專利名稱：致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒及致病性大腸桿菌檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒及致病性大腸桿菌檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
致病性大腸桿菌(EPEC)是一種以糞口途徑傳播的，能導(dǎo)致人類多系統(tǒng)感染的腸道致病菌，尤其是引起嬰幼兒的腹瀉，成人的腸道及泌尿系統(tǒng)感染。自七十年代以來，EPEC 已成為醫(yī)院獲得性感染中一種活躍的病原微生物。致病性大腸桿菌是嬰兒腹瀉的主要病原菌，不產(chǎn)生毒素，有高度傳染性，嚴(yán)重者可致死，成人少見。致病性大腸桿菌根據(jù)是否含有EPEC黏附因子(EPEC adherence factor, EAF)的質(zhì)粒而被分成典型致病性大腸桿菌 (typical EPEC)和非典型致病性大腸桿菌(atypical EPEC)。非典型致病性大腸桿菌既可以感染人也可以感染牲畜；典型致病性大腸桿菌以人為唯一宿主，而且多見于發(fā)展中國家， 發(fā)達(dá)國家較少見。目前對(duì)該致病性大腸桿菌監(jiān)控方法一般是采用國際上通用的培養(yǎng)法，也即是國際上通用的鑒定細(xì)菌的方法，其具體的方法步驟如下(I)增菌樣品采集后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。除了易腐食品在檢驗(yàn)之前應(yīng)預(yù)冷藏外，一般不冷藏。以無菌手續(xù)稱取檢驗(yàn)25g，加在225mL營養(yǎng)肉湯中，以均質(zhì)器打碎Imin或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養(yǎng)基，以測(cè)定大腸菌群MPN，其余的移入500mL廣口瓶?jī)?nèi)，于 36± 1°C培養(yǎng)6h。挑取I環(huán),接種于I管30mL腸道菌增菌肉湯內(nèi)，于42°C培養(yǎng)18h。(2)分離將乳糖發(fā)酵陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板；污染嚴(yán)重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)平板，于36土 1°C 培養(yǎng)18 24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。(3)生化試驗(yàn)①自鑒別平板上直接挑取數(shù)個(gè)菌落分別接種三糖鐵瓊脂(TSI)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、PH7. 2尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36 °C培養(yǎng)過夜。②TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸桿菌。 TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN、尿素有任一項(xiàng)為陽性的培養(yǎng)物，均非大腸桿菌。必要時(shí)做氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。(4)血清學(xué)試驗(yàn)用致病性大腸桿菌多價(jià)O血清做玻片凝集試驗(yàn)，如呈現(xiàn)強(qiáng)凝集反應(yīng)，即為試驗(yàn)陽性。(5)結(jié)果報(bào)告
綜合以上生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)作出報(bào)告。但是上述傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測(cè)致病性大腸桿菌存在周期長(至少48小時(shí)以上操作煩瑣、靈敏度低、易污染、程序復(fù)雜和所需試劑(生化試驗(yàn)試劑和血清)繁多等缺點(diǎn)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足快速檢測(cè)致病性大腸桿菌的要求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種靈敏度高，且能安全、快速檢測(cè)的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種方法簡(jiǎn)單，誤差小，準(zhǔn)確度高的致病性大腸桿菌檢測(cè)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和穩(wěn)定液，所述第一反應(yīng)液包括致病性大腸桿菌第一上游引物、第一下游引物和第一探針以及第二上游引物、第二下游引物和第二探針；其中，所述第一上游引物為5’-GATCCCGTATTAAGCCAGTC-3’ ；所述第一下游引物為5’-GAATTTGACTTCCGGTACT-3’ ；所述第一探針為5’ - (FAM) TTGGGAGAAATGGGGTAATG (DABCYL) -3，；所述第二上游引物為5’-ATTACTCATGGTTGTTATACC-3’所述第二下游引物為5’-TAGCTATCATGAGTTAACAGTT-3’所述第二探針為5’- (HEX) TGTTAATCAGAATTCAITTGCAA (DABCYL) -3’。