專利名稱：腸出血性大腸桿菌o104︰h4檢測(cè)試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒和及其使用方法。
背景技術(shù)：
2011年5月德國(guó)暴發(fā)了大規(guī)模腸出血性大腸桿菌0104 :H4疫情，波及部分歐洲國(guó)家以及美國(guó)、加拿大等國(guó)家，短時(shí)間內(nèi)感染人數(shù)超過4000，少數(shù)病例繼發(fā)溶血性尿毒綜合征 (HUS)，導(dǎo)致多器官受損，甚至有30多人死亡。腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhage E. Coli, EHEC)是大腸桿菌的一個(gè)亞型， 其可引起嚴(yán)重的食源性疾病。常見的腸出血性大腸桿菌(EHEC)血清型有3個(gè)0157、026、 0111，不常見的血清型有40多種，而0104: H4是EHEC家族中的一種罕見的血清型，其含有志賀毒素2(vtx2a)的基因和腸積聚性黏附大腸桿菌毒力質(zhì)粒上的3個(gè)基因aatA，aggR和 aap0鑒于腸出血性大腸桿菌0104:H4危害的嚴(yán)重性以及其影響的廣泛性，快速準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)將具有十分重要的意義。培養(yǎng)法是國(guó)際上通用的鑒定細(xì)菌的方法，參照腸出血性大腸桿菌0157:H4檢測(cè)方法《SN/T 0973-2010進(jìn)出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測(cè)方法》，腸出血性大腸桿菌0104:H4采用培養(yǎng)法檢測(cè)步驟如下(I)增菌無菌操作將待檢樣品放入增菌肉湯中，培養(yǎng)18小時(shí)-24小時(shí)。(2)分離對(duì)⑴增菌肉湯進(jìn)行10倍遞增梯度稀釋，從ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6稀釋液中各取O. ImL增菌肉湯滴加于SMAC平板或(和)科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上，以滅菌L棒進(jìn)行涂布并置于36°C ±1°C培養(yǎng)18小時(shí)-24小時(shí)。在SMAC平板上可疑腸出血性大腸桿菌菌落呈淡褐色中心，扁平透明，邊緣光滑，直徑約2mm。在科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上可疑腸出血性大腸桿菌菌落呈紫紅色。(3)生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定從SMAC平板或科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上挑選不少于5個(gè)-8個(gè)可疑菌落， 進(jìn)行生化鑒定和血清凝集試驗(yàn)。(4)結(jié)果報(bào)告根據(jù)選擇性分離平板、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定結(jié)果，報(bào)告樣品中檢出或未檢出腸出血性大腸桿菌0104: H4。傳統(tǒng)的針對(duì)腸出血性大腸桿菌0104:H4的培養(yǎng)檢測(cè)法存在操作周期長(zhǎng)、工序繁瑣、易污染及所需試劑繁多等缺點(diǎn)，傳統(tǒng)培養(yǎng)法已無法滿足快速檢測(cè)腸出血性大腸桿菌 0104 :H4的需要。因此需要開發(fā)一種能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0104:H4的檢測(cè)試劑盒來滿足當(dāng)前需要。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)周期長(zhǎng)、工序繁瑣、靈敏度低等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0104:H4的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)手段得以實(shí)現(xiàn)一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包含第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液及石蠟，所述第一反應(yīng)液包含以wzy(0104)、fliC(H4)和aggR基因?yàn)榘谢?，并用于熒光定量PCR的wzy (0104)基因的引物探針、fliC(H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。本發(fā)明還提供一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒的使用方法，所述方法包括以下步驟提供待檢測(cè)樣品；進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，所述熒光定量PCR檢測(cè)使用本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌 0104:H4檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，所述熒光定量PCR檢測(cè)包含陰性對(duì)照檢測(cè)和陽性對(duì)照檢測(cè)。本發(fā)明提供的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒及其使用方法，利用熒光定量PCR技術(shù)針對(duì)腸出血性大腸桿菌0104:H4的特異基因wzy (0104)、fliC(H4)和aggR基因進(jìn)行檢測(cè)，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)法中的操作周期長(zhǎng)、所需試劑繁多、對(duì)操作者主觀性依賴等缺點(diǎn)，本發(fā)明將檢測(cè)時(shí)間由傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)法的36小時(shí)以上縮短為5小時(shí)左右，且只需短時(shí)間接觸病菌而增加了操作者安全性，并具有操作簡(jiǎn)便且不會(huì)出現(xiàn)假陽性等優(yōu)點(diǎn)。
