專利名稱：R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種鄰氯扁桃酸及其醇酯，特別是涉及ー種R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備方法。
背景技術(shù)：
鄰氯扁桃酸或其醇酯是ー種重要的醫(yī)藥、化工中間體。單ー對映體R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備依賴于三類方法化學(xué)法、物理法和生物法。(I)化學(xué)法，主要是利用手性胺類化合物，通過形成非對映異構(gòu)體鹽，得到單ー對映體，也可以利用某種還原試劑以鄰氯苯こ酮酸甲酯不對稱合成單ー構(gòu)型的扁桃酸甲酷。(2)物理法，用于鄰氯扁桃酸或其醇酯的 對映體拆分，如色譜法、結(jié)晶法、膜法和超臨界萃取等方法。無論化學(xué)法還是物理法鄰氯扁桃酸或其醇酯對映體的拆分，都不可避免地帶來環(huán)保及成本壓力、重金屬殘留等弊端。近年來生物法發(fā)展較為迅速，生物法國內(nèi)外的研究逐年增多，包括野生微生物轉(zhuǎn)化、基因工程菌轉(zhuǎn)化、酶法催化及反應(yīng)介質(zhì)的選擇等諸多報(bào)道。其中，野生微生物轉(zhuǎn)化主要是以外消旋型鄰氯扁桃酸或其醇酯為底物，通過特定微生物降解某ー對映體，獲得單一光學(xué)對映體鄰氯扁桃酸或其醇酷，即便經(jīng)過菌種改造提高轉(zhuǎn)化速率，這種方法最大轉(zhuǎn)化率的理論值僅為50%，轉(zhuǎn)化率較低，造成資源浪費(fèi)。國際上，通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得的羥氰化酶已應(yīng)用于R-鄰氯扁桃酸的エ業(yè)生產(chǎn)。但由于反應(yīng)中有劇毒物質(zhì)HCN的參與，存在極大的安全隱患及環(huán)境壓力。采用專一性羰基還原酶還原鄰氯苯こ酮酸甲酷，進(jìn)而通過分離純化獲得単一的R-鄰氯扁桃酸甲酷，但這種方法需要添加特定的輔因子NADP+ (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，使得反應(yīng)向還原方向持續(xù)進(jìn)行，成本較高，而且上述方法往往需要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，比如常采用兩相催化及離子液體等反應(yīng)體系，以期獲得更高的產(chǎn)率及光學(xué)純度，生產(chǎn)過程較復(fù)雜。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種底物廉價(jià)易得、理論轉(zhuǎn)化率高、環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)的R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明提供ー種R-鄰氯扁桃酸及其醇酯制備方法，構(gòu)建ー種氧化還原偶聯(lián)催化體系，該體系包括工程菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)S-扁桃酸脫氫酶、鄰氯苯こ酮酸羰基還原酶及葡萄糖脫氫酶，直接制備靜息細(xì)胞-磷酸鹽緩沖體系，以外消旋型鄰氯扁桃酸(或其醇酷)及葡萄糖為 底物，進(jìn)行順序催化反應(yīng)。R-鄰氯扁桃酸的制備方法包括以下步驟
(I)酶的重組表達(dá)
設(shè)計(jì)引物對P1、P2 Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，，以熒光假單胞菌基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR第一次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為S-扁桃酸脫氫酶基因Pf量//ガ，經(jīng)改造后得到序列為Seql的氨基酸，將序列Seql與表達(dá)載體pETDuet-Ι 連接；
設(shè)計(jì)引物對P3、P4
P3 D> -ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，
以枯草芽孢桿菌基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因其氨基酸序列為Seq2N ；
設(shè)計(jì)引物對P5、P6
P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccct
CSLSLSL^0，
以釀酒酵母基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR第三次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為釀酒酵母羰基還原酶基因6 ,經(jīng)改造后得到序列為Seq3的氨基酸，將Seq2N、Seq3先后與表達(dá)載體pETDuet-Ι 連接；
(2 )轉(zhuǎn)化宿主制備BL21宿主感受態(tài)后，通過熱激法或電擊法獲得能夠表達(dá)S-扁桃酸脫氫酶的基因工程菌I及可表達(dá)GRE2與Bsmi的基因工程菌13,備用;
(3)接種培養(yǎng)將所述基因工程菌I和基因工程菌]]按菌體密度Γ5:1的比例混合，
共同培養(yǎng)于LB-Amp液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)6 10h，轉(zhuǎn)速240轉(zhuǎn)/分，當(dāng)OD6tltl達(dá)到O. 4^0. 6時(shí)，接種于裝有150mL LB-Amp液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶用紗布封ロ，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl O. Γ0. 6，將所有培養(yǎng)物接種于裝有IOL LB-Amp液體培養(yǎng)基的種子罐中，培養(yǎng)8h，移種至150L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至0D_ O. 4 0. 5，于23°C 26°C、搖床振蕩培養(yǎng)5 8h，轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，至DO值25% 38% ；