以及，一種致病性大腸桿菌檢測(cè)方法，包括如下步驟獲取致病性大腸桿菌的DNA樣品；進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，所述熒光定量PCR檢測(cè)步驟中使用前述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)標(biāo)本，僅需5小時(shí)即可完成檢測(cè)，同時(shí)采用熒光定量PCR方法檢測(cè)致病性大腸桿菌特異性較強(qiáng)，有效克服了致病性大腸桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法中存在的周期長、操作煩瑣、靈敏度低、易污染、程序復(fù)雜和所需試劑(生化試驗(yàn)試劑和血清)繁多等缺點(diǎn)。本發(fā)明致病性大腸桿菌檢測(cè)方只需獲取致病性大腸桿菌的DNA樣品，并采用上述致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)即可，方法簡(jiǎn)單，誤差小，準(zhǔn)確度高。
圖I為本發(fā)明實(shí)施例使用Ct值的示意性圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例致病性大腸桿菌檢測(cè)方法的流程圖；圖3為使用本發(fā)明實(shí)施例I的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的陽性結(jié)果；圖4為使用本發(fā)明實(shí)施例I的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的陰性結(jié)果；圖5是本發(fā)明實(shí)施例I致病性大腸桿菌檢測(cè)方法中陽性對(duì)照PCR擴(kuò)增圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例I致病性大腸桿菌檢測(cè)方法中陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。其基本原理為在PCR反應(yīng)體系中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行， PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，見圖I。 PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可進(jìn)行定量分析。基于該理論，本發(fā)明實(shí)施例開發(fā)并提供了一種致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，包括 PCR反應(yīng)液，該P(yáng)CR反應(yīng)液包括第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和穩(wěn)定液，該第一反應(yīng)液包括致病性大腸桿菌第一上游引物、第一下游引物和第一探針以及第二上游引物、第二下游引物和
第二探針；其中，
第一上游引物序列如SEQ ID NO1所示
5， -GATCCCGTATTAAGCCAGTC-3，；
第一下游引物序列如SEQ ID NO2所示
5’ -GAATTTGACTTCCGGTACT-3’ ；
第一探針序列如SEQ ID NO 3所示
5，- (FAM)TTGGGAGAAATGGGGTAATG(DABCYL)-3，；
第二上游引物如SEQ ID NO :4所示
5’ -ATTACTCATGGTTGTTATACC-3’
第二下游引物如SEQ ID NO 5所示
5’ -TAGCTATCATGAGTTAACAGTT-3’
第二探針如SEQ ID NO 6所示
5 ’ -(HEX)TGTTAATCAGAATTCAITTGCAA (DABCYL)-3’。
本發(fā)明致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)致病性大腸桿菌具有快速、靈敏、安全等
優(yōu)點(diǎn)，有效克服了致病性大腸桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法中存在的周期長、操作煩瑣、靈敏度低、易污染、程序復(fù)雜和所需試劑(生化試驗(yàn)試劑和血清)繁多等缺點(diǎn)。優(yōu)選地，作為本發(fā)明的實(shí)施例，上述第一反應(yīng)液還包括滅菌超純水、緩沖液、氯化鎂、dNTPs。第二反應(yīng)液包括DNA聚合酶、滅菌超純水及顯色液。具體的，上述第一反應(yīng)液中的滅菌超純水、緩沖液、氯化鎂、dNTPs、第一上游引物、 第一下游引物、第一探針、第二上游引物、第二下游引物和第二探針的體積含量?jī)?yōu)選如下緩沖劑2~4 0/管
