專利名稱：一種生物毒素的制備方法
一種生物毒素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物領(lǐng)域物質(zhì)的制備方法，尤其涉及一種生物毒素的制備方法。背景技術(shù)：
農(nóng)作物生長過程受到害蟲的危害，農(nóng)藥的防治是豐收的重要措施。無論是化學(xué)農(nóng)藥還是生物農(nóng)藥，害蟲對之都能產(chǎn)生抗藥性。其發(fā)展速度之快，要求在研究上能提供對農(nóng)藥特別是生物農(nóng)藥進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造的方法，對付抗藥性的發(fā)展，以擴(kuò)大殺蟲譜和提高殺蟲效果。害蟲對農(nóng)藥抗藥性就是克服農(nóng)藥位點(diǎn)作用，使之失效、鈍化。在實(shí)際應(yīng)用中，農(nóng)藥輪換施用、農(nóng)藥混配施用、增加農(nóng)藥對害蟲的接觸面積、培育害蟲的敏感品系、增加生態(tài)多樣性以增加害蟲的多樣性等等，實(shí)質(zhì)上是使農(nóng)藥作用位點(diǎn)保持足夠的敏感性，尋求克服抗性的手段。每一種農(nóng)藥對害蟲都有一個主要作用位點(diǎn)，每一種害蟲都存在多個農(nóng)藥作用位點(diǎn)。害蟲對含有單一作用位點(diǎn)的農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性比含有多個作用位點(diǎn)的農(nóng)藥容易的多。兩個以上作用位點(diǎn)的農(nóng)藥稱之為多位點(diǎn)殺蟲毒素，多位點(diǎn)殺蟲毒素的研究是克服害蟲抗藥性 的有效途徑。生物藕合技術(shù)是形成多位點(diǎn)殺蟲毒素的有效方法，可以應(yīng)用生物藕合技術(shù)，將兩個殺蟲毒素聯(lián)結(jié)，或增加一個或多個基團(tuán)，解除害蟲的抗藥性，為農(nóng)藥及其生物農(nóng)藥克服害蟲的抗藥性提供了有力的武器，生物藕合技術(shù)在多位點(diǎn)殺蟲毒素的構(gòu)建上顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。蘇云金桿菌(Bacilus thuringiensis,簡稱Bt)是目前世界上生產(chǎn)量最大、應(yīng)用最為廣泛的一類微生物殺蟲劑，其晶體蛋白對570余種鱗翅目害蟲及雙翅目、膜翅目和鞘翅目等數(shù)十種害蟲有致病性。一般認(rèn)為，昆蟲在取食晶體蛋白后，通過自身的中腸蛋白酶將其酶解為活性的毒素蛋白，毒素蛋白再和中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜(BBMVs)上的受體結(jié)合，并進(jìn)一步插入膜內(nèi)，形成孔洞或離子通道，引起離子滲漏，破壞腸壁上皮細(xì)胞，使腸道內(nèi)溶物滲入血腔，引起敗血癥；雖然蘇云金桿菌應(yīng)用廣泛，但其殺蟲效果并不太理想。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種生物毒素的制備方法，以獲得更好殺蟲效果的生物毒素。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的一種生物毒素的制備方法，其操作如下通過將蘇云金芽孢桿菌菌種活化、發(fā)酵培養(yǎng)并裂解、離心純化以提取蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿維菌素c4"-oh處構(gòu)建含有羧基的間隔臂；之后在交聯(lián)劑EDC、NHS的共同作用下，C4--OH處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素與蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白相藕合，藕合合成的產(chǎn)物通過超濾離心純化即得所述的生物毒素。進(jìn)一步地，所述提取蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的具體操作如下步驟110 :取蘇云金芽孢桿菌菌種并將其接種于LB固體培養(yǎng)基上，且將LB固體培養(yǎng)基置于30°C的恒溫下培養(yǎng)24h以進(jìn)行菌種活化；