圖I為本發(fā)明使用的Ct值的示意性說明，其中所述的閾值線對(duì)應(yīng)于特定探針；圖2為使用本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的流程圖；圖3為使用本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的陽性對(duì)照的結(jié)果，其中三條閾值線分別對(duì)應(yīng)于三種探針，由上至下依次對(duì)應(yīng)FAM、HEX、ROX ；圖4為使用本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的陰性對(duì)照的結(jié)果，其中三條閾值線分別對(duì)應(yīng)于三種探針，由上至下依次對(duì)應(yīng)FAM、HEX、ROX ；圖5為使用本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)得到的熒光定量PCR結(jié)果，其中三條閾值線分別對(duì)應(yīng)于三種探針，由上至下依次對(duì)應(yīng)FAM、HEX、R0X。
具體實(shí)施例方式以下縮略語適用于本發(fā)明PCR Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Tris :三異丙基乙磺酰EDTA ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate,脫氧核糖核苷三憐酸FAM :CarboxyfIuorescein,竣基突光素HEX :hexachloro_fIuorescein,六氣突光素ROX :Carboxy-X-rhodamine,羧基-X-羅丹明
DABCYL :4,4-Dimethylamino-azobenzene_4 ' carboxyl ic acid,4_ 二甲胺偶氮苯-4’ -羧酸Ct cycle threshold,每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的突光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，參見圖I。本說明書中使用的術(shù)語“濃度”，如非特別說明，均指初始濃度，即與其它液體混合之前的濃度。熒光定量PCR技術(shù)在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。其基本原理為在PCR反應(yīng)體系中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行， PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，見圖1， 在曲線指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可進(jìn)行定量分析?；谝陨霞夹g(shù)，本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒針對(duì)EHEC 0104:H4三個(gè)基因wzy(0104)、fliC(H4)和aggR設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含有wzy (0104)、f IiC (H4)和aggR基因DNA模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過程中相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。本發(fā)明實(shí)施例提供一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包含第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液及穩(wěn)定劑，所述第一反應(yīng)液包含以 wzy (0104), fliC(H4)和aggR基因?yàn)榘谢颍⒂糜跓晒舛縋CR的wzy (0104)基因的引物探針、f I iC (H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒中，
上述wzy(0104)基因的引物探針為
wzy (0104)基因的引物
49F:5’ -TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’ (SEQ ID NO :1)，
49R:5’ -TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’ (SEQ ID NO :2)，
wzy (0104)基因的探針
49A : 5 ’ -(FAM)CTTGTCTTTGCAGTCTACT (DABCYL)-3’ (SEQIDNO 3)
上述fliC(H4)基因的引物探針為
fliC(H4)基因的引物
