專利名稱：一種新型單寧酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種從海底淤泥宏基因組文庫(kù)中分離篩選到的一個(gè)新型單寧酶基因、異源表達(dá)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在茶飲料的生產(chǎn)過(guò)程中，茶葉的高溫提取液冷卻后會(huì)變渾濁，并產(chǎn)生絮狀沉淀(茶乳酪)，這嚴(yán)重影響了茶飲料的口感和香氣。茶乳酪的形成過(guò)程為溫度較高時(shí)，茶提取液中的茶多酚及其氧化物、咖啡堿、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)等物質(zhì)均以游離態(tài)存在，隨著溫度的降低，茶湯中多酚類(尤其是茶黃素、茶紅素及沒(méi)食子酸酯等)分別與咖啡堿的酮氨基、蛋白質(zhì)的肽基氫鍵結(jié)合形成絡(luò)合物，逐漸發(fā)生凝聚而沉淀下來(lái)。在茶飲料生產(chǎn)過(guò)程中，需要采取物理、化學(xué)或酶處理的方法來(lái)消除茶乳酪或使之形成可溶物。用來(lái)去除“茶乳酪”的方法有物理法、化學(xué)法和酶法。其中，由于酶法較物理法和化學(xué)法具有經(jīng)濟(jì)、高效和無(wú)二次污染等 優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)今的主要研究熱點(diǎn)。近些年來(lái)，利用純培養(yǎng)技術(shù)已從環(huán)境中篩選到能產(chǎn)生單寧酶的微生物，但種類非常有限，主要集中在真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬，并且篩選到的這些微生物酶量極少，酶活性也不高，造成生產(chǎn)成本的增加。于是，有研究者從已篩選到的這些微生物中(如米曲霉和植物乳酸桿菌)克隆單寧酶基因，然后將其在工程菌中表達(dá)。但是，這些重組降解酶的穩(wěn)定性較差，在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。到目前為止，所有的關(guān)于單寧酶的研究都是針對(duì)于環(huán)境中可培養(yǎng)微生物來(lái)展開(kāi)的。我們知道，環(huán)境中蘊(yùn)藏著大量的微生物資源，并且這些微生物中超過(guò)99%的微生物難以通過(guò)傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)的方式進(jìn)行研究，所以，傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)大大的限制了人們對(duì)可產(chǎn)生單寧酶的微生物自愿的利用和開(kāi)發(fā)。宏基因組學(xué)的出現(xiàn)，則解決了這方面的問(wèn)題，因?yàn)樗荛_(kāi)了環(huán)境微生物分離培養(yǎng)的難題，直接從環(huán)境樣品中提取基因組總DNA，建立宏基因組文庫(kù)，進(jìn)而從中篩選新的基因或生物活性物質(zhì)。宏基因組文庫(kù)包含了環(huán)境中所有的(可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的)微生物遺傳信息，因此，在挖掘和利用環(huán)境中那些不可培養(yǎng)微生物資源方面，有著巨大的潛力，已成為當(dāng)前國(guó)際上微生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)。至今國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)通過(guò)該技術(shù)從環(huán)境中成功的篩選到了如淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶、酯酶/脂肪酶等新基因，并且這些酶具有一些新酶學(xué)特性及工業(yè)應(yīng)用潛力。到目前為止，尚未利用宏基因組技術(shù)從環(huán)境中篩選單寧酶基因的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的提供一種新型單寧酶及所述新型單寧酶的cDNA。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述新型單寧酶的宏基因組學(xué)的克隆方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有上述單寧酶cDNA的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種利用上述表達(dá)載體構(gòu)建的重組單寧酶及其制備方法，以及所述重組單寧酶的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，采取的技術(shù)方案為一種新型單寧酶，所述單寧酶的氨基酸序列如如SEQ ID NO. 3所示。一種上述新型單寧酶的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，采取的技術(shù)方案為一種上述新型單寧酶的宏基因組學(xué)克隆方法，包含以下步驟提取南海海洋淤泥總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切處理后，連接到pUC118載體上，電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a中建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)高通量篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第三個(gè)目的，采取的技術(shù)方案為一種包含如上所述的新型單寧酶的cDNA的表達(dá)載體。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第四個(gè)目的，采取的技術(shù)方案為一種重組單寧酶的制備方法，包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重