步驟120 :之后挑取一環(huán)步驟110中活化后的菌種并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，且將其置于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180r/min，溫度設(shè)定為30°C，并用孔雀綠和番紅液進(jìn)行芽胞染色觀察發(fā)酵培養(yǎng)情況，待觀察到LB液體培養(yǎng)基中有芽孢產(chǎn)生則結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液置于4°C、10000 X g條件下離心lOmin，離心結(jié)束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重懸于Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解2h，將裂解后的溶液置于4°C、10000 X g離心30min,取上清液；步驟130 :用4mol/L HAc-NaAc將步驟120最終取得的上清液的pH值調(diào)至5. 0后于4°C下靜置過夜，將靜置后的溶液置于4°C、10000 X g離心30min，取該離心獲得的沉淀并用水洗滌3次，取水洗后的沉淀并將其冷凍干燥得純化的蘇云金芽孢桿菌晶體即蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白，將獲得的蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白置于_20°C下保存?zhèn)溆?。進(jìn)一步地，所述阿維菌素c4"-oh處構(gòu)建含羧基的間隔臂的具體操作如下
步驟210 :在反應(yīng)瓶中加入6. Ig阿維菌素、5ml無水四氫呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后將反應(yīng)瓶置于25°C下避光攪拌反應(yīng)，并通過薄層層析觀察反應(yīng)過程，當(dāng)觀察到反應(yīng)中有新的產(chǎn)物點(diǎn)產(chǎn)生且原料點(diǎn)消失時則確定反應(yīng)終點(diǎn)，此時將反應(yīng)瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水終止該反應(yīng)；步驟220 :接著取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水對步驟10已終止反應(yīng)的反應(yīng)瓶中的溶液進(jìn)行萃取，取有機(jī)層，并將水層采用乙醚萃取4次，且每次水層萃取中乙醚的用量均為60ml ；步驟230 :合并步驟220獲得的有機(jī)層并用水洗滌3次，每次洗滌用水量為60ml，加入無水硫酸鈉干燥，然后再通過真空干燥濃縮得粗產(chǎn)品；步驟240 :用硅膠柱純化該粗產(chǎn)品以獲得中間產(chǎn)物I，該純化過程采用的淋洗劑為二氯甲烷與四氫呋喃的混合液，該混合液中二氯甲烷與四氫呋喃的體積比為95:5 ；步驟250 :之后按摩爾質(zhì)量比9:1:4分別稱取丁二酸酐、中間產(chǎn)物I及催化劑三乙胺并溶解于無水四氫呋喃，常溫、避光反應(yīng)4h，且通過薄層層析檢測，當(dāng)有新的產(chǎn)物點(diǎn)產(chǎn)生時則確定反應(yīng)終點(diǎn)；步驟260 :用水和乙酸乙酯萃取步驟250所獲得的溶液,取有機(jī)層并采用無水硫酸鈉干燥，接著利用硅膠柱純化干燥后的物質(zhì)得中間產(chǎn)物2，該純化過程采用的淋洗劑為二氯甲烷與乙酸乙酯的混合液，該混合液中二氯甲烷與乙酸乙酯的體積比為2:1 ;步驟270 :取0.3g中間產(chǎn)物2置于反應(yīng)瓶中，并加入17ml甲醇，室溫下攪拌反應(yīng)瓶中溶液且邊攪拌邊逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的對甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后繼續(xù)攪拌反應(yīng)25min，攪拌結(jié)束后采用乙酸乙酯和水對該反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行萃取，收集有機(jī)層并依次進(jìn)行無水硫酸鈉脫水、真空干燥、及過硅膠柱分離，最終獲得4”-O-琥珀酰阿維菌素即阿維菌素C4"-OH處的羧基間隔臂得以構(gòu)建。進(jìn)一步地，所述藕合合成的具體操作如下先取適量蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白配置含lmg/ml蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的Na2CO3緩沖液，該Na2CO3緩沖液的PH值為10、物質(zhì)的量濃度為0. 2mol/L ;接著取0. 5mol提取獲得的C4"_0H處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素，采用IOml N，N-二甲基甲酰胺對其溶解，并依次加入0. 25mol NHS和0.25mol EDC,且在室溫下攪拌1(T12小時以獲得反應(yīng)液；之后取該反應(yīng)液60ml并在Ih內(nèi)逐滴加至配置好的含lmg/ml蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的Na2CO3緩沖液中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌lh，然后轉(zhuǎn)至4°C下再攪拌1(T12小時，攪拌后獲得的產(chǎn)物經(jīng)超濾離心純化即得所述生物毒素，將獲得的該生物毒素置于_20°C凍存。