50F:5’ -GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’ (SEQ ID NO :4)，
50R:5’ -GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’ (SEQ ID NO :5)，
fliC(H4)基因的探針
50H : 5 ’ -(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG (DABCYL)-3’ (SEQIDNO 6)
上述aggR基因的引物探針為
aggR基因的引物
51F:5’ -GCAATACATATCTTAGAAATG-3’ (SEQ ID NO :7)，
51R:5’ -CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’ (SEQ ID NO :8)，
aggR基因的探針
51X:5’ -(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’ (SEQ ID NO :9)。優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒中，上述第一反應(yīng)液還包括不含鎂離子的10Xbuffer、MgCl2、dNTPs、滅菌超純水，各組分體積份數(shù)為
wzy(0104)基因的引物
25-50μΜ 的 49F0.1-0.2體積份數(shù)25-50μΜ 的 49R0.1-0.2體積份數(shù)wzy(0104)基因的探針:25-50μΜ 的 49Α0.05-0.15體積份數(shù)_//z+C(H4)基因的引物25-50μΜ 的 50F0.1-0.2體積份數(shù)25-50μΜ 的 50R0.1-0.2體積份數(shù)_//z+C(H4)基因的探針25-50μΜ 的 50Η0.05-0.15體積份數(shù)oggi 基因的引物25-50μΜ 的 5IF0.1-0.2體積份數(shù)25-50μΜ 的 5IR0.1-0.2體積份數(shù)oggi 基因的探針25-50μΜ 的 5IX0.05-0.15體積份數(shù)不含鎂離子的IOxbuffer2-4體積份數(shù)25mM 的 MgCl22-4體積份數(shù)dNTPs2-4體積份數(shù)滅菌超純水4.35-11.25 體積份。該第一反應(yīng)液總體積份數(shù)優(yōu)選但不僅僅為18體積份數(shù)。優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒中，上述第二反應(yīng)液由DNA聚合酶、顯色液和滅菌超純水組成。其中，DNA聚合酶為Taq酶，所述顯色液為溴酚藍(lán)，且該第二反應(yīng)液各組分體積份數(shù)優(yōu)選為Taq 酶(濃度為 5-10U/ μ I) O. 15-0. 3 體積份數(shù)溴酚藍(lán)O. 01-0. 02體積份數(shù)滅菌超純水I. 68-1. 84體積份數(shù)。
該第二反應(yīng)液總體積份數(shù)優(yōu)選但不僅僅2體積份數(shù)。優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒中，上述穩(wěn)定劑優(yōu)選為石蠟，且第一反應(yīng)液與第二反應(yīng)液被該石蠟分隔開；其中，第一反應(yīng)液位于石蠟下方， 第二反應(yīng)液在石蠟上方。優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例腸出血性大腸桿菌0104 :H4檢測(cè)試劑盒中，還包含DNA提取液，陰性對(duì)照液和陽性對(duì)照液。其中，DNA提取液優(yōu)選為O. OIM-0. 02M的pH7. 98-8. 02 的Tris-EDTA緩沖液，Tris-EDTA緩沖液含0.01% -O. 02 % NP-40 (體積百分比)；陰性對(duì)照液優(yōu)選為不含腸出血性大腸桿菌0104:H4的基因組DNA的O. 01-0. 02M pH7. 98-8. 02的 Tris-EDTA緩沖液；陽性對(duì)照液優(yōu)選為含有腸出血性大腸桿菌0104:H4的基因組DNA的 O. 01-0. 02M ρΗ7· 98-8. 02 的 Tris-EDTA 緩沖液。上述實(shí)施例中腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0104:Η4時(shí)能有效利用熒光定量PCR技術(shù)針對(duì)腸出血性大腸桿菌0104:Η4的特異基因 wzy (0104)、fliC(H4)和aggR基因進(jìn)行快速檢測(cè)，將檢測(cè)時(shí)間由傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)法的36小時(shí)以上縮短為5小時(shí)左右，且只需短時(shí)間接觸病菌而增加了操作者安全性，并具有操作簡(jiǎn)便且不會(huì)出現(xiàn)假陽性等優(yōu)點(diǎn)。從而有效避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)法中的操作周期長(zhǎng)、所需試劑繁多、對(duì)操作者主觀性依賴等缺點(diǎn)。本發(fā)明還提供一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒的使用方法，所述使用方法包括以下步驟
提供待檢測(cè)樣品；
進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，所述熒光定量PCR檢測(cè)使用上述實(shí)施例腸出血性大腸桿菌0104 :H4檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。