(4)外消旋型鄰氯扁桃酸和葡萄糖的添加按照lmol/L的濃度添加外消旋型鄰氯扁桃酸，葡萄糖添加量
為外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP為輔因子，經(jīng)過6 10h催化，獲得R-鄰氯扁桃酸。所述的制備方法中第一次、第二次和第三次PCR擴(kuò)增時(shí)PCR體系均為=IOXTaqbuffer 5 μ I ； 10 mmol/L
的 dNTP I. 5 μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ;對應(yīng)的上下游引物各 I μ I ；DNA 模板 I μ I ;5U/ μ I Taq DNA 聚合
SI 0. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I。其中第一次PCR擴(kuò)增時(shí)的步驟為(1) 95°C，預(yù)變性3min ;(2) 94°C，變性30s;
(3)50°C退火 30s ;(4)
72°C延伸75s ;步驟⑵ (4)重復(fù)30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4で。第二次PCR擴(kuò)增時(shí)的步驟為(I) 94°C，預(yù)變性3min ;(2) 94°C，變性30s ; (3)54°C退火3Os; (4) 72
で延伸50s ;步驟⑵ ⑷重復(fù)30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。第三次PCR擴(kuò)增時(shí)的步驟為(I) 94°C，預(yù)變性3min ； (2) 94°C，變性30s ； (3)54°C退火30s ；(4) 72°C延伸66s ;步驟⑵ ⑷重復(fù)30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。 本發(fā)明的積極有益效果
(I)本發(fā)明將廉價(jià)易得的外消旋型鄰氯扁桃酸(或其醇酷)生物催化為有重要エ業(yè)價(jià)值的R-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)，這ー順序偶聯(lián)反應(yīng)使得S-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)完全轉(zhuǎn)化為其光學(xué)對映體，成本低，綠色環(huán)保，エ藝簡化，適于エ業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明方法的理論轉(zhuǎn)化率可達(dá)到100%，是ー種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)的R-鄰氯扁桃酸単一光學(xué)對映體制備方法，其中S-扁桃酸脫氫酶、羰基還原酶及葡萄糖脫氫酶基因是分離于生物體的天然序列，或經(jīng)過改造后能夠在相應(yīng)宿主內(nèi)獲得活性表達(dá)，且S-扁桃酸脫氫酶具有底物S-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)專ー性，羰基還原酶具有底物鄰氯苯こ酮酸(或其醇酷)專ー性，以NADP為輔因子，葡萄糖脫氫酶可以氧化葡萄糖且產(chǎn)生適量NADPH，維持催化 反應(yīng)順序進(jìn)行。(3)本發(fā)明過程精簡，反應(yīng)時(shí)間短，耗能小，易于操作，得率高，產(chǎn)物R-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)的得率大于85%，R-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)ee值在95%以上。
圖I表示S-扁桃酸脫氫酶基因與表達(dá)載體pETDuet-Ι的連接；
圖2表示枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因和釀酒酵母羰基還原酶基因GRE2與表達(dá)載體pETDuet-Ι的連接。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :R_鄰氯扁桃酸的制備方法，包括以下步驟
(I)酶的重組表達(dá)
設(shè)計(jì)引物對P1、P2
Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，,
以突光假單胞菌iPsGudomorms /Ywore1Scefl1S )的基因組的DNA為PCR模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 體系為10 X Taq buffer 5μ I ；10 mmol/L dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ;上下游引物各 I μ I ;DNA 模板 I μ I ；5U/ μ I Taq DNA polymerase O. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I ；PCR 擴(kuò)增步驟為(1) 95°C，預(yù)變性 3min ;(2) 94°C，變性 30s ; (3) 50°C 退火 30s ; (4) 72 °C延伸75s ;重復(fù)步驟(2) (4) 30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4で。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收1100-1200bp區(qū)間的目標(biāo)條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物為S-扁桃酸脫氫酶基因PfM//ガ，其核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列分別為SeqlN、SeqlA，SeqlA經(jīng)改造后得到序列為Seql的氨基酸，將Seql與表達(dá)載體pETDuet-Ι連接 '參見圖I。設(shè)計(jì)引物對P 3、P4:
