋生態(tài)的平衡。對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是對(duì)全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病原之一，自1992年爆發(fā)以來，給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。因此，深入開展對(duì)蝦免疫機(jī)制研究并在此基礎(chǔ)上尋找對(duì)蝦疾病防治的有效方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
Fortilin 蛋白，即翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumorprotein, TCTP),是ー種廣泛表達(dá),高度保守的真核蛋白家族。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ortilin蛋白是一種多功能蛋白，具有重要生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和惡性轉(zhuǎn)移、鈣結(jié)合功能、細(xì)胞外組胺釋放活性、抗凋亡及抗瘧疾作用等。Bangrak 等 2004 年克隆了斑節(jié)對(duì)奸 Fortilin-Pm-Fortilin,Pm-Fortilin 具有保守的Ca結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并具有抗凋亡活性。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)WSSV感染瀕死斑節(jié)對(duì)蝦血液中Fortilin mRNA表達(dá)量遠(yuǎn)低于正常水平，該基因在WSSV爆發(fā)時(shí)高表達(dá)，表明Fortilin可能在保護(hù)斑節(jié)對(duì)蝦免受WSSV侵染中起到一定作用。后續(xù)研究表明，Pm-Fortilin具有保護(hù)對(duì)奸抵抗WSSV的作用；對(duì)奸注射重組Fortilin (rFortilin)后，進(jìn)行WSSV感染，存活率達(dá)80_100%，且PCR檢測WSSV處于低水平，而瀕死的對(duì)蝦WSSV水平很高。此結(jié)果表明，注射重組rFortilin能以未知的機(jī)制降低病毒感染，推測可能是抑制病毒復(fù)制。近期有學(xué)者利用昆蟲ば9細(xì)胞研究Fortilin和病毒基因之間的相互作用，結(jié)果顯示，Pm-Fortilin抑制WSSV早期基因WSSV DNA polymerase和晚期基因VP15，VP28的表達(dá)，結(jié)合前期研究結(jié)果，表明Fortilin通過Ca2+信號(hào)和轉(zhuǎn)錄控制干擾WSSV増殖。但是，ロ服重組Fortilin組對(duì)蝦攻毒后存活率僅為10%。藥物注射費(fèi)時(shí)費(fèi)力，顯然不適用于大規(guī)模對(duì)蝦養(yǎng)殖，那么如何提高ロ服效用，以方便的飼用方式應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)是亟待解決的問題。Fortilin蛋白具有重要的抗病毒作用，但其ロ服利用效率差難以應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)，這也是活性蛋白和多肽應(yīng)用普遍面臨的問題。因此，本發(fā)明從養(yǎng)殖應(yīng)用出發(fā)，著眼于提高蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)效率，以細(xì)胞穿膜肽引導(dǎo)Fortilin跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)以酵母作為運(yùn)載體系，為蛋白應(yīng)用尋找ー種新的方便有效的方式。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種重組凡納濱對(duì)蝦Fortilin蛋白及酵母轉(zhuǎn)化體，即對(duì)凡納濱對(duì)奸的Fortilin蛋白進(jìn)行改造,并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、分泌表達(dá)，可提高對(duì)奸機(jī)體免疫力，方便的應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中白斑病毒的防治，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明ー個(gè)方面涉及ー種重組凡納濱對(duì)蝦Forti I in蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO:I 或 SEQ ID NO:3。其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4。本發(fā)明另ー個(gè)方面涉及用于表達(dá)重組凡納濱對(duì)蝦Fortilin蛋白的酵母轉(zhuǎn)化體，一種轉(zhuǎn)化體，為巴斯德畢赤酵母X-33/pGAPZ a A-FT (Pichia Pastoris Χ-33/pGAPZ a A-FT),已于2012年4月5日保藏于位于湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012097。
