專利名稱：鴨促性腺激素釋放激素受體基因(gnrhr)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)核苷酸序列及基因編碼的氨基酸序列，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國是世界上養(yǎng)鴨數(shù)量、產(chǎn)品消費(fèi)和出口貿(mào)易的第一大國。根據(jù)FAO的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)2006年，我國鴨存欄量超過7. 25億只，占世界總存欄量的69. 28%左右，養(yǎng)鴨業(yè)逐步成為我國經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)中的特色產(chǎn)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是，關(guān)于鴨分子生物學(xué)研究大大落后于鴨育種和生產(chǎn)的發(fā)展，這些成果取得仍然依靠傳統(tǒng)的育種和生產(chǎn)技木。促性腺激素釋放激素受體在動物生殖發(fā)育調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用。促性腺激素釋放激素與垂體中的促性腺激素釋放激素受體結(jié)合，能促進(jìn)促黃體素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成與釋放，促進(jìn)性腺的生長、成熟和調(diào)節(jié)動物的繁殖功能及行為。Ikemoto. T等(2004)報(bào)道，GNRH經(jīng)過和它的特定受體(GNRHR)的交互作用在動物生殖功能活動中扮演ー個(gè)關(guān)鍵性的角色。Kim等(2003)研究表明，抑制動物GNRH及其受體基因的表達(dá)將極大抑制其生殖活動。目前，豬、山羊、雞等動物的促性腺激素釋放激素受體基因序列已陸續(xù)被報(bào)道，它與初產(chǎn)母豬黃體生成數(shù)(Jiang等，2001)、山羊產(chǎn)羔數(shù)(儲明星等，2009)和母雞產(chǎn)雙黃蛋數(shù)(Dunn等，2004)相關(guān)顯著，該基因是提高動物繁殖性能的重要侯選基因。但是鴨促性腺激素釋放激素受體基因還未曾有報(bào)道，極大地制約了鴨分子遺傳育種的研究和生物技術(shù)在鴨生產(chǎn)中的應(yīng)用，影響了養(yǎng)鴨業(yè)地快速發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了利用基因工程技術(shù)加快對鴨繁殖性能的改良，提供鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)核苷酸序列、編碼的氨基酸序列以及獲得該基因序列的引物序列。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，它經(jīng)由以下兩對弓I物GF4 (SEQID No 14)與 GR4(SEQ ID No :15) ；GF5 (SEQID No :16)與 GR5 (SEQID No :17)克隆測序獲得。鴨促性腺激素釋放激素受體基因，在于核苷酸序列SEQ IDNo :1所示。所述的鴨促性腺激素釋放激素受體基因及基因編碼的氨基酸序列SEQ ID No:2所示。所述方法包括下列步驟(1)根據(jù)已知動物GNRHR基因的序列分析該基因結(jié)構(gòu)和保守區(qū)域；(2)根據(jù)Genebank中雞GNRHR基因的序列(nc_006096. 2)和雞chromosome10(NW_001471429. I)的信息，設(shè)計(jì)ー對位于GNRHR基因第2外顯子上的引物GFl和GR1，GFl的序列如SEQ ID No :3，GRl的序列如SEQ ID No 4 ； (3)以鴨基因組DNA為模板，利用引物GFl和GRl擴(kuò)增并克隆測序得到DGl序列121bp，DGl的序列如SEQ ID No 5 ； (4)序列DGl與雞G HR基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)同源性達(dá)92%，判定該段序列為GNRHR基因上的序列；(5)根據(jù)DGl與雞GNRHR基因序列設(shè)計(jì)兩對引物GF2、GR2和GF3、GR3，GF2位于GRHR基因的第一外顯子位置，其序列如SEQ ID No :6，GR3位于GNRHR基因的第三外顯子位置，其序列如SEQID No :7，GR2和GF3均位于GNRHR基因的第二外顯子位置，序列分別如SEQ ID No :8和SEQID No 9 ； (6)以GF2、GR2和GF3、GR3兩對引物擴(kuò)增鴨基因組DNA，分別克隆測序得到DG2和DG3序列，DG2和DG3序列分別如SEQ ID No 10,SEQ ID No 11 ； (7)DG2和DG3序列分別與雞GNRHR基因比對，同源性分別達(dá)到89%、88% ; (8)根據(jù)DG2序列設(shè)計(jì)上游引物GF4，其序列如SEQ ID No : 12，根據(jù)DG3序列設(shè)計(jì)一條下游引物GR4，其序列如SEQ ID No:13，用于擴(kuò)增鴨GNRHR基因大部分全長序列；(9)利用引物GF4和GR4擴(kuò)增鴨基因組DNA，克隆測序獲得鴨GNRHR基因大部分全長序列DG4，其序列如SEQ ID No 14 ； (10)根據(jù)DG3序列設(shè)計(jì)ー條上游引物GF5，其序列如SEQ ID No :15，根據(jù)雞GNRHR基因3’ UTR區(qū)設(shè)計(jì)一條下游引物GR5，其序列如SEQ ID No 16 ；(11)利用引物GF5和GR5擴(kuò)增鴨基因組DNA，克隆測序獲得ー條鴨 GNRHR 基因 3，UTR 區(qū)序列 DG5，其序列如 SEQ ID No 17 ； (12)通過 DNAstar、Bioedit等軟件編輯和拼接，最終獲得GNRHR全長序列。與以往相關(guān)技術(shù)比較，本發(fā)明的完成為進(jìn)一歩深入分析GNRHR基因的功能和其對鴨繁殖性能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制的掲示，為GNRHR基因的應(yīng)用打下基礎(chǔ)，為篩選和培育高產(chǎn)蛋 鴨品種提供分子技術(shù)支持。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I高郵鴨GNRHR基因的克隆和測序I.基因組DNA的提取本發(fā)明中所用的血樣采集自高郵鴨國家資源保種場，利用DNA微量提取試劑盒提取血液中全基因組DNA,具體操作步驟如下I. I將血樣搖勻，取約500至550L血樣到5mL離心管中(折算為5mL離心管中含新鮮禽血約110 μ L，若為2mL離心管則折算后的禽血以40至50 μ L為宜)，6000r/min，離心4min,倒掉上清。I. 2加入約I. 8mL生理鹽水(O. 9% Nacl)輕緩地上下顛倒搖勻，倘若急用，輕柔地?fù)u10 15min ;若不急用，可室溫下放置O. 5h Id,隨后以6000r/min離心3 4min,倒
掉上清。I. 3將260 μ L生理鹽水加入離心管中，搖ー搖，將血細(xì)胞充分懸浮起來，然后加入裂解液[IOOmmoI/L Tris · Cl (ρΗ8. O). 200mmol/L EDTA(pH8. O) ,2% SDS] 1800L，接著加入蛋白酶K至終濃度100ng/mL，蓋緊管子后顛倒搖勻，最后于水浴鍋中55°C消化過夜。I. 4加酚氯仿異戊醇(25 24 l)2mL于試管中，搖勻20min，然后12000r/min離心IOmin,取上清,如此抽提兩遍,然后再用與上清等體積的氯仿異戍醇(24 I)抽提一遍，離心后取上清。I. 5用兩倍體積的無水こ醇沉淀DNA，再用70 %こ醇洗兩遍，晾干，加入適量超純水溶解DNA。2.高郵鴨GNRHR基因的擴(kuò)增和克隆測序2. I高郵鴨GNRHR基因第2外顯子部分序列的的獲得2. I. I引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank 中雞 GNRHR 基因的序列(NC_006096. 2)和雞 chromosome10 (NW_001471429. I)的信息，設(shè)計(jì)ー對位于GNRHR基因第2外顯子上的引物GFl和GRl，GFl的序列如SEQ ID No :3，GRl的序列如SEQ ID No :4。2. I. 2序列測定PCR反應(yīng)體系鴨基因組DNA模板2 μ 1，引物GFl :1μ 1，引物GRl 1μ l,2mM dNTP 2 μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共計(jì)20ul ;反應(yīng)程序94°C預(yù)變性2. 5min ;94°C變性，56°C退火30s ;68°C延伸30S ;25個(gè)循環(huán)，68°C延伸5min。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物克隆測序得到DGl序列121bp，DGl的序列如SEQ ID No 52. I. 3序列同源性比對 DGl序列與雞GNRHR基因(GENE ID :427517)比對，同源性達(dá)到92%，確認(rèn)該部分序列為GNRHR基因序列。2. 2鴨GNRHR基因第1、2、3外顯子序列的獲得2. 2. I引物設(shè)計(jì)根據(jù)DGl與雞GNRHR基因序列設(shè)計(jì)兩對引物GF2、GR2和GF3、GR3，GF2位于GNRHR基因的第一外顯子位置，其序列如SEQ ID No :6，GR3位于GNRHR基因的第三外顯子位置，其序列如SEQ ID No :7，GR2和GF3均位于GNRHR基因的第二外顯子位置，序列分別如SEQ IDNo 8 和 SEQ ID No :9。2. 2. 2序列測定PCR反應(yīng)體系鴨基因組DNA模板2 μ I ;上游引物GF2/GF3 :1 μ I，下游引物GR2/GR3 1μ I ；2mM dNTP :2μ 1，25mM MgS04 :0.8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2μ 1，共計(jì) 20 μ I ;反應(yīng)程序94°C 預(yù)變性 2. 