氯化鎂2 ~ 4 0 /管
dNTPs2~ 4 id/f
第一上游引物0.1 ~ 0.2 0/管
第一下游引物0.1 ~ 0.2 0/管
第一探針0.1~0.20/管
第二上游引物0.1 ~ 0.2 0/管
第二下游引物0.1 ~ 0.2 0/管
第二探針0.1~0.20/管
滅菌超純水 11.4~4.8 0/管。上述第二反應(yīng)液各組分體積優(yōu)選為DNA 聚合酶 0. 15 0. 3 u 1/ 管顯色液0. 01 0. 02 u 1/ 管滅菌超純水1. 84 1. 68 ii 1/管。其中，第一反應(yīng)液中的該緩沖液優(yōu)選為10XBuffer (寶生物工程(大連)有限公 司)，其不含有鎂離子，體積更優(yōu)選為2. 5 yl/管；氯化鎂的濃度優(yōu)選為25mM，體積更優(yōu)選 為3. 5 ill/管；dNTPs的體積更優(yōu)選為2. 0 ill/管(濃度2. 5mM);第一上游引物的濃度優(yōu) 選為50yM，體積更優(yōu)選為0. lyl/管；第一下游引物的濃度優(yōu)選為50yM，體積更優(yōu)選為 0. lii 1/管；第一探針的濃度為優(yōu)選50iiM，體積更優(yōu)選為0. lii 1/管；第二上游引物的濃 度優(yōu)選為50yM，體積更優(yōu)選為0. lyl/管；第二下游引物的濃度優(yōu)選為50 yM，體積更優(yōu)選 為0. 1 y 1/管；第二探針的濃度優(yōu)選為50 u M,體積更優(yōu)選為0. 1 y 1/管。第二反應(yīng)液中的DNA聚合酶優(yōu)選為普通Taq酶，其濃度優(yōu)選為5U/ul，體積更優(yōu)選 為0. 2 yl/管；顯色液優(yōu)選為溴酚蘭，其體積更優(yōu)選為0. 02 yl/管。該優(yōu)選的DNA聚合酶 能有效使得PCR的反應(yīng)簡(jiǎn)捷、降低成本。優(yōu)選地，作為本發(fā)明的實(shí)施例，上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟，更優(yōu)選為固體石蠟(熔點(diǎn) 高于50°C)與液體石蠟的比值為1 : 4 12 (w/v)的石臘，其體積優(yōu)選為20 25 ill/管， 更優(yōu)選為20iU/管。通過該優(yōu)選石蠟穩(wěn)定液將上述第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液分隔開，從而 使得第二反應(yīng)液中的DNA聚合酶尤其是Taq酶與第一反應(yīng)液分離，有效保證了 DNA聚合酶 的活性，延長了本發(fā)明試劑盒的保存時(shí)間。其中，該第一反應(yīng)液位于石蠟的下層，第二反應(yīng) 液位于石蠟的上層。在PCR反應(yīng)過程中，由于溫度在95°C，石蠟熔融，使得第一反應(yīng)液和第 二反應(yīng)液混合，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行。該優(yōu)選石蠟的具體內(nèi)容見專利(200910190112. 7)。進(jìn)一步優(yōu)選地，上述致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒還包括致病性大腸桿菌DNA提取 液、致病性大腸桿菌的陰性對(duì)照液和陽性對(duì)照品。該致病性大腸桿菌DNA提取液可方便致頁
病性大腸桿菌的DNA提??；該陰性和陽性對(duì)照可用于檢測(cè)時(shí)的自我檢驗(yàn)，防止檢出誤差的出現(xiàn)。請(qǐng)參閱圖I和圖2，圖I顯示試劑盒中陽性對(duì)照的PCR擴(kuò)增圖譜，圖2顯示試劑盒中陰性對(duì)照的PCR擴(kuò)增圖譜。該致病性大腸桿菌DNA提取液具體成分為Tris_EDTA緩沖液(0.01 O. 02M pH8. O)，含O. 01 O. 02% NP-40。該DNA提取液可以設(shè)置成5ml/管，采用5ml普通離心管 (配藍(lán)色蓋)。該陰性對(duì)照液不含有致病性大腸桿菌基因的Tr i s-EDTA緩沖液，其濃度為
O.OlM O. 015M，pH為8. 00 8. 02，如濃度為O. 01M, ρΗ8· O。該陰性對(duì)照液可以設(shè)置成 40 μ I/管，采用O. 6ml普通離心管(紫色透明)。該陽性對(duì)照品為使用致病性大腸桿菌和/或致病性大腸桿菌DNA提取制備的DNA 陽性模板，該陽性對(duì)照品可以設(shè)置成40μ I/管，采用O. 6ml普通離心管(橙紅色透明)。進(jìn)行PCR時(shí)，將該陽性對(duì)照品使用Tris-EDTA緩沖液(O. OlM pH8. O)稀釋后冷凍保存。