上述的酵母轉(zhuǎn)化體在制備凡納濱對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。一種凡納濱對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑，是將巴斯德畢赤酵母X-33/pGAPZ a A-FT的發(fā)酵上清液凍干制備的。本發(fā)明以PCR的方法構(gòu)建Fortilin和TAT的融合基因，并借助重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A-TF和pGAPZ a A-FT將融合基因整合到畢赤酵母Χ_33的染色體上，有效地避免了外源基因的丟失。同時(shí)，該載體上具有抗性篩選標(biāo)記基因，組成型啟動(dòng)子以及α-因子信號(hào)肽序列，可以方便的進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選、進(jìn)行組成型表達(dá)及引導(dǎo)重組蛋白的分泌表達(dá)。另外，畢赤酵母自身分泌蛋白少，具有真核生物翻譯后修飾功能，這些特點(diǎn)利于重組蛋白的表達(dá)和使其具有生物活性。并且，畢赤酵母便于進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，適于大規(guī)模生產(chǎn)。該系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白可以酵母表達(dá)上清凍干粉形式作為添加劑用于對(duì)蝦養(yǎng)殖中，有效提高對(duì)蝦免疫，增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)白斑病病毒的抵抗力。
圖I :本發(fā)明的細(xì)胞膜穿透性重組凡納濱對(duì)奸TAT-Fortilin和Fortilin-TAT表達(dá)載體構(gòu)建過程示意圖；圖2 :凡納濱對(duì)蝦Fortilin基因凝膠電泳圖，其中I :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，2 Fortilin基因PCR產(chǎn)物；圖3 :細(xì)胞膜穿透性重組凡納濱對(duì)蝦TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖，其中泳道M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);泳道1，2 =TAT-Fortilin ;泳道3,4 =Fortilin-TAT ；圖4 :細(xì)胞膜穿透性重組凡納濱對(duì)奸TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳，M是蛋白分子量，泳道I是重組酵母X-33/pGAPZ a A-TF表達(dá)產(chǎn)物，箭頭所示為TAT-Fortilin融合蛋白，泳道2是重組酵母X-33/pGAPZ a A-FT表達(dá)產(chǎn)物，箭頭所示為Fortilin-ΤΑΤ融合蛋白，NC是陰性對(duì)照X-33/pGAPZ a A ；圖5 白斑病病毒W(wǎng)SSV攻毒后凡納濱對(duì)蝦累積死亡率統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)ー步解釋本發(fā)明，但還可以按本領(lǐng)域的其它類似方法來完成本發(fā)明實(shí)施例中記載的內(nèi)容。實(shí)施例I凡納濱對(duì)蝦TAT-Fortilin或者Fortilin-ΤΑΤ融合基因的克隆 提取凡納濱對(duì)蝦肝胰腺總RNA后，以01 igo dT引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)GenBank中凡納濱對(duì)奸Fonilin基因序列(GenBank ID DQ231062)設(shè)計(jì)引物，并引入TAT基因序列，同時(shí)依據(jù)pGAPZ a A載體上的酶切位點(diǎn)以及Fortilin基因序列的酶切特性，分別在正向引物中引入限制性內(nèi)切酶EcoR I識(shí)別位點(diǎn)(GAATTC)，在反向引物引入限制性內(nèi)切酶肋Xba I識(shí)別位點(diǎn)(TCTAGA)。TAT-Fortilin基因擴(kuò)增引物如下上游引物TF-F CCG-GAATTC ATG TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACACCGACGAAGA AAGGTCTTCAAGGACATGCTCAC,下游引物TF-R :GC TCTAGA TTATAGCTTCTCCTCTGTTAGACCGTATTTTGG ；Fortilin-ΤΑΤ基因擴(kuò)增引物上游引物FT-F CCG -GAATTC ATGAAGGTCTTCAAGGACATGCTCACAGGT，下游引物FT-R :Ge ic γα(；α TCA rcTrccTCCcrarcTCCCcrrcnccrccc^
