專利名稱：一種高產(chǎn)γ-氨基丁酸的發(fā)酵乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的天然菌株，特別一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的發(fā)酵乳桿菌。
背景技術(shù)：
y -氨基丁酸(Y -aminobutyric acid,簡稱GABA)，又稱4-氨基丁酸、氨酪酸，是一種在自然界中廣泛存在并具有重要的生理功能的非蛋白類氨基酸。在人體中GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中三大抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，具有緩解焦慮、降低血壓、安眠鎮(zhèn)定等生理功效，因此在醫(yī)療保健方面應(yīng)用廣泛。
2009年9月27日，根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部第十二號令，以L-谷氨酸鈉為原料經(jīng)希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)發(fā)酵、加熱殺菌、冷卻、活性炭處理、過濾、加入調(diào)配輔料(淀粉)、噴霧干燥等步驟生產(chǎn)而成的GABA，可添加到飲料、可可制品、巧克力和巧克力制品、糖果、焙烤食品、膨化食品等中。飼料級及食品級GABA的成品要求純度在20%以上，但因GABA高純度提取在技術(shù)還不夠成熟，純化成本較高，因此，尋求高產(chǎn)GABA的乳酸菌在降低GABA的工業(yè)生產(chǎn)成本，在食品中的推廣使用將具有非常重要的意義。目前，GABA的生產(chǎn)方法可分為化學(xué)合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法雖然純度較高，但是反應(yīng)需高溫高壓條件，能耗大，成本高，得率較低，并且在生產(chǎn)工藝中涉及到了有毒有害有機(jī)溶劑的使用，安全性差，是非天然的GABA，不能用作食品及飼料添加劑。生物法又包括植物富集和微生物發(fā)酵兩種，植物富集法主要是從茶葉、稻米、米糠中對GABA進(jìn)行富集提取，此法雖然取材廣泛，但是生產(chǎn)周期長，得率也較低，一般為O. l-3mg/go而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA不受原料、環(huán)境和空間的限制，且條件溫和，安全性好，設(shè)備要求相對簡單，因此在三種方法中具有明顯的優(yōu)勢。此外，乳酸菌被認(rèn)為是安全的食品級生產(chǎn)菌株，乳酸菌以其生產(chǎn)GABA安全性佳，且產(chǎn)生的GABA不被降解的特點(diǎn)，在開發(fā)功能性食品具有巨大潛力。發(fā)酵法生產(chǎn)GABA主要是利用微生物自身的谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase, GAD, EC 4. I. I. 15),催化谷氨酸或谷氨酸鈉發(fā)生脫羧反應(yīng)生成Y-氨基丁酸。近年來，隨著人們對食品安全重視，越來越多的研究開始聚焦于利用乳酸菌生產(chǎn)GABA上，目前，已篩選出多個(gè)屬種的具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的GABA產(chǎn)生菌，如短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantanrum)、乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)、乳酸鏈球菌(Sreptococcus lactis)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)等，但迄今為止尚未從自然界中發(fā)現(xiàn)具有工業(yè)化生產(chǎn)GABA潛力的發(fā)酵乳桿菌。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)MT133，于2011年11月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2011370，保藏地址為中國武漢大學(xué)。所述發(fā)酵乳桿菌CCTCC M 2011370，為Y -氨基丁酸高產(chǎn)菌，從無錫香腸中分離得到，為兼性厭氧型，在MRS固體培養(yǎng)基30 V有氧培養(yǎng)72h后，菌落扁平、中心有白色突起、邊緣透明且不整齊，直徑約l_3mm，革蘭氏染色呈陽性，桿菌，大小可變，有時(shí)成對出現(xiàn)，經(jīng)16SrDNA鑒定為發(fā)酵乳桿菌。本發(fā)明中的MRS培養(yǎng)基是l%(w/v，下同)蛋白胨，O. 5%酵母提取物，1%牛肉浸膏，2%葡萄糖，O. 3%無水乙酸鈉，O. 2%檸檬酸三銨，O. 2%磷酸氫二鉀，O. 01%無水硫酸鎂，O. 025%一水硫酸錳，O. 1%吐溫80，pH6. 8。本發(fā)明中的MRS固體培養(yǎng)基是在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加I. 5-2. 0%瓊脂。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法。將保藏于MRS瓊脂平板的發(fā)酵乳桿菌，經(jīng)于MRS液體培養(yǎng)基活化后，以1%_10%接 種量進(jìn)行搖瓶或靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，溫度設(shè)定為30°C。本發(fā)明中的靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，8% —水合谷氨酸鈉，O. 3%無水乙酸鈉，O. 2%檸檬酸三銨，O. 2%磷酸氫二鉀，O. 01%無水硫酸鎂，
O.025% 一水硫酸錳，O. 1%吐溫80。本發(fā)明中的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基是1%蛋白胨，O. 5%酵母提取物，1%牛肉浸膏，2%葡萄糖，5% 一水合谷氨酸鈉，O. 3%無水乙酸鈉，O. 2%檸檬酸三銨，O. 2%磷酸氫二鉀，O. 01%無水硫酸鎂，O. 025% 一水硫酸錳，O. 1%吐溫80。本發(fā)明還提供了一種優(yōu)化的發(fā)酵策略，菌種經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，以10%的接種量接種于上罐發(fā)酵培養(yǎng)基，初始裝液量1.5L，轉(zhuǎn)速60rpm，無空氣通入，30°C發(fā)酵96h,于40h和70h分別補(bǔ)加IOOml 80%和150ml 60% 一水合谷氨酸鈉，在發(fā)酵24h至96h每4h流加75%葡萄糖和由18%酵母提取物和9%大豆蛋白胨組成的有機(jī)氮源10-15ml ;培養(yǎng)基配方為1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，6. 