由上述，上述致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒的規(guī)格優(yōu)選如下陰性對(duì)照的規(guī)格為I管，40μ I/管；陽性對(duì)照的規(guī)格為I管，40 μ I/管；DNA提取液的規(guī)格為I管，5ml/管；PCR反應(yīng)液為8管/條X6條，20 μ I/管(不包含穩(wěn)定液石蠟體積)。當(dāng)然，根據(jù)致病性大腸桿菌檢測(cè)的量，可以對(duì)該致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒的規(guī)格進(jìn)行適應(yīng)的增大或縮少。本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步提供一種致病性大腸桿菌檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的流程圖如圖2，包括如下步驟步驟SOl，增菌培養(yǎng)和標(biāo)本處理 提供致病性大腸桿菌的DNA樣品；步驟S02，實(shí)時(shí)熒光PCR 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，該熒光定量PCR檢測(cè)步驟中使用上述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒。具體地，步驟SOl在無菌條件下操作。該步驟SOl中，采集樣本，該樣本中可能含有致病性大腸桿菌，也可能不含有，需要本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)確定。因此，本步驟SOl中，致病性大腸桿菌的DNA樣品中可能含有致病性大腸桿菌的DNA，也可能不含有。將采集后的標(biāo)本放置37°C恒溫室內(nèi)進(jìn)行3小時(shí)增菌培養(yǎng)；然后在進(jìn)行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反復(fù)抽吸3次充分混勻標(biāo)本。具體地，步驟S02中，取步驟SOl中所得到的上清液，進(jìn)行熒光定量PCR分析，本步驟中所使用的熒光定量PCR設(shè)備沒有限制，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2) >Stratagene MX系列、Roche LightCycler、Cepheid SmartCycIer>Corbett Rotor-Gene> 杭州博日系列等。步驟S02中PCR反應(yīng)的條件為50 55 O2 5min
94 952 3min
94 955 IOS ；
55 60 °C :40 80S ； (35 40 循環(huán))。優(yōu)選地，在上述實(shí)施例致病性大腸桿菌檢測(cè)方法中，毎次檢測(cè)還均設(shè)置試劑盒中 的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的步驟。這樣，自我檢驗(yàn)，防止檢出誤差的出現(xiàn)。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述致病性大腸桿菌檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒的制備(I)按以下序列合成引物探針第一上游引物(37F)為5’-GATCCCGTATTAAGCCAGTC-3’ ；第一下游引物為(37R):5’ -GAATTTGACTTCCGGTACT-3’ ；第一探針(37A)為5，- (FAM)TTGGGAGAAATGGGGTAATG(DABCYL)-3，；第二上游引物(38F)為5’-ATTACTCATGGITGTTATACC-3’第二下游引物(38R)為5，-TAGCTATCATGAGTTAACAGIT-3，第二探針(38H)為5，-(HEX)TGTTAATCAGAATTCATTTGCAA(DABCYL)-3，。(2)配制含引物探針的PCR反應(yīng)液先配制第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液的配制，再將第一反應(yīng)液加入PCR反應(yīng)液管內(nèi)，接 著在第二反應(yīng)液面上加入20微升/管的石蠟，待石蠟冷凝后，在石蠟液面上加入第二反應(yīng) 液，PCR反應(yīng)液管規(guī)格為8管/條X 6條,20 ii I/管(20 ii I/管是第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液 的體積，石蠟不計(jì)其內(nèi))；其中，第一反應(yīng)液組分的體積如下
IOxBuffer (不含有鎂離子) 2.5微升/管 氯化鎂(25mM)3.5微升/管
dNTPs2.0微升/管
第一上游引物(50pM)0.1微升/管
第一下游引物(50pM)0.1微升/管
第ー探針(50^iM)0.06微升/管
第二上游引物(50pM)0.1微升/管
第二下游引物(50pM)0.1微升/管
第ニ探針(50^iM)0.1微升/管
滅菌超純水9.44微升/管；第二反應(yīng)液組分的體積如下Taq 酶0. 2 微升/管