TAGCTTCTCCTCTGTTAGACCGT ；斜體部分序列為TAT序列，引物粗體加下劃線部分序列分別為EcoR I、Xba I酶切識(shí)別位點(diǎn)，且在酶切位點(diǎn)前弓I入保護(hù)堿基。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s、57. 5°C退火 30s、72°C延伸 lmin，32 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin。細(xì)胞膜穿透性重組凡納濱對(duì)蝦TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳鑒定見圖3，540bp位置有一明亮的擴(kuò)增譜帯，與目的基因的分子量相符，DNA序列測定結(jié)果顯示序列與目的基因完全相符，表明已成功獲得這兩個(gè)基因。其氨基酸序列分別為SEQ ID NO :1或3，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID NO 2或4。實(shí)施例2重組表達(dá)載體pGAPZ a A-TF和pGAPZ a A-FT的構(gòu)建對(duì)空質(zhì)粒載體pGAPZ a A和上述ΤΑΤ-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行EcoR I和Xba I雙酶切，切膠純化后T4DNA連接酶于16° C連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，在含25yg/mL Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以引物對(duì)pGAP_F和3' AOXl進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆，并選取陽性克隆委托上海博尚生物技術(shù)有限公司測序，確定TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因分別成功克隆進(jìn)pGAPZ a A載體，分別命名為pGAPZ a A-TF 和 pGAPZ a A-FT0引物序列為pGAP-FGTCCCTATTTCAATCAATTGAA,3' AOXl GCAAATGGCATTCTGACATCC 實(shí)施例3表達(dá)TAT-Forti I in和Fortilin-ΤΑΤ蛋白的畢赤酵母重組株的構(gòu)建和鑒
定純化重組質(zhì)粒pGAPZ a A-TF, pGAPZ a A-TF及空質(zhì)粒pGAPZ a A, Bin I酶切使之線性化。參照Irwitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)制備酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞。線性化質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化酵母，涂布Zeocin (100 μ g/mL)抗性YPDS平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取酵母基因組DNA,以引物對(duì)pGAP-F/3' AOXl進(jìn)行PCR鑒定。陽性重組酵母命名為X-33/pGAPZ a A-TF,X-33pGAPZ a A-FT,轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒pGAPZ a A的酵母作為對(duì)照。本發(fā)明獲得了ー個(gè)染色體上帶有Fortilin-ΤΑΤ的巴斯德畢赤酵母X_33/pGAPZ a A-FT (Pichia Pastoris X-33/pGAPZ a A-FT)，多次傳代培養(yǎng)表明攜帶有Fortilin-TAT的重組載體已整合在酵母的染色體上，并能夠高效的表達(dá)重組蛋白，從而克服了轉(zhuǎn)化酵母易丟失轉(zhuǎn)入基因質(zhì)粒的問題。將該酵母于2012年4月5日保藏于位于湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012097。實(shí)施例4利用畢赤酵母基因工程菌株X-33/pGAPZ a A-TF與X_33pGAPZ a A-FT表達(dá)重組融合蛋白TAT-Fortilin和Fortilin-TAT挑取重組酵母單克隆至IOml YPD培養(yǎng)基中，30° C振蕩過夜培養(yǎng)。取0. Iml過夜培養(yǎng)物接種至50ml YPD培養(yǎng)基中，30° C振蕩培養(yǎng)72h。培養(yǎng)物13500r/min離心2min，收集上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。電泳結(jié)果見圖4，對(duì)比空載質(zhì)粒的酵母發(fā)酵上清，重組酵母發(fā)酵上清中明顯存在目的蛋白電泳條帶，表明成功分泌表達(dá)細(xì)胞膜穿透性重組凡納濱對(duì)蝦TAT-Fortilin 和 Fortilin-TAT 融合蛋白。實(shí)施例5飼料添加重組蛋白對(duì)提高凡納濱對(duì)蝦免疫カ及抗WSSV能力作用(I)實(shí)驗(yàn)飼料的制作分別挑取X-33/pGAPZ a A-TF和X-33/pGAPZ a A-FT陽性酵母轉(zhuǎn)化子，小量活化后接種至YPD培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，5000rpm離心5min后，收集酵母表達(dá)上清，10^5mbar, -60°C進(jìn)行真空冷凍干燥。以魚粉、豆柏和花生柏為主要蛋白源，魚油和大豆卵磷脂為主要脂肪源配制凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料。以酵母表達(dá)上清凍干粉形式在基礎(chǔ)飼料中添加100mg/kg重組蛋白TAT-Fortilin、Fortilin-TAT,同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒對(duì)照組。