P3 :5，-ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，
以枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is )基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為10XTaq buffer 5 μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L 的 MgCl2 3 μ I ;上下游引物各 I μ I ；DNA 模板 I μ I ；5U/ μ I Taq DNA polymerase O. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I。PCR擴(kuò)增步驟為(1) 94°C，預(yù)變性 3min ;(2) 94°C，變性 30s ; (3) 54°C退火 30s; (4) 72。。延伸50s ;步驟⑵ ⑷重復(fù)30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收700-900bp區(qū)間的目標(biāo)條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物為枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因BsGDH，其核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列分別為Seq2N、Seq2A，將 Seq2A 與表達(dá)載體 pETDuet-Ι 連接；
設(shè)計(jì)引物對P 5、P6
P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccct
CSLSLSL^0，
以釀酒酵母i^scchaxomycGS cerevisiae )基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 體系為10XTaq buffer 5μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L 的 MgCl23μ I ;上下游引物各 1μ I ;DNA 模板 1μ I ;5υ/μ I Taq DNA polymerase 0. 25 μ I ；ddH2037. 25 μ I。PCR 擴(kuò)增步驟為(1) 94°C，預(yù)變性 3min ; (2) 94°C，變性 30s ; (3) 54°C退火30s ； (4) 72°C延伸66s ;步驟(2) (4)重復(fù)30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收1000-1 IOObp區(qū)間的目標(biāo)條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物為釀酒酵母羰基還原酶基因6 ，其核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列分別為Seq3N、Seq3A, Seq3A經(jīng)改造后得到Seq3氨基酸序列,將Seq3與表達(dá)載體pETDuet_l連接；參見圖2。(2)轉(zhuǎn)化宿主
制備BL21 (DE3)宿主感受態(tài)后，通過常規(guī)熱激法或電擊法獲得能夠表達(dá)S-扁桃酸脫氫
酶的基因工程菌I及可表達(dá)GRE2與鳩H的基因工程菌II，備用；
(3)接種培養(yǎng)
將所述的基因工程菌I和基因工程菌 31按菌體密度Γ5:1的比例混合，共同培養(yǎng)于
LB-Amp液體培養(yǎng)基(含50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)中，于37°C、搖床振蕩培養(yǎng)6 10h，轉(zhuǎn)速240轉(zhuǎn)/分鐘，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 4^0. 6時(shí)，接種于5個(gè)裝有150mL LB-Amp液體培養(yǎng)基的三角瓶中，其中三角瓶用八層紗布封ロ，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6J). 4^0. 6，將所有培養(yǎng)物接種于10L LB-Amp液體培養(yǎng)基的15L種子罐中，培養(yǎng)8小吋，移種至150L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至0D_0. 4 0. 5，加入終濃度為 0. 1-0. 6mmol/L (優(yōu)選 0. 5mmol /L)的 IPTG,于 23°C 26°C、搖床振蕩培養(yǎng)5 8小時(shí)，轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，至DO值25% 38% ；
(4)外消旋型鄰氯扁桃酸及葡萄糖的添加按照lmol/L的濃度添加外消旋型鄰氯扁桃酸，葡萄糖添加量為外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP為輔因子，經(jīng)過6 10小時(shí)催化，獲得R-鄰氯扁桃酸。實(shí)施例2 R-鄰氯扁桃酸甲酯的制備方法，和實(shí)施例I基本相同，包括以下步驟 將消旋型鄰氯扁桃酸在濃硫酸作用下與甲醇酯化，產(chǎn)生消旋型鄰氯扁桃酸甲酷。以下
步驟與實(shí)施例I中的步驟(1)、(2)、(3)、(4)相同，最后獲得R-鄰氯扁桃酸甲酷。其他醇酯的制備只需將酯化的醇變換為相應(yīng)的醇即可。
權(quán)利要求