進(jìn)一步地，所述步驟110中LB固體培養(yǎng)基的配置過程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉IOg及瓊脂15g加水定容至1L，然后將定容后的溶液進(jìn)行高壓滅菌。進(jìn)一步地，所述步驟120中Na2CO3裂解液的pH值為10 ;且每升該Na2CO3裂解液中含 5OmmoI Na2C03、50mmol EDTA、及 30mL 疏基乙醇。本發(fā)明一種生物毒素的制備方法的有益效果在于將蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白與c4〃-oh處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素相藕合以獲得一種新的生物毒素，該生物毒素與蘇云金芽孢桿菌的殺蟲效果相比，其對小菜蛾具有更好的殺蟲效果，對防治農(nóng)業(yè)害蟲上具有很好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式本發(fā)明一種生物毒素的制備方法，通過將蘇云金芽孢桿菌菌種活化、發(fā)酵培養(yǎng)并裂解、離心純化以提取蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿維菌素C4〃-0H處構(gòu)建含有羧基的間隔臂；之后在交聯(lián)劑EDC、N-羥基琥珀酰亞胺(即NHS)的共同作用下，C4〃-0H處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素與蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白相藕合，藕合合成的產(chǎn)物通過超濾離心純化即得所述的生物毒素。在本發(fā)明中阿維菌素的結(jié)構(gòu)中不具有在溫和條件下可直接與蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白結(jié)合的活性基團(tuán)，如-COOH或NH2;但阿維菌素中存在3個可供衍生化的羥基C4〃-0H，C5-OH,C7-OH,因此，可采用琥珀酸酐法構(gòu)建含有羧基的間隔臂以進(jìn)行反應(yīng)；而選擇在C4"-0H處構(gòu)建含羧基的間隔臂的原因如下一方面，根據(jù)Springer等人用計算機(jī)模擬出的阿維菌素的優(yōu)勢構(gòu)象可知，其大環(huán)內(nèi)脂部分為剛性的的近平面結(jié)構(gòu)，而彎曲的雙糖鏈恰似一個“勺柄”，采用C4"-0H與蘇云金芽孢桿菌相連接能最大程度地保持并突出阿維菌素的優(yōu)勢構(gòu)象；另一方面，根據(jù)阿維菌素構(gòu)效關(guān)系研究的成果表明，阿維菌素的非糖部分對保持阿維菌素的抗蟲活性最重要，因此對C4〃-0H的改造能較好的保持阿維菌素的生物活性，故在C4"-0H構(gòu)建含有羧基的間隔臂。在交聯(lián)劑的選擇時，EDC能有效地活化阿維菌素的羧基形成活性酯中間體，能增強(qiáng)阿維菌素與蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的藕合；但EDC形成的活性酯中間體在水溶液中會被快速水解，而NHS的加入能夠延長EDC活性酯中間體的半衰期及穩(wěn)定性；因此，通過NHS聯(lián)合EDC將C4〃-0H處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素的羧基固定在蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白上。一、制備所述生物毒素(I)提取蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白步驟110 :取蘇云金芽孢桿菌菌種并將其接種于LB固體培養(yǎng)基上，且將LB固體培養(yǎng)基置于30°C的恒溫下培養(yǎng)24h以進(jìn)行菌種活化；步驟120 :之后挑取一環(huán)步驟110中活化后的菌種并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，且將其置于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180r/min，溫度設(shè)定為30°C，并用孔雀綠和番紅液進(jìn)行芽胞染色觀察發(fā)酵培養(yǎng)情況，待觀察到LB液體培養(yǎng)基中有芽孢產(chǎn)生則結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液置于4°C、10000Xg條件下離心lOmin，離心結(jié)束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并L Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解此，將裂解后的溶液置于4°C、10000 X g離心30min,取上清液；步驟130 :用4mol/L HAc-NaAc將步驟120最終取得的上清液的pH值調(diào)至5. 