6%—水合谷氨酸鈉，O. 3%無水乙酸鈉，O. 2%檸檬酸三銨，O. 2%磷酸氫二鉀，O. 01%無水硫酸鎂，O. 025%—水硫酸錳，O. 1%吐溫80。本發(fā)明所提供了一種發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum CCTCC M 2011370，是一株從發(fā)酵香腸中分得到的天然菌株，經(jīng)初步優(yōu)化后，其Y-氨基丁酸的產(chǎn)量約為38g/1，在本人知識范圍內(nèi)，這是目前乳酸菌產(chǎn)Y-氨基丁酸非罐上發(fā)酵的最高產(chǎn)量。此外，在上罐發(fā)酵中采取流加葡萄糖和有機(jī)氮源的策略可使產(chǎn)量達(dá)到75g/l。該菌高產(chǎn)Y-氨基丁酸的能力、對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件良好的適應(yīng)性以及其天然菌株的來源等特性，賦予它良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I高產(chǎn)Y -氨基丁酸的發(fā)酵乳桿菌的篩選方法將保藏于MRS瓊脂平板的乳酸菌，經(jīng)于MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，接種于含有1%谷氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)72h，取1-2 μ I發(fā)酵液，用紙層析法對Y-氨基丁酸產(chǎn)生菌進(jìn)行初步篩選。本發(fā)明中用于紙層析的展層劑是V(正丁醇)V(冰醋酸)V(水)=4:2:1，及O. 4%茚三酮。以5%的Y-氨基丁酸和5%的谷氨酸溶液作為對照。層析時(shí)間為4-6h，層析結(jié)束后將濾紙烘干看發(fā)酵液是否在Y-氨基丁酸標(biāo)樣對應(yīng)位點(diǎn)處顯現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn)。根據(jù)初步篩選結(jié)果，在添加1%的谷氨酸的MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵72h，使用HPLC測定Y-氨基丁酸的含量，進(jìn)行復(fù)篩。在復(fù)篩中，L. fermentum CCTCC M 2011370顯示出高產(chǎn)
Y-氨基丁酸的能力，在添加1%的谷氨酸的情況下，谷氨酸幾乎完全轉(zhuǎn)化，Y -氨基丁酸的產(chǎn)量可達(dá)6. 12g/l。HPLC測定Y-氨基丁酸的具體方法如下將發(fā)酵液混勻，以5% (w/v)的三氯乙酸水溶液稀釋25倍，并于4°C沉淀2h以上，IOOOOg離心IOmin后，采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化-HPLC法精確測定發(fā)酵液中GABA的含量。色譜條件如下流動(dòng)相由流動(dòng)相A與流動(dòng)動(dòng)相B按體積比92:8組成。其中，流動(dòng)相A為醋酸鈉3. 01g/L,四氫呋喃5mL/L，三乙胺200 μ L，ρΗ=7. 20 ;流動(dòng)相B為醋酸鈉3. 01g/L,乙腈與甲醇各含400mL/L，水200mL/L, pH=7. 20,柱溫 40°C，流速為 I. OmT,/mi η ,;檢測柱為 Hypersil ODS (5 μ m, 4. OmmX 250mm),
檢測器為紫外檢測器，檢測波長為338nm。洗脫程序如下表所示
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn) Y -氨基丁酸的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum) MT133,于 2011年11月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M 2011370。
2.權(quán)利要求I所述的發(fā)酵乳桿菌應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵乳桿菌經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，以10%的接種量接種于上罐發(fā)酵培養(yǎng)基，初始裝液量I. 5L，轉(zhuǎn)速60rpm，無空氣通入，30°C發(fā)酵96h，于40h和70h分別補(bǔ)加IOOml 80%和150ml 60% 一水合谷氨酸鈉，在發(fā)酵24h至96h每4h流加75%葡萄糖和由18%酵母提取物和9%大豆蛋白胨組成的有機(jī)氮源10-15ml ;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，6. 6% 一水合谷氨酸鈉，O. 3%無水こ酸鈉，O. 2%檸檬酸三銨，O. 2%磷酸氫ニ鉀，O. 01%無水硫酸鎂，O. 025% 一水硫酸錳，O. 1%吐溫80。
3.權(quán)利要求I所述的發(fā)酵乳桿菌應(yīng)用于靜態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征在于將保藏于MRS瓊脂平板的發(fā)酵乳桿菌，經(jīng)于MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，以10%的接種量接種于靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C靜態(tài)發(fā)酵96h，發(fā)酵液中Y -氨基丁酸的含量約為38g/l。靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，8%—水合谷氨酸鈉，O. 3%無水こ酸鈉，O. 2%檸檬酸三銨，O. 2%磷酸氫ニ鉀，O. 01%無水硫酸鎂，O. 025% 一水硫酸錳，O.1% 吐溫 80。
全文摘要
本發(fā)明所公開了一種發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum CCTCC NO:M2011370，是一株從發(fā)酵香腸中分得到的天然菌株，經(jīng)初步優(yōu)化后，其γ-氨基丁酸的產(chǎn)量約為38g/l，這是目前乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸非罐上發(fā)酵的最高產(chǎn)量。此外，在上罐發(fā)酵中采取流加葡萄糖和有機(jī)氮源的策略可使產(chǎn)量達(dá)到75g/l。該菌高產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力、對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件良好的適應(yīng)性以及其天然菌株的來源等特性，賦予它良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/20GK102839135SQ20121013669
公開日2012年12月26日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者王小元, 趙安琪, 胡曉清, 潘露 申請人:江南大學(xué)