1.ー種R-鄰氯扁桃酸的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟 (I)酶的重組表達(dá) 設(shè)計(jì)引物對P1、P2 Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，, 以熒光假單胞菌基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR第一次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為S-扁桃酸脫氫酶基因Pf量//ガ，經(jīng)改造后得到序列為Seql的氨基酸，將序列Seql與表達(dá)載體pETDuet-Ι 連接； 設(shè)計(jì)引物對P3、P4 P3 D> -ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’， 以枯草芽孢桿菌基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因其氨基酸序列為Seq2N ； 設(shè)計(jì)引物對P5、P6 P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccctCSLSLSL^0， 以釀酒酵母基因組的DNA為PCR模板，進(jìn)行PCR第三次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為釀酒酵母羰基還原酶基因6 ,經(jīng)改造后得到序列為Seq3的氨基酸，將Seq2N、Seq3先后與表達(dá)載體pETDuet-Ι 連接； (2 )轉(zhuǎn)化宿主制備BL21宿主感受態(tài)后，通過熱激法或電擊法獲得能夠表達(dá)S-扁桃酸脫氫酶的基因工程菌I及可表達(dá)6 與的基因工程菌 Ii，備用； (3)接種培養(yǎng)將所述基因工程菌I和基因工程菌Il按菌體密度1~5:1的比例混合，共同培養(yǎng)于LB-Amp液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)6 10h，轉(zhuǎn)速240轉(zhuǎn)/分，當(dāng)0D_達(dá)到O. 4^0. 6時(shí)，接種于裝有150mL LB-Amp液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶用紗布封ロ，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl O. Γ0. 6，將所有培養(yǎng)物接種于裝有IOL LB-Amp液體培養(yǎng)基的種子罐中，培養(yǎng)8h，移種至150L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至OD6tltl O. 4 O. 5，于23°C 26°C、搖床振蕩培養(yǎng)5 8h，轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，至DO值25% 38% ； (4)外消旋型鄰氯扁桃酸和葡萄糖的添加按照lmol/L的濃度添加外消旋型鄰氯扁桃酸，葡萄糖添加量 為外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP為輔因子，經(jīng)過6 10h催化，獲得R-鄰氯扁桃酸。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第一次、第二次和第三次PCR擴(kuò)增時(shí)PCR體系均為10XTaq buffer 5μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ；對應(yīng)的上下游引物各I μ I ；DNA模板I μ I ；5U/ μ I Taq DNA聚合酶O. 25 μ I ；ddH2037. 25 μ I ο
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第一次PCR擴(kuò)增時(shí)的步驟為(I)95°C，預(yù)變性 3min ;(2) 94°C，變性 30s ; (3) 50°C退火 30s ; (4) 72°C延伸 75s;步驟⑵ ⑷重復(fù)30 次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4で。
4.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第二次PCR擴(kuò)增時(shí)的步驟為(I)94°C，預(yù)變性 3min ；⑵94°C，變性30s ； (3) 54°C退火30s ； (4) 72°C延伸50s ;步驟⑵ ⑷重復(fù)30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。
5.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第三次PCR擴(kuò)增時(shí)的步驟為(I)94°C，預(yù)變性 3min ； (2) 94°C，變性 30s ； (3) 54°C退火 30s ； (4) 72°C延伸 66s ;步驟(2) (4)重復(fù)30次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。
全文摘要
本發(fā)明公開一種R-鄰氯扁桃酸及其醇酯制備方法。本方法通過誘導(dǎo)表達(dá)重組S-扁桃酸脫氫酶、羰基還原酶及葡萄糖脫氫酶，以外消旋型鄰氯扁桃酸或其醇酯及葡萄糖為底物，進(jìn)行順序催化反應(yīng)，獲得R-鄰氯扁桃酸或其醇酯。采用的基因工程菌為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌及釀酒酵母。該方法是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)的R-鄰氯扁桃酸單一光學(xué)對映體制備方法，反應(yīng)時(shí)間短，耗能小，易于操作，得率高，產(chǎn)物R-鄰氯扁桃酸(或其醇酯)的得率大于85%，R-鄰氯扁桃酸(或其醇酯)的ee值在95%以上。本發(fā)明將廉價(jià)易得的外消旋型鄰氯扁桃酸生物催化為具有重要工業(yè)價(jià)值的R-鄰氯扁桃酸，成本低，綠色環(huán)保，工藝簡化，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102660625SQ20121011957
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者吳闊, 王海勇 申請人:鄭州市拓信生物研究所