5min ;94°C 變性，56°C 退火 30s ；68°C延伸Imin ；25個(gè)循環(huán)，68°C延伸5min。GF2、GR2和GF3、GR3兩對引物擴(kuò)增鴨基因組DNA，分別克隆測序得到DG2和DG3序列，DG2和DG3序列分別如SEQ ID No :10，SEQ ID No :11。2. 2. 3序列同源性比對 DG2和DG3序列分別與雞GNRHR基因(GENE ID :427517)比對，同源性分別達(dá)到89*%、88*%，確認(rèn)這兩條序列為GNRHR基因序列。2. 3高郵鴨GNRHR基因大部分全長序列的獲得2. 3. I引物設(shè)計(jì)根據(jù)DG2序列設(shè)計(jì)上游引物GF4，其序列如SEQ ID No : 12，根據(jù)DG3序列設(shè)計(jì)一條下游引物GR4，其序列如SEQ ID No : 13，用于擴(kuò)增鴨GNRHR基因大部分全長序列。2. 3. 2序列測定鴨基因組DNA模板2 μ I ;上游引物GF4 :1 μ 1，下游引物GR4 :1 μ I ；2mMdNTP
2μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共計(jì)20 μ I ;反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性2. 5min ;94°C變性，56°C退火30s ;68°C延伸Imin ;25個(gè)循環(huán)，68°C延伸5min。利用引物GF4和GR4擴(kuò)增鴨基因組DNA，克隆測序獲得鴨GNRHR基因I大部分全長序列DG4，其序列如SEQ ID No :14。2. 3. 3序列同源性比對DG4序列與雞GNRHR基因(GENEID :427517)比對，同源性達(dá)到90%，確認(rèn)該部分序列為GNRHR基因序列。2. 4高郵鴨GNRHR基因3’端序列的獲得
2.4.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)DG3-1序列設(shè)計(jì)一條上游引物GF5，其序列如SEQ ID No : 15，根據(jù)雞GNRHR基因3，UTR區(qū)設(shè)計(jì)一條下游引物GR5，其序列如SEQ ID No :16。2. 4. 2序列測定鴨基因組DNA模板2 μ I ;上游引物GF5 :1 μ 1，下游引物GR5 :1 μ I ；2mMdNTP 2 μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共計(jì)20 μ I ;反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性2. 5min ;94°C變性，56°C退火30s ;68°C延伸Imin ;25個(gè)循環(huán)，68°C延伸5min。利用引物GF5和GR5擴(kuò)增鴨基因組DNA，克隆測序獲得一條鴨GNRHR基因3，UTR區(qū)序列DG5，其序列如SEQ ID No :17。2. 4. 3序列同源性比對DG5序列前161bp序列與DG4序列1654bp 1814bp序列一致,通過NCBI在線Blast以及DNAstar、Bioedit等軟件編輯和拼接，最終獲得GNRHR全長序列SEQ ID No :1。實(shí)施例2(I)組織采集采集250日齡及330日齡高產(chǎn)雙黃蛋的高郵鴨(雙黃率3%以上)卵巢組織和單黃蛋高郵鴨卵巢組織各6個(gè)，剪取相同部位的卵巢組織置于凍存管中，-80超低溫冰箱保存。(2)主要儀器和試劑熒光定量PCR儀器為Mx3000P (Stratagene公司)，RNA提取用Trizol試劑購自Invitrogen 公司，Sample Protector、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、DNase I (RNase free)、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Premix Ex Taq熒光定量試劑盒等購自寶生物工程大連有限公司。⑶引物的設(shè)計(jì)根據(jù)實(shí)施例I 中的 SEQ ID No : 10、SEQ ID No :11 和 SEQ ID No :1 序列，應(yīng)用Primer Premier 5· O軟件包設(shè)計(jì)GNRHR基因熒光定量引物，上游引物序列Fl (SEQ ID No:18)，下游引物序列Rl (SEQ ID No :19)，目標(biāo)序列長度108bp，以鴨β-actin基因(登錄號EF667345. I)作為內(nèi)參基因并設(shè)計(jì)其上游引物和下游引物，引物序列為上游引物F2 (SEQ IDNo :20)，下游引物R2(SEQ ID No :21)，目標(biāo)序列長度132bp。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。(4) RNA的提取和cDNA合成將各組織樣品按姆IOOmg組織加入ImL Trizol勻衆(zhòng),采用trizol法提取RNA。為克服RNA溶液中痕量基因組DNA對RT-PCR的干擾，采用DNaseI (RNase free, 5U/ μ L)，按照使用說明處理后，采用酚-氯仿-異戊醇法抽提后，溶于DEPC水中。