專(zhuān)利名稱(chēng)：一種結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法。
背景技術(shù)：
結(jié)冷膠是美國(guó)凱可(KELCO)公司開(kāi)發(fā)的一種親水性膠體，它是以少動(dòng)鞘脂單胞菌 (.Sphingomonas paucimobilis)為發(fā)酵菌,經(jīng)數(shù)級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)后,發(fā)酵液再通過(guò)一系列后期提取工藝生產(chǎn)而來(lái)。結(jié)冷膠是結(jié)冷膠族(Gellan Family )多糖中的一種,其分子的基本結(jié)構(gòu)是一條主鏈，由重復(fù)的四糖單元構(gòu)成，參與形成的單糖有葡萄糖、鼠李糖及葡萄糖醒酸， 摩爾比為2:1:1。每單位有I個(gè)O —甘油酰取代基，甘油酰基位于3 —連接成鍵的葡萄糖殘基的2位；另外每隔一個(gè)單位還有I個(gè)O —乙酰取代基，乙酰基在6位上。在結(jié)冷膠發(fā)酵液過(guò)程中，原始形態(tài)的高?；Y(jié)冷膠黏度極高，導(dǎo)致發(fā)酵液的含氧量受到限制，需要在發(fā)酵過(guò)程中使用大功率攪拌和強(qiáng)通風(fēng)，不僅能耗大，而且發(fā)酵產(chǎn)率較低。目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的結(jié)冷膠發(fā)酵制備方法普遍存在發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、原料和能源費(fèi)用高，產(chǎn)品收得率低等問(wèn)題。傳統(tǒng)的結(jié)冷膠發(fā)酵為三級(jí)發(fā)酵，包括一級(jí)和二級(jí)種子罐及三級(jí)大發(fā)酵，通過(guò)改變培養(yǎng)基組成以及調(diào)整攪拌發(fā)酵參數(shù)；碳源主要為白糖，不但價(jià)格高，而且白糖是雙糖， 必須水解為單糖后才能更為有效地被發(fā)酵菌利用；氮源只用到大豆蛋白粉，其為遲效氮源， 菌體利用比較慢。傳統(tǒng)的結(jié)冷膠發(fā)酵攪拌器類(lèi)型為軸向推進(jìn)式和徑向圓盤(pán)彎葉式攪拌葉， 這種攪拌器類(lèi)型能耗比較高。CN101586135公開(kāi)了一種高產(chǎn)量的結(jié)冷膠發(fā)酵制備方法，該方法存在一些不足之處。首先該工藝為三級(jí)發(fā)酵，包括一級(jí)和二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)和三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)，總體發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，流程多；其次，該發(fā)酵工藝中大發(fā)酵中使用白糖和大豆蛋白作為碳源和氮源， 原料成本較高，而且不利于菌體對(duì)碳源和氮源的快速利用；最后，該工藝中使用的通風(fēng)量過(guò)大，主要是由于攪拌槳葉不合理造成的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠縮短發(fā)酵時(shí)間、降低能耗、適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，包括如下工藝步驟
(1)將斜面菌種接入搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成搖瓶種子液，其中所述菌種選用少動(dòng)鞘脂單胞囷；
(2)將上述搖瓶種子液接入種子罐的種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到一級(jí)種子液；
(3)將上述一級(jí)種子液接入發(fā)酵罐的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到含有結(jié)冷膠的發(fā)酵液，其中發(fā)酵罐培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量比組分
葡萄糖漿5. O 6. 0%、大豆粉O. 3 O. 4%、銨鹽O. I O. 15%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 08 O. 11%、磷酸氫二鉀O. 13 O. 16%、硫酸鎂O. 05 O. 07%、消泡劑O. 04
O.06%、其余為蒸懼水。所述步驟(I)中所用的搖瓶培養(yǎng)基的pH為7. 10 7. 25，包括如下質(zhì)量比組分 蔗糖I. 5 2. 5%、牛肉膏O. 2 O. 4%、酵母膏O. I O. 3%、氯化鈉O. 05 O. 15%、其余
為蒸餾水。所述步驟(I)中搖瓶培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速130 170rpm，溫度26 31°C，培養(yǎng)周期14 17h。所述步驟(2)中所用的種子罐培養(yǎng)基的pH為6. 8 7. 3，包括如下質(zhì)量比組分 蔗糖I. 5 2. 5%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 03 O. 05%、磷酸氫二鉀O. 03