0后于4°C下靜置過夜，將靜置后的溶液置于4°C、10000 X g離心30min，取該離心獲得的沉淀并用水洗滌3次，取水洗后的沉淀并將其冷凍干燥得純化的蘇云金芽孢桿菌晶體即蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白，將獲得的蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白置于_20°C下保存?zhèn)溆?。其中LB固體培養(yǎng)基的配置過程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉IOg及瓊脂15g加水定容至1L，然后將定容后的溶液進(jìn)行高壓滅菌；所采用的Na2CO3S解液的pH值為10 ;且每升該Na2CO3裂解液中含50mmol Na2CO3>50mmoI EDTA、及30mL巰基乙醇。(2)在阿維菌素C4〃-0H處構(gòu)建含羧酸的間隔臂
步驟210 :在反應(yīng)瓶中加入6. Ig阿維菌素、5ml無水四氫呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后將反應(yīng)瓶置于25°C下避光攪拌反應(yīng)，并通過薄層層析觀察反應(yīng)過程，當(dāng)觀察到反應(yīng)中有新的產(chǎn)物點(diǎn)產(chǎn)生且原料點(diǎn)消失時則確定反應(yīng)終點(diǎn)，此時將反應(yīng)瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水終止該反應(yīng)；步驟220 :接著取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水對步驟10已終止反應(yīng)的反應(yīng)瓶中的溶液進(jìn)行萃取，取有機(jī)層，并將水層采用乙醚萃取4次，且每次水層萃取中乙醚的用量均為60ml ；步驟230 :合并步驟220獲得的有機(jī)層并用水洗滌3次，每次洗滌用水量為60ml，加入無水硫酸鈉干燥，然后再通過真空干燥濃縮得粗產(chǎn)品；步驟240 :用硅膠柱純化該粗產(chǎn)品以獲得中間產(chǎn)物I，該純化過程采用的淋洗劑為二氯甲烷與四氫呋喃的混合液，該混合液中二氯甲烷與四氫呋喃的體積比為95:5 ；步驟250 :之后按摩爾質(zhì)量比9:1:4分別稱取丁二酸酐、中間產(chǎn)物I及催化劑三乙胺并溶解于無水四氫呋喃，常溫、避光反應(yīng)4h，且通過薄層層析檢測，當(dāng)有新的產(chǎn)物點(diǎn)產(chǎn)生時則確定反應(yīng)終點(diǎn)；步驟260 :用水和乙酸乙酯萃取步驟250所獲得的溶液,取有機(jī)層并采用無水硫酸鈉干燥，接著利用硅膠柱純化干燥后的物質(zhì)得中間產(chǎn)物2，該純化過程采用的淋洗劑為二氯甲烷與乙酸乙酯的混合液，該混合液中二氯甲烷與乙酸乙酯的體積比為2:1 ;步驟270 :取0.3g中間產(chǎn)物2置于反應(yīng)瓶中，并加入17ml甲醇，室溫下攪拌反應(yīng)瓶中溶液且邊攪拌邊逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的對甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后繼續(xù)攪拌反應(yīng)25min，攪拌結(jié)束后采用乙酸乙酯和水對該反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行萃取，收集有機(jī)層并依次進(jìn)行無水硫酸鈉脫水、真空干燥、及過硅膠柱分離，最終獲得4"-0_琥珀酰阿維菌素即阿維菌素C4"-0H處的羧基間隔臂得以構(gòu)建。(3)藕合合成的操作先取適量蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白配置含lmg/ml蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的Na2CO3緩沖液，該Na2CO3緩沖液的PH值為10、物質(zhì)的量濃度為0. 2mol/L ;接著取0. 5mol提取獲得的C4"-0H處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素，采用IOml N，N-二甲基甲酰胺對其溶解，并依次加入0. 25mol NHS和0. 25mol EDC,且在室溫下攪拌10 12小時以獲得反應(yīng)液；之后取該反應(yīng)液60ml并在Ih內(nèi)逐滴加至配置好的含lmg/ml蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的Na2C03緩沖液中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌lh，然后轉(zhuǎn)至4°C下再攪拌l(Tl2小時，攪拌后獲得的產(chǎn)物經(jīng)超濾離心純化即得所述生物毒素，將獲得的該生物毒素置于_20°C凍存。另外，為了后續(xù)闡述的方便，申請人將該生物毒素命名為BtA。二、所述生物毒素殺蟲毒力的驗證(I)小菜蛾的準(zhǔn)備采集室內(nèi)種群的小菜蛾蛹，羽化，收集成蟲產(chǎn)卵，每24小時收集一次小菜蛾卵，收集的同批的小菜蛾卵在人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)以備LC5tl測定，該人工氣候箱內(nèi)的條件為溫度25°C、相對濕度70%、光周期16 8 (L :D)。