組單寧酶。優(yōu)選地，上述所述重組單寧酶的制備方法中，所述寄主細(xì)胞是大腸桿菌。優(yōu)選地，所述重組單寧酶的制備方法具體包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的目的片段經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，與pET_28a (+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。優(yōu)選地，上述所述重組單寧酶的制備方法中，所述的IPTG終濃度為0. 4禮，誘導(dǎo)溫度為25°C。一種采用如上所述方法制備得到的重組單寧酶。一種上述所述的重組單寧酶在降解沒(méi)食子酸丙酯、單寧酸、素兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的應(yīng)用。所述重組單寧酶對(duì)兒茶素及其它底物有降解作用。本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明從海底淤泥宏基因組文庫(kù)中篩選到一個(gè)單寧酶基因，通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)其功能研究，發(fā)現(xiàn)該基因在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)，經(jīng)蛋白純化及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，減去融合蛋白，初步確定該單寧酶的分子量約為54kDa。(2)本發(fā)明將SEQ ID NO. I所示的DNA序列克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆子的誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，研究其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下
①在大腸桿菌表達(dá)體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達(dá)。②以沒(méi)食子酸丙酯為底物，測(cè)的重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為30°C，在溫度低于45°C時(shí)較為穩(wěn)定，45°C保溫12h仍保有75%的相對(duì)酶活性；最適反應(yīng)pH為6. 4，在中性或弱酸性條件下保存穩(wěn)定；4M的NaCl對(duì)其酶活性沒(méi)有影響，表現(xiàn)出較高的耐鹽性；測(cè)定金屬離子和生化試劑對(duì)酶活力影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，ImMCa2+, Cd2+和Mg2+對(duì)其酶活性有激活作用，ImM Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Al3+、EDTA、尿素和Triton X-100對(duì)其酶活性沒(méi)有明顯的影響，而ImM Ag+、Cr2+、^ -巰基乙醇、Tween 80和PMSF對(duì)其的酶活性有強(qiáng)烈的抑制作用。(3)本發(fā)明在研究重組單寧酶以0. 5mg/mL沒(méi)食子酸丙酯、單寧酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯為底物的降解作用時(shí)，經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，30°C條件下，經(jīng)過(guò)40min后，單寧酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸和阿魏酸乙酯已經(jīng)完全水解，大約有88%的迷迭香酸被水解。
圖I為本發(fā)明實(shí)施例I中的SDS-PAGE電泳圖。圖I中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量maker，I為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白。圖2為溫度對(duì)重組單寧酶酶活性的影響圖。圖3為溫度對(duì)重組單寧酶穩(wěn)定性的影響圖( 代表25°C ;籲代表35°C ;〇代表450C ;■代表 50°C ;□代表 55°C )。圖4為pH對(duì)重組單寧酶酶活性的影響圖。 圖5為pH對(duì)重組單寧酶穩(wěn)定性的影響圖(■代表pH為5.0 ;A代表pH為6.0 ;口代表pH為7.0 ;〇代表pH為8.0 ; 代表pH為9.0 ; 代表pH為10. 0 ; 代表pH為11. 0)。圖6為NaCl對(duì)Tan410酶活性的影響圖。圖7為沒(méi)食子酸丙酯、單寧酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯降解的HPLC分析圖。
具體實(shí)施例方式為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例I宏基因組文庫(kù)的建立和陽(yáng)性克隆子的獲得、基因克隆與表達(dá)I、基因組DNA的提取(I)取海底淤泥樣品4g，放入50ml無(wú)菌離心管中；(2)加入 13. 5ml DNA 提取液 buffer，37°C，220r/min 搖床震蕩 30min ；(3)加入 I. 5ml 20% SDS ；(4) 65°C水浴2h，期間每隔20min上下輕輕顛倒離心管幾次，混勻；(5)6000父8，4。(離心10111111;(6)取上清，加入等體積的氯仿，上下輕輕顛倒幾次；(7) 16000 X g, 4°C離心 IOmin ;(8)重復(fù)(6)、(7)步驟兩次；(9)取上清，加入0. 6v的異丙醇，輕輕混勻后，室溫放置l_2h ；(10) 16000父8，4。(離心20111111;(11)75%的乙醇洗滌兩次；(12)風(fēng)干后 ddH20 重懸。2、試劑盒法純化DNA :按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3、宏基因組電泳檢測(cè)用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA的純度和質(zhì)量4、酶切基因組總DNA :用限制性內(nèi)切酶BamHI部分酶切總DNA，回收3-lOkb的酶切片段，方法同試劑盒法純化DNA。5、酶切片段的電泳檢測(cè)方法同宏基因組電泳檢測(cè)。6、克隆載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化將回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)載體連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化后與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞混合，冰上放置5min，轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至預(yù)冷的2_電穿孔容器(無(wú)泡)中，對(duì)電穿孔容器進(jìn)行脈沖(2，500V)(檢查時(shí)間常數(shù)，應(yīng)該在4以上)，立即添加900 ii L的LB至電穿孔容器中，37°C，200r/min,震蕩培養(yǎng)45min，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到含有100 U g/mL氨芐青霉素(Amp)，0. 