專(zhuān)利名稱(chēng)：二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及農(nóng)藥學(xué)領(lǐng)域，主要是一種在二化螟中表達(dá)的魚(yú)尼丁受體基因(核酸序列)及其編碼蛋白。本發(fā)明還涉及該蛋白和受體基因(核酸序列)的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
魚(yú)尼丁受體(RyR)的命名來(lái)自于從南美的一種大風(fēng)子科的豆科植物Ryaniaspeciosa中分離出來(lái)的植物堿殺蟲(chóng)劑魚(yú)尼丁(ryanodine)。研究證明，魚(yú)尼丁是通過(guò)作用于RyR而產(chǎn)生殺蟲(chóng)效果的(Fill and Copello，2002)。但 由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難于改造，成本高和毒性高等因素，因而限制了其作為殺蟲(chóng)劑的使用。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，日本農(nóng)藥終于(NihonNohyaku)發(fā)現(xiàn)了鄰苯二甲酰胺類(lèi)化合物(phthalic diamides)的殺蟲(chóng)活性,并從中商品化了氟蟲(chóng)酰胺(Tohnishi et al.，2005)。幾乎同時(shí)美國(guó)杜邦對(duì)也該類(lèi)化合物做了較大結(jié)構(gòu)改變和修飾，發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)新的鄰甲酰氨基苯甲酰胺類(lèi)(anthranilic diamides)殺蟲(chóng)劑,并從中商品化了氯蟲(chóng)酰胺(Lahm et al.，2005)。該化合物不僅在結(jié)構(gòu)上與氟蟲(chóng)酰胺相似，即都具有二酰胺基元，故稱(chēng)它們?yōu)槎０奉?lèi)殺蟲(chóng)劑，而且都作用于RyR。這類(lèi)殺蟲(chóng)劑是一類(lèi)對(duì)鱗翅目等害蟲(chóng)高效，對(duì)哺乳動(dòng)物低毒、安全，作用機(jī)理獨(dú)特，無(wú)交互抗性和對(duì)環(huán)境友好的新型殺蟲(chóng)劑。在農(nóng)藥發(fā)展史上，該類(lèi)殺蟲(chóng)劑是繼以吡蟲(chóng)啉為代表的新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑后的又一個(gè)新的突破(Nauen，2006)。所以目前包括杜邦、拜耳等在內(nèi)的農(nóng)化巨頭們正在繼續(xù)加緊開(kāi)發(fā)二酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑，同時(shí)試圖篩選更多作用于RyR的新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)(Lahm etal. ,2009)。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的改變是細(xì)胞生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，它的變化是Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放、攝取Ca2+等動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。RyR和三磷酸肌醇受體(IP3R)(Berridge,1993)共同組成了兩類(lèi)主要的位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)(SR/ER)上的調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+的通道蛋白(Berridge et al.，2000)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)共有三種不同基因編碼的RyR =RyRl主要在骨骼肌中表達(dá)，參與骨骼肌的興奮-收縮，中樞神經(jīng)中也有少量表達(dá)；RyR2主要表達(dá)于心肌中，是心肌收縮偶聯(lián)不可或缺的成分；RyR3表達(dá)于一些特定的肌肉及非肌肉組織中，包括腦、神經(jīng)等組織。RyR由4個(gè)分子量約為560kD的相同亞單位組成，是分子量很大的膜蛋白，包含了大量伸入胞漿的決定其特性的N末端結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域分布著通道調(diào)節(jié)物的結(jié)合位點(diǎn)(Fill and Copello，2002)。雖然人們很早就通過(guò)生理生化等方法等發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)的肌肉細(xì)胞中存在著大量的RyR位點(diǎn)(Vazquez-Martinez et al.，2003)，但是相對(duì)于哺乳動(dòng)物RyR較為系統(tǒng)完整的研究，昆蟲(chóng)RyR分子水平的研究在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)幾乎是一篇空白，只有果蠅(Drosophilamelanogaster)的 RyR 基因全長(zhǎng) cDNA 被克隆(Takeshima et al. , 1994)并且進(jìn)行了通道動(dòng)力學(xué)的研究(Xu et al.，2000)。隨著二酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的發(fā)現(xiàn)和上市，昆蟲(chóng)RyR也逐漸成為研究熱點(diǎn)。杜邦公司在Sf9細(xì)胞系中對(duì)不同種屬昆蟲(chóng)的功能性RyR的全長(zhǎng)基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)并申請(qǐng)了專(zhuān)利(W02004027042)，這些昆蟲(chóng)包括鱗翅目煙芽夜蛾(Heliothis virescens)、同翅目桃蟲(chóng)牙(Myzus persicae)、棉蟲(chóng)牙(Aphis gossypii)和玉米飛風(fēng)(Peregrinus maidis)。京都大學(xué)和日本農(nóng)藥公司克隆了家蠶(Bombyx mori)的RyR基因并且成功在HEK293細(xì)胞系獲得穩(wěn)定高效表達(dá)(W02007094408)。這些被注冊(cè)專(zhuān)利的基因序列具有廣泛的用途，如可用于大量化合物殺蟲(chóng)活性篩選方法的建立，用于該受體蛋白抗體的制備，用于生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)以及用于轉(zhuǎn)基因作物研究等。參考文獻(xiàn)具體如下I、Berridge MJ. 1993. Inositol trisphosphate and calcium signalling.Nature 361 :315-325 (磷酸肌醇和鈣信號(hào)，《自然》)。2λBerridge MJ,Lipp P，Bootman MD. 2000. The versatility and universalityof calcium signalling. Nat. Rev. Mo I. Cell Biol. I :11-21 (I丐信號(hào)的多樣性和普遍性，《自然分子生物學(xué)綜述》)。3、Fill M，Copello JA. 2002. Ryanodine receptor calcium release channels.Physiol. Rev. 82 :893-922 (鈣離子釋放的魚(yú)尼丁受體通道，《生理學(xué)綜述》)。