專利名稱：一種爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因Mj-nulg，相關(guān)蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因相關(guān)蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲是一類非常重要的植物寄生線蟲，廣泛分布于世界各地，能侵染超過3000種不同植物。根結(jié)線蟲每年造成大概770億美元的經(jīng)濟(jì)損失，隨著作物復(fù)種指數(shù)的提高和設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，根結(jié)線蟲的發(fā)生和危害將會(huì)不斷的加劇。由于根結(jié)線蟲的根內(nèi)寄生、寄主范圍廣泛的特性以及抗根結(jié)線蟲種質(zhì)資源的缺乏限制了化學(xué)防治、輪作和抗病育種等
防治方法在控制根結(jié)線蟲危害中的應(yīng)用。因此，尋找其他有效的防治根結(jié)線蟲的方法是植物生產(chǎn)所長期面臨的艱巨任務(wù)。RNA干擾技術(shù)(RNAi)的出現(xiàn)使得開發(fā)更為有效的防治根結(jié)線蟲的方法成為可能。RNAi能通過靶向抑制根結(jié)線蟲特定基因功能而限制根結(jié)線蟲侵染、寄生和繁殖因而能高效地減少根結(jié)線蟲的危害而且對(duì)其他非靶標(biāo)生物較為安全。RNAi現(xiàn)象最早在秀麗小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，隨后在植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中都相繼發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。RNAi技術(shù)通過dsRNA特異性的降解靶mRNA，影響或抑制該目的基因功能，從而影響該種生物的生長、發(fā)育、繁殖甚至能殺死該種生物。該技術(shù)相比其他防治方法的最大優(yōu)點(diǎn)是能定向作用于特定的某種(某類)害蟲而不會(huì)影響在該生境中的其他生物。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的使用組織培養(yǎng)方法獲得RNAi轉(zhuǎn)基因植株更加簡單快速，使得我們并不需要通過復(fù)雜的組培方法就可快速獲得抗線蟲植株。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因Mj-nulg。本發(fā)明的另一目的是提供上述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因 的相關(guān)蛋白MJ-NULG。本發(fā)明的又一目的是提供上述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種爪睡根結(jié)線蟲javanica)效應(yīng)基因其核苷酸序列如SEQID NO: 1 3任意一條所示。其中SEQ ID NO: I為全基因序列(包括5’端非編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)、內(nèi)含子和外顯子)，SEQ ID NO: 2為編碼區(qū)序列(包括內(nèi)含子和外顯子)，SEQ ID NO: 3為編碼序列(即cDNA序列，僅為外顯子)。在嚴(yán)格條件下與上述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因 雜交且編碼與爪哇根結(jié)線蟲寄生相關(guān)蛋白的DNA分子，或者與上述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因貧有90%以上同源性且編碼根結(jié)線蟲寄生相關(guān)蛋白的DNA分子，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。所述嚴(yán)格條件為可在0. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
一種爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白MJ-NULG，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，或該氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加并且與爪哇根結(jié)線蟲寄生相關(guān)的衍生蛋白。為了使爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白MJ-NULG便于純化，可以在該序列(SEQ ID N0:4)的氨基末端或羧基末端連接上特定的標(biāo)簽，所述特定標(biāo)簽為5飛個(gè)精氨酸，或2 12個(gè)組氨酸，或如SEQ ID NO: 5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO: 7所示序列。如表I，但不限于表I :
權(quán)利要求
1.一種爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因 ，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:f3任意一條所示。
2.一種爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白MJ-NULG，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
3.在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求I所述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因 雜交且編碼與爪哇根結(jié)線蟲寄生相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.與權(quán)利要求I所述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因 具有90%以上同源性且編碼爪哇根結(jié)線蟲寄生相關(guān)蛋白的DNA分子。
5.一種爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白MJ-NULG，其特征在于在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列 的氨基末端或羧基末端連接有特定標(biāo)簽，所述特定標(biāo)簽為5飛個(gè)精氨酸，或2 12個(gè)組氨酸，或如SEQ ID NO:5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO:7所示序列。
6.—種重組表達(dá)載體,其特征在于由出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求I所述爪睡根結(jié)線蟲效應(yīng)基因 ，或該基因的部分外顯子片段如SEQ ID NO:8 10任一所示序列構(gòu)建而成。
7.—種重組基因表達(dá)盒，其特征在于含有權(quán)利要求I所述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因Mj~nulg0
8.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于含有權(quán)利要求I所述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因
9.一種重組菌，其特征在于含有權(quán)利要求I所述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因
10.權(quán)利要求I所述爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因 在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種爪哇根結(jié)線蟲效應(yīng)基因Mj-nulg，相關(guān)蛋白及應(yīng)用，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的效應(yīng)基因Mj-nulg核苷酸序列如SEQIDNO:1-3所示，其相關(guān)蛋白MJ-NULG的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本發(fā)明用qPCR研究基因在線蟲不同階段表達(dá)情況；用免疫定位方法證明MJ-NULG蛋白在線蟲背食道腺并被分泌到植物細(xì)胞中，定位在細(xì)胞核上；設(shè)計(jì)該基因過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥更易感染根結(jié)線蟲；設(shè)計(jì)病毒誘導(dǎo)重組RNAi載體，將該載體導(dǎo)入植物，在植物中產(chǎn)生Mj-nulg的dsRNA，該植株能顯著抑制根結(jié)線蟲的寄生。通過本發(fā)明可獲得強(qiáng)抗根結(jié)線蟲的植物。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102653763SQ20121012581
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者卓侃, 廖金鈴, 林柏榮 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)