權(quán)利要求
1.ー種生物毒素的制備方法，其特征在于通過將蘇云金芽孢桿菌菌種活化、發(fā)酵培養(yǎng)并裂解、離心純化以提取蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿維菌素C4〃-OH處構(gòu)建含有羧基的間隔臂；之后在交聯(lián)劑EDC、NHS的共同作用下，C4〃-OH處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素與蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的藕合，藕合產(chǎn)物通過超濾離心純化即得所述的生物毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種生物毒素的制備方法，其特征在于所述提取蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的具體操作如下 步驟110 :取蘇云金芽孢桿菌菌種并將其接種于LB固體培養(yǎng)基上，且將LB固體培養(yǎng)基置于30°C的恒溫下培養(yǎng)24h以進(jìn)行菌種活化； 步驟120 :之后挑取一環(huán)步驟110中活化后的菌種并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，且將其置于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180r/min，溫度設(shè)定為30°C，并用孔雀綠和番紅液進(jìn)行芽胞染色觀察發(fā)酵培養(yǎng)情況，待觀察到LB液體培養(yǎng)基中有芽孢產(chǎn)生則結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液置于4°C、10000 Xg條件下離心lOmin，離心結(jié)束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重懸于Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解2h，將裂解后的溶液置于4°C、10000 X g離心30min,取上清液； 步驟130 :用4mol/L HAc-NaAc將步驟120最終取得的上清液的pH值調(diào)至5. O后于4°C下靜置過夜，將靜置后的溶液置于4°C、10000Xg離心30min，取該離心獲得的沉淀并用水洗滌3次，取水洗后的沉淀并將其冷凍干燥得純化的蘇云金芽孢桿菌晶體即蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白，將獲得的蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白置于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種生物毒素的制備方法，其特征在于所述阿維菌素C4^-OH處構(gòu)建含羧基的間隔臂的具體操作如下 步驟210 :在反應(yīng)瓶中加入6. Ig阿維菌素、5ml無水四氫呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基ニ甲基氯硅烷，之后將反應(yīng)瓶置于25°C下避光攪拌反應(yīng)，并通過薄層層析觀察反應(yīng)過程，當(dāng)觀察到反應(yīng)中有新的產(chǎn)物點(diǎn)產(chǎn)生且原料點(diǎn)消失時則確定反應(yīng)終點(diǎn)，此時將反應(yīng)瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水終止該反應(yīng)； 步驟220 :接著取一分液漏斗，用300mlこ酸こ酯和180ml水對步驟210已終止反應(yīng)的反應(yīng)瓶中的溶液進(jìn)行萃取，取有機(jī)層，并將水層采用こ醚萃取4次，且每次水層萃取中こ醚的用量均為60ml ； 步驟230 :合并步驟220獲得的有機(jī)層并用水洗滌3次，每次洗滌用水量為60ml，加入無水硫酸鈉干燥，然后再通過真空干燥濃縮得粗產(chǎn)品； 步驟240 :用硅膠柱純化該粗產(chǎn)品以獲得中間產(chǎn)物I，該純化過程采用的淋洗劑為ニ氯甲烷與四氫呋喃的混合液，該混合液中二氯甲烷與四氫呋喃的體積比為95:5 ； 步驟250 :之后按摩爾質(zhì)量比9:1:4分別稱取丁ニ酸酐、中間產(chǎn)物I及催化劑三こ胺并溶解于無水四氫呋喃，常溫、避光反應(yīng)4h，且通過薄層層析檢測，當(dāng)有新的產(chǎn)物點(diǎn)產(chǎn)生時則確定反應(yīng)終點(diǎn)； 步驟260 :用水和こ酸こ酯萃取步驟250所獲得的溶液，取有機(jī)層并采用無水硫酸鈉干燥，接著利用硅膠柱純化干燥后的物質(zhì)得中間產(chǎn)物2，該純化過程采用的淋洗劑為ニ氯甲烷與こ酸こ酯的混合液，該混合液中二氯甲烷與こ酸こ酯的體積比為2:1 ; 步驟270 :取O. 3g中間產(chǎn)物2置于反應(yīng)瓶中，并加入17ml甲醇，室溫下攪拌反應(yīng)瓶中溶液且邊攪拌邊逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的對甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后繼續(xù)攪拌反應(yīng)25min，攪拌結(jié)束后采用こ酸こ酯和水對該反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行萃取，收集有機(jī)層并依次進(jìn)行無水硫酸鈉脫水、真空干燥、及過硅膠柱分離，最終獲得4"-0_琥珀酰阿維菌素即阿維菌素C4"-OH處的羧基間隔臂得以構(gòu)建。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種生物毒素的制備方法，其特征在于所述藕合合成的具體操作如下 先取適量蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白配置含lmg/ml蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的Na2CO3緩沖液，該Na2CO3緩沖液的PH值為10、物質(zhì)的量濃度為O. 2mol/L ;接著取O. 5mol提取獲得的C4"-0H處羧基間隔臂得以構(gòu)建的阿維菌素，采用IOml N，N-ニ甲基甲酰胺對其溶解，并依次加入O. 25mol NHS和O. 25mol EDC,且在室溫下攪拌10 12小時以獲得反應(yīng)液；之后取該反應(yīng)液60ml并在Ih內(nèi)逐滴加至配置好的含lmg/ml蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的Na2CO3緩沖液中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌lh，然后轉(zhuǎn)至4°C下再攪拌1(Γ12小時，攪拌后獲得的產(chǎn)物經(jīng)超濾離心純化即得所述生物毒素BtA，將獲得的該生物毒素置于-20°C凍存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種生物毒素的制備方法，其特征在于所述步驟110中LB固體培養(yǎng)基的配置過程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉IOg及瓊脂15g加水定容至1L，然后將定容后的溶液進(jìn)行高壓滅菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種生物毒素的制備方法，其特征在于所述步驟120中Na2CO3裂解液的pH值為10 ;且每升該Na2CO3裂解液中含50mmoINa2CO3、50mmoI EDTA、及30mL巰基こ醇。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物毒素的制備方法，通過將蘇云金芽孢桿菌菌種活化、發(fā)酵培養(yǎng)并裂解、離心純化蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿維菌素C4"-OH處構(gòu)建含有羧基的間隔臂；之后在交聯(lián)劑EDC、NHS的共同作用下，實(shí)現(xiàn)阿維菌素與蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的藕合，藕合產(chǎn)物通過超濾離心純化即得所述的生物毒素。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于獲得一種具有更好殺蟲效果的生物毒素，在防治農(nóng)業(yè)害蟲上具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P21/00GK102675411SQ201210140220
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日 公開號201210140220.發(fā)明者劉波, 劉蕓, 唐建陽, 朱育菁, 潘志針, 阮傳清 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所