4λLahm GP,Cordova D，Barry JD. 2009. New and selective ryanodine receptoractivators for insect control. Bioorg. Med. Chem. 17 :4127-4133 (新型用于害蟲(chóng)控制的選擇性魚(yú)尼丁激活劑，《生物有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)》)。5λLahm GP,Selby TP,Freudenberger JH,Stevenson TMiMyers BJ,Seburyamo G，Smith BK，F(xiàn)lexner L，Clark CE，Cordova D.2005.Insecticidal anthranilic diamides a new class of potent ryanodine receptor activators. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 4898-4906 (鄰甲酰氨基苯甲酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑一類(lèi)新的潛在魚(yú)尼丁受體激活劑，《生物有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)》)。6、Nauen R. 2006. Insecticide mode of action return of the ryanodinereceptor. Pest Manag. Sci. 62 :690-692 (殺蟲(chóng)劑作用機(jī)理魚(yú)尼丁受體的回歸，《有害生物治理科學(xué)》)。7、Takeshima H,Nishi M,Iwabe N,Miyata T,Hosoya TiMasai I,Hotta Y. 1994.Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calciumrelease channel in Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 337 :81-87 (分離和解析一種果蠅的魚(yú)尼丁受體/鈣離子釋放通道，《歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)通信》)。8、Tohnishi M，Nakao H，F(xiàn)uruya T，Seo A，Kodama H，Tsubata K，F(xiàn)ujioka S，Kodama H，Hirooka T，Nishimatsu T. 2005. Flubendiamide,a novel insecticide highlyactive against lepidopterous insect pests. J. Pestic. Sci. 30 :354-360 (氟蟲(chóng)苯甲酉先胺，一種新型針對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的高效殺蟲(chóng)劑，《農(nóng)藥科學(xué)雜志》)。9、 Vazquez-Martinez 0， Canedo-Merino R， Diaz-Munoz M， Riesgo-EscovarJR. 2003. Biochemical characterization,distribution and phylogenetic analysis ofDrosophila melanogaster ryanodine and IP3 receptors，and thapsigargin-sensitiveCa2+ ATPase. J. Cell Sci. 116 :2483-2494(對(duì)果蠅?mèng)~尼丁受體、三磷酸肌醇受體和毒胡蘿卜素敏感型鈣泵的生化，分布和系統(tǒng)發(fā)育分析，《細(xì)胞科學(xué)雜志》)。10、Xu X，Bhat MB, Nishi M，Takeshima H，Ma J. 2000. Molecular cloning ofcDNA encoding a drosophila ryanodine receptor and functional studies of the、carboxyl-terminal calcium release channel. Biophys. J. 78 :1270-1281 (分子克隆一種果蠅?mèng)~尼丁受體并對(duì)其羧基端的鈣釋放通道的功能研究，《生物物理雜志》)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR及其編碼的基因，以及利用該受體表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行殺蟲(chóng)活性物質(zhì)篩選的技術(shù)。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR，編碼具有 二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO :I中的核苷酸序列有至少70%的同源性。作為本發(fā)明的二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR的改進(jìn)該二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR為SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID No :2所不的氣基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種重組載體，該重組載體包含上述二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR0本發(fā)明還同時(shí)提供了用上述重組載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞為HEK_293，CH0，COS, Sf9, S2 或 Sm。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR的用途用來(lái)篩選和/或評(píng)價(jià)調(diào)控魚(yú)尼丁受體活性的物質(zhì)。作為本發(fā)明的二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR的用途的改進(jìn)用來(lái)篩選和/或評(píng)價(jià)調(diào)控魚(yú)尼丁受體活性的物質(zhì)的方法包括如下步驟I)、將上述重組載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系；2)、用候選物質(zhì)處理步驟I)所得的細(xì)胞；3)、檢測(cè)步驟2)所得的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化；當(dāng)鈣離子濃度出現(xiàn)變化時(shí)，說(shuō)明候選物質(zhì)能調(diào)控魚(yú)尼丁受體活性?！愣灾灰蛯?duì)照(如只加入溶劑時(shí))的反應(yīng)相比有顯著差異即可，即，只要確認(rèn)有鈣離子濃度的信號(hào)變化即可。在本發(fā)明中，發(fā)明人在二化螟中克隆到魚(yú)尼丁受體基因CsRyR。在本發(fā)明之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本發(fā)明中提及的二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR序列及其編碼的基因(核酸序列)。本發(fā)明的目的在于提供二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR及其編碼的基因(核酸序列)，并可以用該序列來(lái)轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)該受體的細(xì)胞系，通過(guò)該細(xì)胞系可以對(duì)針對(duì)該受體靶標(biāo)的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)進(jìn)行篩選。在本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55攝氏度條件下與SEQID NO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列雜交。較佳的，所述的序列編碼具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ IDNO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列。備注說(shuō)明在SEQ ID NO 1的末尾含有終止碼。