cDNA第一鏈的合成PCR 反應(yīng)總體積為 20U/ μ L，包括總 RNA5 μ g, oligo (dT) 18 (O. 5ug/ μ I) I μ L，Random 6primer (0. 2ug/μ I) I μ L, buffer 4 μ L, dNTP(IOmM each)2 μ L, RNaseInhibitor(20U/yL)lyL，AMV(10U/yL)，加 DEPC H20 至 20U/yL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37°C 15min ;然后85°C 30s。得到第一鏈cDNA用于下步PCR反應(yīng)。(5) GNRHR基因?qū)崟r(shí)熒光定量
采用熒光定量PCR引物，以β-actin基因?yàn)楣芗一?，反?yīng)體系為模板2μ 1，SYBR Premix Ex taq(2X) 12. 5μ 1，ROX Dye ΙΙ(50Χ)0· 5μ 1，d ddH20 9. 5 μ 1，上下游引物(20pmol/ul)各O. 25 μ I,總體系為25ul。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量95°C 30s變性，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每ー循環(huán)包括95°C 5s、60°C 20min,并在每次循環(huán)結(jié)束后檢測熒光；以每ー個(gè)循環(huán)上升I°C，從60°C到95°C，全程采集熒光信號，獲得熔解曲線。(6)統(tǒng)計(jì)處理相對定量分析以鴨β -actin基因?yàn)閰⒄栈?，利用Ct值計(jì)算各組織部位中mRNA 相對表達(dá)量，詳見參考文獻(xiàn)(Wong and Medrano，2005)，標(biāo)準(zhǔn)其計(jì)算公式為mRNA相對表達(dá)
且—0-Δ ACt
里一」，Δ Δ Ct = Δ Ct目的組織_ Δ Ct標(biāo)職織
Δ Ct目眺織=Ct @腿H 參照編
Δ Ct麵組織=Ct @腿H 參照翻參照組織樣品為每只鴨卵巢部組織混合后RNA池。利用EXCEL12. O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(7)結(jié)果與分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示，250日齡高產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨的GNRHR基因mRNA表達(dá)量為
3.523，顯著高于單黃蛋高郵鴨卵巢組織GNRHR基因mRNA表達(dá)量O. 788 (P < O. 05) ；330日齡高產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨的GNRHR基因mRNA表達(dá)量為5. 332，顯著高于單黃蛋高郵鴨卵巢組織GNRHR基因mRNA表達(dá)量I. 829 (P < O. 05)，這ー結(jié)果提示，GNRHR基因mRNA表達(dá)量的增加能夠有效促進(jìn)高郵鴨卵子的排放，使其超排，產(chǎn)生雙黃鴨蛋，因此根據(jù)我們克隆獲得的GNRHR基因序列，能夠人工合成GNRHR激素。
權(quán)利要求
1.一種鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，其特征在于它經(jīng)由以下兩對引物GF4 (SEQ ID No: 14)與 GR4(SEQID No :15) ；GF5 (SEQID No :16)與 GR5 (SEQ ID No :17)克隆測序獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，其特征在于其核苷酸序列SEQID No 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，其特征在于其氨基酸序列SEQID No 2所示。
全文摘要
本發(fā)明公布了鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)核苷酸序列SEQ ID No1和該基因編碼的氨基酸序列SEQ ID No2。以及提供了可用于克隆測序獲得鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)序列的兩對引物GF4(SEQ ID No14)與GR4(SEQ ID No15)；GF5(SEQ ID No16)與GR5(SEQ ID No17)。本發(fā)明通過同源克隆測序的方法獲得了鴨GNRHR基因，并成功應(yīng)用于鴨多產(chǎn)雙黃蛋技術(shù)的開發(fā)，該基因適用于鴨繁殖性能的分子生物技術(shù)的開發(fā)和遺傳育種。
文檔編號C12N15/11GK102660549SQ20121012318
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者朱文奇, 李慧芳, 束婧婷, 陳寬維, 陳文峰 申請人:江蘇騰達(dá)源農(nóng)牧有限公司