專(zhuān)利名稱(chēng)：海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及ー種低溫SOD海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該方法生產(chǎn)的低溫SOD作為生物體內(nèi)超氧陰離子自由基清潔齊U，主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等行業(yè)，尤其在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤、癌癥和自身免疫治療等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, EC I. 15. I. 1，簡(jiǎn)寫(xiě) S0D)是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)生成過(guò)氧化氫和分子氧，從而清除生物體內(nèi)的氧自由基，起到保護(hù)生物體免受傷害作用(自俊青，大理師專(zhuān)學(xué)報(bào)，1998)。1969年Mccord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該酶生物催化活性并命名為超氧化物歧化酶(林慶斌，化學(xué)世界，2006)。按其結(jié)合的金屬元素種類(lèi)不同，可將其分為三類(lèi)ー類(lèi)是藍(lán)綠色Cu，Zn-SOD，相對(duì)分子量約32000，主要存在于真核細(xì)胞的胞液和葉綠體中，是研究最多、最深入的ー類(lèi)；第二類(lèi)是紫紅色Mn，F(xiàn)e-SOD，相對(duì)分子量約40000，主要存在于原核生物細(xì)胞及線粒體的基質(zhì)中；第三類(lèi)是黃褐色Fe-SOD，相對(duì)分子量約38700，主要存在于原核細(xì)胞及ー些植物中(陳惠芳，生命的化學(xué)，2003)。SOD作為生物酶制劑，醫(yī)療上主要用于輔助放療與化療，腎、肝、心臟等器官的保護(hù)和移植，消除輻射引起的副作用，以及作為某些疾病的探針等；食品エ業(yè)作為添加劑應(yīng)用于飲料和啤酒等。近年來(lái)SOD被廣泛用于治療氧中毒、老年性白內(nèi)障、糖尿病、心血管疾病、各種炎癥等多種疾病(張博潤(rùn)等，微生物學(xué)通報(bào)，1992);幾十年來(lái)SOD—直是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，起初階段多集中于從動(dòng)物血液或植物組織中提取S0D，中期階段普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的研究開(kāi)始起步并日漸增多，目前普通微生物生產(chǎn)SOD已然成為研究的主體。普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD最適作用溫度一般為45 55°C，而人體的生理溫度一般為36. 5 37°C，致使普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD不能充分發(fā)揮作用，出現(xiàn)治療效果差或沒(méi)有效果(曾胤新，微生物學(xué)雜志，2004)。海洋微生物(低溫、寡營(yíng)養(yǎng)、低光照、高壓)發(fā)酵生產(chǎn)的SOD最適作用溫度一般為35 40°C，比較接近人體的生理溫度，應(yīng)用于治療效果比較明顯。而海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD研究尚在起步階段，產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；Ｑ笪⑸锇l(fā)酵生產(chǎn)SOD還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于動(dòng)物SOD血液來(lái)源困難、安全性以及普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD應(yīng)用最適作用溫度的局限性，利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫SOD具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。海洋低溫SOD對(duì)熱反應(yīng)極為敏感，且在自然環(huán)境溫度下具有高酶活力及高催化效率，經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，如果將SOD應(yīng)用于食品エ業(yè)從而大大縮短處理過(guò)程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用，且不影響產(chǎn)品品質(zhì)(鄭洲等，極地研究，2007)，這將有助于低溫SOD的推廣和使用，從根本上擺脫繁瑣的提取エ藝及中溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和流程。鑒于海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD在自然和生理溫度下的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，海洋低溫SOD在醫(yī)療保健、食品、化 妝品等方面具有廣泛的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)潛力。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法，該發(fā)明主要是海洋微生物經(jīng)過(guò)定向馴化后，按常規(guī)方法液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫SOD活性可以達(dá)到180U/ml，如再經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制齊U。該酶制劑最適作用溫度接近人體生理溫度，醫(yī)療效果顯著；在食品加工中應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低，可以從根本上避免中溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和エ藝。本發(fā)明所述的ー種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法具體包括以下步驟(I)將產(chǎn)生SOD的海洋微生物進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長(zhǎng)良好；(2)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌8 14°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和ニ級(jí)種子； (3)將液體一級(jí)種子或ニ級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的4 10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在8 14°C培養(yǎng)60 96h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集的上清為SOD粗酶液；(6)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(5)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長(zhǎng)條件按菌種保藏單位提供的說(shuō)明進(jìn)行。SOD產(chǎn)生菌(CGMCC編號(hào)I. 3或I. 11)先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產(chǎn)酶條件發(fā)酵生產(chǎn)低溫S0D，馴化后的菌株在4°C中可保存2個(gè)月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在_80°C條件下可以長(zhǎng)期保藏。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. O 16. Og,牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自來(lái)水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米漿5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來(lái)水I. 0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。(2)將產(chǎn)生SOD的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；