O.07%、硫酸鎂O. 05 O. 08%、消泡劑O. 02 O. 03%、其余為蒸餾水。所述步驟(2)中的一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)條件為溫度28.0 33. (TC，通風(fēng)比I :3. O 3. 5，運(yùn)行壓力O. 05 O. 08Mpa，培養(yǎng)周期12_15h。所述步驟(2)中的一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的終點(diǎn)為OD值O. 25±0. 05，OD值測(cè)定采用721 型分光光度計(jì)、660nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)。所述步驟(3)中的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的pH為7. O 7. 3，所述銨鹽為硫酸銨。所述步驟(3)中的二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)條件為溫度30 33°C，通風(fēng)比I: I. 25 2.0， 運(yùn)行壓力O. 03 O. 05Mpa,培養(yǎng)周期45_48h。所述步驟(3)中二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的終點(diǎn)為發(fā)酵液黏度為8000 12000cP，殘?zhí)潜壤秊镺. I O. 3%，0D值O. 4±0. 05，OD值測(cè)定采用721型分光光度計(jì)、660nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)。所述種子罐和發(fā)酵罐的罐徑比為I. 9 2. 6: 1，所用的攪拌槳為5 6組，其中上層4組攪拌槳采用斜葉式攪拌形式，底層剩余攪拌槳采用箭葉式與拋物式混合的攪拌形式。本發(fā)明的積極效果為
本發(fā)明方法發(fā)酵罐中，碳源以葡萄糖漿替換白糖，而氮源采用部分速效無(wú)機(jī)氮源，如硫酸銨，適量補(bǔ)充遲效有機(jī)氮源。這種培養(yǎng)基組成優(yōu)化了培養(yǎng)基中碳源和氮源的類(lèi)型，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，減少了發(fā)酵步驟，縮短了發(fā)酵時(shí)間并提高了發(fā)酵液出膠率，同時(shí)降低了原料成本。本發(fā)明采用兩級(jí)發(fā)酵，大大縮短了總體發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵周期由原來(lái)的75到80小時(shí)縮短為60到65小時(shí)。本發(fā)明方法改變了攪拌槳葉的類(lèi)型和攪拌模式，上層四組攪拌槳葉采用斜葉式攪拌器，其為徑流型攪拌器，底層攪拌槳葉采用箭葉式與拋物式混合的攪拌模式。槳葉前端帶有后掠角的大寬葉槳葉，排出性能優(yōu)于直葉和彎葉開(kāi)啟渦輪，功耗低，剪切力小，在不影響發(fā)酵產(chǎn)率的前提下，可以降低攪拌機(jī)能耗30%同時(shí)也提升了體系溶氧條件。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。本實(shí)施例中所使用的搖瓶體積為5L，種子罐體積為5T，發(fā)酵罐體積為50T。實(shí)際使用體積為種子罐3. 5T，發(fā)酵罐35T。本實(shí)施例包括如下工藝步驟
(I)將斜面菌種接入搖瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)并制成搖瓶種子液；菌種選用少動(dòng)鞘脂單胞菌/7awci o/^7i5·),搖瓶培養(yǎng)基的pH為7. 15, 包括如下質(zhì)量比組分
蔗糖I. 5%、牛肉膏O. 4%、酵母膏O. 2%、氯化鈉O. 10%、蒸餾水97. 8% ；
搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速150rpm，溫度26°C，培養(yǎng)周期14h。(2)將上述搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積的9%接入到種子罐中進(jìn)行一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到一級(jí)種子液；
所用種子罐的罐徑比為2. O: 1，轉(zhuǎn)速為IlOrpm，種子罐培養(yǎng)基的pH為7.0，包括如下質(zhì)量比組分
蔗糖2. 5%、酵母膏O. 6%、磷酸二氫鉀O. 05%、磷酸氫二鉀O. 05%、硫酸鎂O. 08%、消泡劑
O.02%、蒸餾水 96. 7%ο培養(yǎng)條件為溫度33. (TC，通風(fēng)比I :3· O，運(yùn)行壓力O. 06Mpa，培養(yǎng)周期14h。培養(yǎng)的終點(diǎn)為OD值O. 30，OD值測(cè)定，使用721型分光光度計(jì)，660nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行OD值測(cè)定。(3)將上述制備的一級(jí)種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8%接入發(fā)酵罐中進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到含有結(jié)冷膠的發(fā)酵液，其中發(fā)酵罐培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量比組分
葡萄糖漿5. 0%、大豆粉O. 4%、硫酸銨O. 1%、酵母膏O. 6%、磷酸二氫鉀O. 08%、磷酸氫二鉀O. 15%、硫酸鎂O. 07%、消泡劑O. 05%、蒸餾水93. 55% ；
發(fā)酵罐培養(yǎng)基的pH為7. 3;
培養(yǎng)溫度在接種后至20h之間為32°C，20h至放罐前為30. 5°C ；