優(yōu)選地，本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒的使用方法中，所述熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)條件為
50-550C 2-5min ；
94-95°C 2-3min ；
94-95°C 5-10S,55-60°C :40_80S，35-40 個(gè)循環(huán)。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述致病性大腸桿菌檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例一
腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒的制備
(I)按以下序列合成引物探針
wzy (0104)基因的引物
49F:5’ -TTAGTTCATT AGATCGAGGT-3’ (SEQ ID NO :1)，
49R:5’ -TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’ (SEQ ID NO :2)，
wzy (0104)基因的探針
49A:5，- (FAM)CTTG TCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO :3)；
fliC(H4)基因的引物
50F:5’ -GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’ (SEQ ID NO :4)，
50R:5’ -GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’ (SEQ ID NO :5)，
fliC(H4)基因的探針
50H:5’ -(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO :6)；aggR基因的引物51F:5’ -GCAATACATATCTTAGAAATG-3’ (SEQ ID NO :7)，51R:5，-CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’ (SEQ ID NO :8)，aggR基因的探針51X:5’ -(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’ (SEQ ID NO :9)。(2)配制第一反應(yīng)液在容器內(nèi)加入含有2. 5體積份數(shù)不含鎂離子的10Xbuffer、3. 5體積份數(shù) 25mM的MgCl2、2. 5體積份數(shù)的dNTPs，然后再加入引物49F(50yM)0. 15體積份數(shù)、引物 49R(50yM)0. 15體積份數(shù)、探針49A (50 μ Μ) O. I體積份數(shù)、引物50F (50 μ Μ) O. 15體積份數(shù)、 引物50R(50 μ Μ) O. 15體積份數(shù)、探針50Η(50 μ Μ) O. I體積份數(shù)、引物5IF (50 μ Μ) O. 08體積份數(shù)、引物51R(50 μ Μ) O. 08體積份數(shù)、探針51Χ(50 μ Μ) O. I體積份數(shù)，再加入滅菌超純水使第一反應(yīng)液總體積份數(shù)為18，混合均勻，置于容器內(nèi)；(3)配制穩(wěn)定液取石蠟，置于容器內(nèi)；(4)配制第二反應(yīng)液；取O. 2體積份數(shù)的Taq酶(5υ/μ I)、0· 02體積份數(shù)的溴酚藍(lán)并加入滅菌超純水使第二反應(yīng)液總體積份數(shù)為2，混合均勻，置于容器內(nèi)；(5)配制 DNA 提取液0. OlM Tris-EDTA 緩沖液，pH8. 0，含 O. 01 % NP-40，置于容器內(nèi)；(6)配制陰性對(duì)照液0. OlM Tris-EDTA 緩沖液，ρΗ8· O ；(7)配制陽性對(duì)照液由DNA序列合成供應(yīng)商(寶生物工程(大連)有限公司) 合成出血性大腸桿菌0104:Η4基因wzy (0104)、fliC(H4)和aggR的部分序列DNA (SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO : 12)，溶于 O. OlM Tris-EDTA 緩沖液(陽性對(duì)照 DNA 濃度:5ng/y 1)，ρΗ8.0，置于容器內(nèi)冷凍保存。該檢測(cè)試劑盒制備工藝簡(jiǎn)述如下I.將上述步驟(2)制備的第一反應(yīng)液分裝至用于熒光定量PCR的O. 2ml八聯(lián)管中，每管加18μ I ;2.將上述步驟(3)制備的石蠟加熱融化，加入至步驟I得到的八聯(lián)管中的第一反應(yīng)液上，每管加20μ I ；3.待步驟2的石蠟冷卻凝固后，向該八聯(lián)管中加入步驟(4)配制的第二反應(yīng)液，每管加2 μ 1，制備成含PCR反應(yīng)液的八聯(lián)管；4.將步驟(5)配制的DNA提取液無菌分裝至5ml普通離心管,5ml/管,該離心管配有藍(lán)色蓋；5.將上述步驟(6)制備的陰性對(duì)照液無菌分裝至O. 6ml普通帶蓋離心管，40 μ I/ 管，該離心管為紫色透明；6.將上述步驟(7)制備的陽性對(duì)照液融化后無菌分裝至O. 6ml普通帶蓋離心管， 40 μ I/管,該離心管為橙紅色透明；7.組裝試劑盒，其中每個(gè)試劑盒規(guī)格為含PCR反應(yīng)液的O. 2ml八聯(lián)管X6條；含 DNA提取液的5ml藍(lán)蓋離心管X I支；含陰性對(duì)照液的O. 6ml紫色透明離心管；含陽性對(duì)照液的O. 6ml橙紅色透明離心管。