飼料原料經(jīng)粉碎過篩，混合，カロ魚油，加水，擠壓制粒一系列t呆作，并在室溫干媒后，到切成3_長的顆粒。( 2 )實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦為同一批孵化的蝦苗，購于青島寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司。正式實(shí)驗(yàn)前，蝦苗放于室內(nèi)海水系統(tǒng)中暫養(yǎng)，并以實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料飽食投喂，使之逐漸適應(yīng)實(shí)驗(yàn)飼料及實(shí)驗(yàn)設(shè)施。暫養(yǎng)IOd后，挑選個(gè)體大小均勻的健康對(duì)蝦隨機(jī)分配到室內(nèi)海水系統(tǒng)中的27只容積為50L的玻璃缸中進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾蝦，體長5-6cm，體重4. 87±0. 26g。整個(gè)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)持續(xù)20d，投餌量開始時(shí)按對(duì)蝦體重的5%_10%進(jìn)行投喂，然后根據(jù)每天對(duì)蝦的攝食情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每天投喂3次，投喂時(shí)間為6:00，11:00，18:00，投喂2h后吸去殘餌和糞便，每日換水I次，日換水量為2/3 ;飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫24-28°C，鹽度30-32，pH 7. 8-8. 2，溶解氧不低于6. 5mg/L。表I實(shí)驗(yàn)分組及飼料組成
權(quán)利要求
1.ー種重組凡納濱對(duì)蝦Fortilin蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:3。
2.如權(quán)利要求I所述的重組凡納濱對(duì)蝦Fortilin蛋白，其特征在于所述的序列為SEQID NO: I的蛋白，其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
3.如權(quán)利要求I所述的重組凡納濱對(duì)蝦Fortilin蛋白，其特征在于所述的序列為SEQID NO:3的蛋白，其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID N0:4。
4.用于表達(dá)權(quán)利要求I所述重組凡納濱對(duì)奸Fortilin蛋白的酵母轉(zhuǎn)化體。
5.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體，為巴斯德畢赤酵母X-33/pGAPZa A-FT,保藏編號(hào)為CCTCC NO Μ 2012097。
6.權(quán)利要求4所述的酵母轉(zhuǎn)化體在制備凡納濱對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。
7.—種凡納濱對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑，是將權(quán)利要求5所述的巴斯德畢赤酵母Χ-33/pGAPZ a A-FT的發(fā)酵上清液凍干制備的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組凡納濱對(duì)蝦Fortilin蛋白及酵母轉(zhuǎn)化體，是以PCR的方法構(gòu)建Fortilin和TAT的融合基因，并借助重組表達(dá)質(zhì)粒將融合基因整合到畢赤酵母X-33的染色體上，有效地避免了外源基因的丟失。同時(shí)，該載體上具有抗性篩選標(biāo)記基因，組成型啟動(dòng)子以及α-因子信號(hào)肽序列，可以方便的進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選、進(jìn)行組成型表達(dá)及引導(dǎo)重組蛋白的分泌表達(dá)。另外，畢赤酵母自身分泌蛋白少，具有真核生物翻譯后修飾功能，這些特點(diǎn)利于重組蛋白的表達(dá)和使其具有生物活性。并且，畢赤酵母便于進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，適于大規(guī)模生產(chǎn)。該系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白可以酵母表達(dá)上清凍干粉形式作為添加劑用于對(duì)蝦養(yǎng)殖中，有效提高對(duì)蝦免疫，增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)白斑病病毒的抵抗力。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102643338SQ20121014647
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月12日
發(fā)明者周怡, 張文兵, 徐瑋, 麥康森 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)