溴酚蘭0.02微升/管滅菌超純水1. 78微升/管；(3)配制 DNA 提取液0.01M Tris-EDTA 緩沖液，pH8. 0，含 0. 01 % NP-40，置于 DNA 提取液管內(nèi)，規(guī)格1管，5ml/管；(4)陽性對(duì)照DNA :提取致病性大腸桿菌基因組DNA，置于EPEC陽性對(duì)照管內(nèi)，規(guī) 格1管，40 yl/管；(4)陰性對(duì)照液不含有致病性大腸桿菌基因的Tri s-EDTA緩沖液(0. 01M pH8. 0)，規(guī)格 1 管,40ii 1/ 管。實(shí)施例2采用上述實(shí)施例1的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒對(duì)致病性大腸桿菌檢測(cè)方法包 括如下步驟1.檢測(cè)組采集致病性大腸桿菌的樣本，該樣本數(shù)為22個(gè),其中一些樣本中含有 致病性大腸桿菌，一些樣本沒有致病性大腸桿菌。將采集后的標(biāo)本放置37°C恒溫室內(nèi)進(jìn)行 3小時(shí)增菌培養(yǎng)；然后在進(jìn)行如下DNA裂解處理取1ml增菌液加入DNA提取液50 u L，反復(fù)抽吸3次充分混勻標(biāo)本，得到致病性大 腸桿菌的DNA樣品；取5 yl所得的DNA樣品，在檢測(cè)反應(yīng)器中加入到18 u 1含引物探針的 PCR反應(yīng)液中；2.陰性對(duì)照組:取5 ill Tri s-EDTA緩沖液(0. 01M pH8. 0)，加入至18 u 1含引物 探針的PCR反應(yīng)液中，該含引物探針的PCR反應(yīng)液與步驟1相同；3.陽性對(duì)照組取5iil陽性對(duì)照DNA，加入至18iU含引物探針的PCR反應(yīng)液中， 該含引物探針的PCR反應(yīng)液與步驟1相同；4.將步驟1-3所得的各組混合物同時(shí)放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，熒光定量 PCR反應(yīng)條件為50-55 °C 2-5min ；94-95 °C 2-3min ；94-95°C 5-10S ；55-60。。40-80S ； (35 循環(huán))。根據(jù)擴(kuò)增圖譜判定結(jié)果，參見圖3至圖6，其中圖3為檢測(cè)組中致病性大腸桿菌陽性結(jié)果擴(kuò)增曲線圖Ct值< 35，并有明顯指數(shù) 增長；圖4為檢測(cè)組中致病性大腸桿菌陰性結(jié)果擴(kuò)增曲線圖Ct值> 35或無Ct值。圖5為陽性對(duì)照組PCR擴(kuò)增圖，圖6為陰性對(duì)照組PCR擴(kuò)增圖。實(shí)施例3本發(fā)明實(shí)施例致病性大腸桿菌檢測(cè)方法包括如下步驟1.采集致病性大腸桿菌的樣本，該樣本數(shù)為22個(gè)，其中一些樣本中含有致病性大 腸桿菌，一些樣本沒有致病性大腸桿菌。將采集后的標(biāo)本放置37°C恒溫室內(nèi)進(jìn)行3小時(shí)增 菌培養(yǎng)；然后在進(jìn)行如下DNA裂解處理取1ml增菌液加入DNA提取液50 u L，反復(fù)抽吸3次充分混勻標(biāo)本，得到致病性大 腸桿菌的DNA樣品；
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
2.取上述PCR反應(yīng)液，該P(yáng)CR反應(yīng)液中各個(gè)組分為
第一反應(yīng)液
IOxBuffer (不含有鎂離子) 2.0微升/管氯化鎂(25mM)3.0微升/管
dNTPs
第一上游引物(50μΜ) 第一下游引物(50μΜ) 第一探針(50μΜ ) 第二上游引物(50μΜ) 第二下游引物(50μΜ) 第二探針(50μΜ )
滅菌超純水
石蟲普
第二反應(yīng)液 Taq酶溴酚蘭滅菌超純水
4.0微升/管 0.2微升/管 0.2微升/管 0.1微升/管 0.2微升/管 0.2微升/管 0.1微升/管 8.0微升/管; 20微升/管
O. 15升/管
0.01微升/管
1.84微升/管c
在如下條件下進(jìn)行實(shí)施熒光定量PCR反應(yīng)，并進(jìn)行檢測(cè) 50-550C 2-5min ；
94-95°C 2-3min ；
94-95°C 5-10S ；
0138]55-60 °C 40-80S ； (40 循環(huán))。
0139]對(duì)比實(shí)例
0140]本對(duì)比實(shí)例致病性大腸桿菌檢測(cè)方法包括如下步驟
0141]I、采集含有致病性大腸桿菌的樣本，該對(duì)比例的樣本和實(shí)施例一的樣本一致，將采集后的標(biāo)本放置37°C恒溫室內(nèi)進(jìn)行3小時(shí)增菌培養(yǎng)；然后在進(jìn)行如下DNA裂解處理
0142]取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反復(fù)抽吸3次充分混勻標(biāo)本，得到致病性大腸桿菌的DNA樣品；
0143]2、按照前面背景技術(shù)所講的國際通用方法進(jìn)行檢測(cè)。