(3)將⑵活化好的菌種進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌在8 14°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和ニ級(jí)種子；(5)將(4)制備的ニ級(jí)種子按發(fā)酵液體積4 6%的接種量接入IOL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在8 10°C培養(yǎng)84 96h吋，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；
(8)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(7)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。實(shí)施例ニ (I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基葡萄糖10. 0g，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. O 16. 0g，牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自來(lái)水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米漿5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來(lái)水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。(2)將產(chǎn)生SOD的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種進(jìn)行定向馴化，使其在常規(guī)壓力、鹽濃度條件下生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌在8 14°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和ニ級(jí)種子；(5)將(4)制備的ニ級(jí)種子按發(fā)酵液體積6 8%的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10 12°C培養(yǎng)72 84h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；(8)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(7)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。實(shí)施例三
(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. O 16. 0g，牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自來(lái)水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米漿5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來(lái)水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。(2)將產(chǎn)生SOD的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種進(jìn)行定向馴化，使其在常規(guī)壓力、鹽濃度條件下生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌在8 14°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和ニ級(jí)種子；(5)將(4)制備的ニ級(jí)種子按發(fā)酵液體積8 10%的接種量接入200L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在12 14°C培養(yǎng)60 72h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；(8)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(7)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。
權(quán)利要求
1.ー種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法，其包括以下步驟 (1)將產(chǎn)生超氧化物歧化酶的海洋微生物進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長(zhǎng)良好; (2)按常規(guī)方法將定向馴化后的超氧化物歧化酶產(chǎn)生菌在8 14°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和ニ級(jí)種子； (3)將液體一級(jí)種子或ニ級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的4 10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在8 14°C培養(yǎng)60 96h吋，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀； (5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm離心,收集到的上清為超氧化物歧化酶粗酶液； (6)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(5)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，在步驟(6)之后進(jìn)ー步包括將步驟(6)得到的粗酶液進(jìn)ー步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中菌種定向馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為 (1)菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8.O 16.0g，牛肉膏12. O 24. 0g，蛋白胨4. O .12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L，p 值 7. 0，.121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(2)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8.O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. Og,酵母粉2. O 10. Og7NaCl 5. O 10. Og,自來(lái)水I. 0L，pH值7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15.0 25.0g，(NH4)2S043.0 10. 0g，玉米漿5. O .15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來(lái)水I. 0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶的方法是將產(chǎn)生超氧化物歧化酶的海洋微生物進(jìn)行定向馴化，使其在自然條件下生長(zhǎng)良好；將定向馴化后的超氧化物歧化酶產(chǎn)生菌在8～14℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的4～10％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在8～14℃培養(yǎng)60～96h時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶結(jié)束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集菌體，數(shù)次洗滌后收集沉淀，懸浮于緩沖液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm離心收集上清即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，可以將粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號(hào)C12N9/08GK102653737SQ201210108710
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者于爽, 張慶芳, 王曉輝, 竇少華, 遲乃玉, 馬莉 申請(qǐng)人:大連大學(xué)