5mM異丙基-P -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和100 UM 5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-Gal)的平板上，平板倒置放入37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-20h。由此構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容量達(dá)96000個(gè)轉(zhuǎn)化子、多樣性好的宏基因組文庫(kù)。7、文庫(kù)篩選和陽(yáng)性克隆子的鑒定(I)單寧酶基因的初步篩選將文庫(kù)中的所有白色轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到含有底物(X-caprylate)篩選培養(yǎng)基上；37°C培養(yǎng)48h后，挑取在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色水解圈的克隆子。(2)單寧酶基因的復(fù)篩挑取在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色水解圈的克隆子，接種到IOml含有100 U g/mLAmp、·
0.5mM IPTG的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min過(guò)夜培養(yǎng)，12000Xg，離心Imin收集菌體，磷酸鹽緩沖液(lOOmM，pH 6.8)洗滌菌體一次，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重新懸浮菌體，超聲波破碎菌體，離心收集上清(粗酶液)用作單寧酶活性的檢測(cè)。取200 ii L粗酶液，加入200 u L 15mM的沒(méi)食子酸丙酯，37°C，水浴5min，接著加入200iiL甲醇繞單寧(0.667%)，37°C放置5min后加入200 u L KOH(0. 5M)，37°C放置5min，能夠使沒(méi)食子酸丙酯溶液由橘黃色變?yōu)樽霞t色的為陽(yáng)性克隆。通過(guò)篩選得到一個(gè)陽(yáng)性克隆子(PUC118-13B)。將陽(yáng)性克隆子的質(zhì)粒送去測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，單寧酶基因的核苷酸序列由1476個(gè)堿基組成，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示，該DNA編碼的多肽，含491個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，將其命名為T(mén)an410。其中SEQ ID NO. 2為SEQID NO. I 和 SEQ ID NO. 3 的對(duì)照?qǐng)D。8、基因片段的克隆根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物F1和F2，引物兩端引入能插入pET-28a(+)載體的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)，引物序列如下Pl :5 ' -CGCGGATCCATGCTGCCCGCCTTCTGCCGC-3 '，下劃線為 BamHI 酶切位點(diǎn)序列；P2 :5 ' -CCCAAGCTTATAAGTCTTGGGTTCGTAGG-3 '，下劃線為 HindIII 酶切位點(diǎn)序列。利用兩條引物，以質(zhì)粒pUC118-13B為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR體系如下
權(quán)利要求
1.一種新型單寧酶，其特征在于，所述單寧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.如權(quán)利要求I所述的新型單寧酶的cDNA，其特征在于，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
3.如權(quán)利要求I所述新型單寧酶的宏基因組學(xué)克隆方法，其特征在于，包含以下步驟提取海洋淤泥總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切處理后，連接到pUC118載體上，電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a中建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)高通量篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。
4.一種包含如權(quán)利要求2所述的新型單寧酶的cDNA的表達(dá)載體。
5.一種重組單寧酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組單寧酶。
6.如權(quán)利要求5所述的重組單寧酶的制備方法，其特征在于，所述寄主細(xì)胞是大腸桿菌。
7.如權(quán)利要求6所述的重組單寧酶的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的目的片段經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7所述的重組單寧酶的制備方法，其特征在于，所述的IPTG終濃度為0. 4mM，誘導(dǎo)溫度為25°C。
9.一種采用如權(quán)利要求5所述方法制備得到的重組單寧酶。
10.如權(quán)利要求9所述的重組單寧酶在降解沒(méi)食子酸丙酯、單寧酸、素兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種新型單寧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；本發(fā)明還公開(kāi)了所述新型單寧酶的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還公開(kāi)了含有上述新型單寧酶cDNA的表達(dá)載體、重組單寧酶及其制備方法，以及所述重組單寧酶在降解沒(méi)食子酸丙酯、單寧酸、素兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的應(yīng)用。所述新型單寧酶及重組單寧酶在大腸桿菌表達(dá)體系中具有高效的可溶性表達(dá)，且該重組單寧酶對(duì)單寧酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯等具有高效降解作用。
文檔編號(hào)C12N9/18GK102719413SQ20121013227
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者劉玉煥, 姚健, 范新炯 申請(qǐng)人:中山大學(xué)