0144]請(qǐng)參閱下表，下表顯示應(yīng)用實(shí)施例2和對(duì)比實(shí)例的方法檢測(cè)22例樣本的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和穩(wěn)定液，所述第一反應(yīng)液包括致病性大腸桿菌第一上游引物、 第一下游引物和第一探針以及第二上游引物、第二下游引物和第二探針；其中，所述第一上游引物為5’ -GATCCCGTATTAAGCCAGTC-3’ ；所述第一下游引物為5’ -GAATTTGACTTCCGGTACT-3’ ；所述第一探針為5 ’ - (FAM) TTGGGAGAAATGGGGTAATG (DABCYL) -3，；所述第二上游引物為5’ -ATTACTCATGGTTGTTATACC-3’所述第二下游引物為5’ -TAGCTATCATGAGTTAACAGTT-3’所述第二探針為5’ - (HEX) TGTTAATCAGAATTCAITTGCAA (DABCYL)-3’。
2.如權(quán)利要求I所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一反應(yīng)液還包括滅菌超純水、緩沖液、氯化鎂、dNTPs。
3.如權(quán)利要求2所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述滅菌超純水、緩沖液、氯化鎂、dNTPs、第一上游引物、第一下游引物、第一探針、第二上游引物、第二下游引物和第二探針的體積含量如下
4.如權(quán)利要求I所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第二反應(yīng)液包括DNA聚合酶、滅菌超純水及顯色液。
5.如權(quán)利要求4所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第二反應(yīng)液各組分體積為DNA聚合酶 O. 15 0.3微升/管顯色液 0.01 O. 02微升/管滅菌超純水I. 84 I. 68 μ I/管。
6.如權(quán)利要求4所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為 Taq酶，顯色液為溴酚藍(lán)。
7.如權(quán)利要求I 4任一所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述穩(wěn)定液為石蠟，所述第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液通過所述石蠟分隔開，所述第一反應(yīng)液位于石蠟的下層，所述第二反應(yīng)液位于石蠟的上層。
8.如權(quán)利要求I 4任一所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括致病性大腸桿菌的陰性對(duì)照液和陽性對(duì)照品，所述陰性對(duì)照液不含有致病性大腸桿菌基因的 Tris-EDTA 緩沖液，其濃度為 O. OlM- O. 015M, pH 為 8. 00 8. 02 ；所述陽性對(duì)照品為使用致病性大腸桿菌和/或致病性大腸桿菌DNA提取制備的DNA陽性模板。
9.一種致病性大腸桿菌檢測(cè)方法，包括如下步驟獲取致病性大腸桿菌的DNA樣品；進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，所述熒光定量PCR檢測(cè)步驟中使用如權(quán)利要求I 8任一項(xiàng)所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒。
10.如權(quán)利要求9所述的致病性大腸桿菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為50 55。。2 5min94 95。。2 3min94 95。。5 IOS ；55 60。。40 --80S35 40循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明適用于微生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒及致病性大腸桿菌檢測(cè)方法。該試劑盒包括含有引物與熒光探針的PCR反應(yīng)液。本發(fā)明致病性大腸桿菌檢測(cè)試劑盒及致病性大腸桿菌檢測(cè)方法能與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比具有快速、靈敏、安全等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于致病性大腸桿菌的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102605068SQ201210068159
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者盧柳燕, 吳成貢, 汪再興, 田仁鵬, 黃娟, 龔劍 申請(qǐng)人:深圳市生科源技術(shù)有限公司