本發(fā)明分離出的二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR包括具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO: 2序列的多肽。本發(fā)明DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核苷酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本發(fā)明中，二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR編碼的核酸序列指編碼具有二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO 1中第1-15387位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO :I序列編碼框第1-15387位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子取代后產(chǎn) 生的序列。由于密碼的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO :1中第1-15387位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO :I所述的序列。還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO:中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQ ID NO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列的同源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有天然的二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR相同功能的蛋白的SEQ ID NO :1中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為30個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸。在本發(fā)明中二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR指具有二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR相同功能的、SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地以5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又別如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR的活性片段和活性衍生物。在本發(fā)明中二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR保守性變異多肽指與SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表I
最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
權(quán)利要求
1.ニ化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR，其特征在于編碼具有ニ化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO 1中的核苷酸序列有至少70%的同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ニ化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR，其特征是所述ニ化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR為SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求I或2所述的ニ化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有SEQ ID No :2所不的氣基酸序列。
4.ー種重組載體，其特征在于所述重組載體包含權(quán)利要求I或2所述的ニ化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR。
5.用如權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其特征在干所述宿主細(xì)胞為HEK-293, CHO, COS, Sf9, S2 或 Sm。
6.如權(quán)利要求I或2所述的ニ化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR的用途，其特征在于用來(lái)篩選和/或評(píng)價(jià)調(diào)控魚(yú)尼丁受體活性的物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的ニ化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR的用途，其特征在于用來(lái)篩選和/或評(píng)價(jià)調(diào)控魚(yú)尼丁受體活性的物質(zhì)的方法包括如下步驟 .1)、將如權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系； .2)、用候選物質(zhì)處理步驟I)所得的細(xì)胞； .3)、檢測(cè)步驟2)所得的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化；當(dāng)鈣離子濃度出現(xiàn)變化時(shí)，說(shuō)明候選物質(zhì)能調(diào)控魚(yú)尼丁受體活性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR，其編碼具有二化螟魚(yú)尼丁受體蛋白CsRyR的核苷酸序列，核苷酸序列與SEQ ID NO1中的核苷酸序列有至少70％的同源性。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的二化螟魚(yú)尼丁受體基因CsRyR的用途為用來(lái)篩選和/或評(píng)價(jià)調(diào)控魚(yú)尼丁受體活性的物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102628049SQ20121009794
公開(kāi)日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者葉恭銀, 吳順?lè)? 黃佳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)