實(shí)施例二腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用本發(fā)明以培養(yǎng)法作為檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0104:H4的參照，本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)流程如圖2所示。培養(yǎng)法步驟如下將待測(cè)樣品置于LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)18小時(shí)，然后對(duì)增菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，從其中的10_4、10_5、10_6稀釋液中各取O. ImL增菌液滴加于科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上，以滅菌L涂布棒進(jìn)行涂布并置于37°C ±1°C培養(yǎng)18小時(shí)-24小時(shí)。在科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上培養(yǎng)后選取藍(lán)色菌落作為可疑腸出血性大腸桿菌。從該瓊脂平板上挑選該可疑菌落，進(jìn)行生化鑒定和血清凝集試驗(yàn)，根據(jù)所得結(jié)果做出判斷。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)步驟如下
(I)增菌培養(yǎng)將待測(cè)樣品置于LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)3小時(shí)，取Iml增菌液，加入DNA提取液50 μ I，混合均勻；
(2)加樣取步驟⑴所得的混合液，加入至實(shí)施例一中制備的含PCR反應(yīng)液的八聯(lián)管中，每管5μ I ；
(3)陰性對(duì)照組取實(shí)施例一中制備的陰性對(duì)照液，加入至實(shí)施例一中制備的含PCR反應(yīng)液的八聯(lián)管中，每管5μ I ;
(4)陽性對(duì)照組取實(shí)施例一中制備的陽性對(duì)照液，加入至實(shí)施例一中制備的含PCR反應(yīng)液的八聯(lián)管中，每管5μ I ;
(5)將步驟(2)-(5)所得的八聯(lián)管放入熒光定量PCR儀(型號(hào)=StratageneΜχ3005Ρ)中進(jìn)行反應(yīng)，突光定量PCR反應(yīng)條件為
50 0C 2min ；
95°C 3min ；
95°C 5S,55°C 60S,40 個(gè)循環(huán)；
rh(6)根據(jù)擴(kuò)增圖譜判定結(jié)果，參考陽性對(duì)照結(jié)果(圖3)，陰性對(duì)照結(jié)果(圖4)，其Ψ :
陽性結(jié)果擴(kuò)增曲線圖Ct值< 35，并有明顯指數(shù)增長(zhǎng)。
陰性結(jié)果擴(kuò)增曲線圖Ct值> 35或無Ct值。
結(jié)果
使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)得到的熒光定量PCR結(jié)果見圖5。
培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果及本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的結(jié)果的比較參見表I。
表I
權(quán)利要求
1.一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包含第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液及穩(wěn)定劑，其特征在于，所述第一反應(yīng)液包含以wzy (0104)、 fliC(H4)和aggR基因?yàn)榘谢?，并用于熒光定量PCR的wzy(0104)基因的引物探針、 f I iC (H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述wzy (0104)基因的引物探針為wzy (0104)基因的引物49F :5’-TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’ (SEQ ID NO 1),49R :5’ -TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’ (SEQ ID NO 2), wzy (0104)基因的探針49A :5’-(FAM)CTTGTCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO 3)；所述fliC(H4)基因的引物探針為 fliC(H4)基因的引物50F:5’ -GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’ (SEQ ID NO :4)，50R:5’ -GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’ (SEQ ID NO :5)， fliC(H4)基因的探針50H:5’ -(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO :6)；所述aggR基因的引物探針為 aggR基因的引物51F:5’ -GCAATACATATCTTAGAAATG-3’ (SEQ ID NO :7)，51R:5’ -CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’ (SEQ ID NO :8)， aggR基因的探針51X:5’ - (ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’ (SEQ ID NO :9)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一反應(yīng)液還包括不含鎂離子的lOXbuffer、MgCl2, dNTPs、滅菌超純水，所述第一反應(yīng)液各組分體積份數(shù)為wzy(0104)基因的引物 25-50μΜ 的 49F 25-50μΜ 的 49R wzy(0104)基因的探針: 25-50μΜ 的 49Α _//z+C(H4)基因的引物 25-50μΜ 的 50F 25-50μΜ 的 50R _//z+C(H4)基因的探針 25-50μΜ 的 50Η oggi 基因的引物 25-50μΜ 的 5IF 25-50μΜ 的 5IR oggi 基因的探針 25-50μΜ 的 5IX 不含鎂離子的IOxbuffer 25mM 的 MgCl2 dNTPs 滅菌超純水、0.1-0.2體積份數(shù) 0.1-0.2體積份數(shù);、0.05-0.15體積份數(shù);、0.1-0.2體積份數(shù) 0.1-0.2體積份數(shù);、0.05-0.15體積份數(shù)；、、0.1-0.2體積份數(shù) 0.1-0.2體積份數(shù);、0.05-0.15體積份數(shù); 2-4體積份數(shù) 2-4體積份數(shù) 2-4體積份數(shù) 4.35-11.25體積份數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第二反應(yīng)液由DNA聚合酶、顯色液和滅菌超純水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 DNA聚合酶為Taq酶，其濃度為5-10U/μ 1，所述顯色液為溴酚藍(lán)，且所述第二反應(yīng)液各組分體積份數(shù)為所述Taq酶O. 15-0. 3體積份數(shù)溴酚藍(lán)O. 01-0. 02體積份數(shù)，滅菌超純水I. 68-1. 84體積份數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為石蠟，且所述第一反應(yīng)液與所述第二反應(yīng)液被所述石蠟分隔開，所述第一反應(yīng)液位于所述石蠟下方，所述第二反應(yīng)液在所述石蠟上方。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒還包含DNA提取液、陰性對(duì)照液和陽性對(duì)照液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 DNA提取液為O. OIM-0. 02M的pH7. 98-8. 02的Tris-EDTA緩沖液，所述Tris-EDTA緩沖液含體積百分比為O. 01%-O. 02%的NP-40 ;所述陰性對(duì)照液為不含腸出血性大腸桿菌0104:H4 的基因組DNA的O. 01-0. 02M pH7. 98-8. 02的Tris-EDTA緩沖液；所述陽性對(duì)照液為含有腸出血性大腸桿菌0104:H4的基因組DNA的O. 01-0. 02M ρΗ7· 98-8. 02的Tris-EDTA緩沖液。
9.一種腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟提供待檢測(cè)樣品；進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，所述熒光定量PCR檢測(cè)使用如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的腸出血性大腸桿菌0104 :Η4檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)條件為50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10S,55-60°C :40_80S，35—40 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測(cè)試劑盒，包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包含第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液及穩(wěn)定劑，所述第一反應(yīng)液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因?yàn)榘谢?，并用于熒光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探針、fliC(H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。本發(fā)明還提供一種腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測(cè)試劑盒的使用方法，所述方法具有快速準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便且不會(huì)出現(xiàn)假陽性的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102605069SQ201210068180
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者盧柳燕, 吳成貢, 汪再興, 田仁鵬, 董紹旺, 黃娟, 龔劍 申請(qǐng)人:深圳市生科源技術(shù)有限公司