運(yùn)行壓力O. 04Mpa，培養(yǎng)周期47h，通風(fēng)比為變化數(shù)值，具體為接種后到15h通風(fēng)比為 1:2. 0，15 30h通風(fēng)比為1:1.4，30 47h通風(fēng)比為1:1.25。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵液粘度高于400cp，pH低于6. 7時(shí)開(kāi)始補(bǔ)堿(氫氧化鈉溶液)，堿液質(zhì)量濃度為8-15%，頻率為每?jī)尚r(shí)一次，補(bǔ)堿時(shí)段pH控制在6. 7-7. I之間。培養(yǎng)的終點(diǎn)為OD值O. 4±0. 05，OD值測(cè)定采用721型分光光度計(jì)、660nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)。發(fā)酵液黏度為lOOOOcP，殘?zhí)潜壤秊?. 2%，出膠率為I. 8%。所用發(fā)酵罐的罐徑比為2. 3:1，轉(zhuǎn)速為150rpm，所用的攪拌槳為6組，其中上層4 組攪拌槳采用斜葉式攪拌形式，底層2組攪拌槳采用箭葉式與拋物式混合的攪拌形式。以上所述，為本發(fā)明的較佳實(shí)施案例，并非對(duì)本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，包括如下工藝步驟(1)將斜面菌種接入搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成搖瓶種子液，其中所述菌種選用少動(dòng)鞘脂單胞囷；(2)將上述搖瓶種子液接入種子罐的種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到一級(jí)種子液；(3)將上述一級(jí)種子液接入發(fā)酵罐的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到含有結(jié)冷膠的發(fā)酵液，其中發(fā)酵罐培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量比組分葡萄糖漿5. O 6. 0%、大豆粉O. 3 O. 4%、銨鹽O. I O. 15%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 08 O. 11%、磷酸氫二鉀O. 13 O. 16%、硫酸鎂O. 05 O. 07%、消泡劑O. 04 O.06%、其余為蒸懼水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中所用的搖瓶培養(yǎng)基的PH為7. 10 7. 25，包括如下質(zhì)量比組分蔗糖I. 5 2. 5%、牛肉膏O. 2 O. 4%、酵母膏O. I O. 3%、氯化鈉O. 05 O. 15%、其余為蒸餾水。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中搖瓶培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速130 170rpm，溫度26 31 °C，培養(yǎng)周期14 17h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中所用的種子罐培養(yǎng)基的pH為6. 8 7. 3，包括如下質(zhì)量比組分蔗糖I. 5 2. 5%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 03 O. 05%、磷酸氫二鉀O. 03 O.07%、硫酸鎂O. 05 O. 08%、消泡劑O. 02 O. 03%、其余為蒸餾水。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)條件為溫度28. O 33. (TC，通風(fēng)比I :3. O 3. 5，運(yùn)行壓力O. 05 O. 08Mpa, 培養(yǎng)周期12-15h。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的終點(diǎn)為OD值O. 25±0. 05，OD值測(cè)定采用721型分光光度計(jì)、660nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的pH為7. O 7. 3，所述銨鹽為硫酸銨。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)條件為溫度30 33°C，通風(fēng)比I: I. 25 2. 0，運(yùn)行壓力O. 03 O. 05Mpa,培養(yǎng)周期 45-48h。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的終點(diǎn)為發(fā)酵液黏度為8000 12000cP，殘?zhí)潜壤秊镺. I O. 3%，OD值O.4 ± O. 05，OD值測(cè)定采用721型分光光度計(jì)、660nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)。并不
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述種子罐和發(fā)酵罐的罐徑比為I. 9 2. 6: I，所用的攪拌槳為5 6組，其中上層4組攪拌槳采用斜葉式攪拌形式，底層剩余攪拌槳采用箭葉式與拋物式混合的攪拌形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)冷膠的發(fā)酵制備方法，包括如下工藝步驟將斜面菌種接入搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成搖瓶種子液；將搖瓶種子液接入種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)得到含有結(jié)冷膠的發(fā)酵液，其中發(fā)酵罐培養(yǎng)基包括如下組分葡萄糖漿、大豆粉、銨鹽、酵母膏、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、消泡劑、蒸餾水。本發(fā)明方法發(fā)酵罐中，碳源以葡萄糖漿替換白糖，而氮源采用部分速效無(wú)機(jī)氮源，如硫酸銨，適量補(bǔ)充遲效有機(jī)氮源。這種培養(yǎng)基組成優(yōu)化了培養(yǎng)基中碳源和氮源的類(lèi)型，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，減少了發(fā)酵步驟，縮短了發(fā)酵時(shí)間并提高了發(fā)酵液出膠率，同時(shí)降低了原料成本。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102605017SQ20121008888
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者許懷遠(yuǎn), 陳波 申請(qǐng)人:杭州健恒生物技術(shù)有限公司