專利名稱：粘附性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種粘附性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
粘附性大腸桿菌(enteroadhesive E. Coli,EAEC)是近年來才熟知,具體致病的血清型尚未完全清楚。EAEC不侵入腸上皮細胞，不產(chǎn)生腸毒素LT、ST或志賀樣毒素，因此不引起組織損傷。唯一特征為具有與Hep-2細胞粘附的能力。EAEC多侵犯小兒，流行中以小兒為主，成人亦可發(fā)病，易引起腹瀉遷延慢性化。臨床表現(xiàn)多無發(fā)熱，腹瀉3 5次/日，大便多為稀蛋花樣或帶奶瓣樣，量多，嚴重者可出現(xiàn)腸麻痹和粘液血樣大便。 國際上通用的粘附性大腸桿菌采用培養(yǎng)檢測如下(I)增菌樣品采集后應盡快檢驗。除了易腐食品在檢驗之前應預冷藏外，一般不冷藏。以無菌手續(xù)稱取檢驗25g，加在225mL營養(yǎng)肉湯中，以均質器打碎Imin或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養(yǎng)基，以測定大腸菌群MPN，其余的移入500mL廣口瓶內，于36± 1°C培養(yǎng)6h。挑取I環(huán),接種于I管30mL腸道菌增菌肉湯內，于42°C培養(yǎng)18h。(2)分離將乳糖發(fā)酵陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍瓊脂平板；污染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍平板，于36土 1°C培養(yǎng)18 24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時也要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。(3)生化試驗①自鑒別平板上直接挑取數(shù)個菌落分別接種三糖鐵瓊脂(TSI)或克氏雙糖鐵瓊月旨(KI)。同時將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、PH7. 2尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36 °C培養(yǎng)過液。②TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸桿菌。TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽性的培養(yǎng)物，均非大腸桿菌。必要時做氧化酶試驗和革蘭氏染色。(4)血清學試驗用粘附性大腸桿菌多價O血清做玻片凝集試驗，如呈現(xiàn)強凝集反應，即為試驗陽性。(5)結果報告綜合以上生化試驗、血清學試驗作出報告。根據(jù)上述通用方法，同時檢測樣品中粘附性大腸桿菌這三種細菌的周期長(至少48小時)、操作煩瑣、靈敏度低、易污染、程序復雜和所需試劑(生化試驗試劑和血清)繁多等缺點已遠遠不能滿足快速檢測粘附性大腸桿菌的要求。
發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，解決現(xiàn)有技術中同時檢測粘附性大腸桿菌靈敏的低，周期長等技術問題，以及粘附性大腸桿菌的檢測方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液，所述PCR反應液包括第一反應液、第二反應液及石蠟，所述第一反應液中包括粘附性大腸桿菌第一引物、粘附性大腸桿菌第二引物、粘附性大腸桿菌探針，所述粘附性大腸桿菌第一引物序列如SEQ IDNO :1所示，粘附性大腸桿菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，粘附性大腸桿菌探針序列如 SEQ ID NO 3 所示。本發(fā)明進一步提供一種粘附性大腸桿菌檢測方法，包括如下步驟提供粘附性大腸桿菌的DNA樣品； 進行熒光定量PCR檢測，該熒光定量PCR檢測步驟中使用前述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒。本發(fā)明粘附性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測方法能同時檢測粘附性大腸桿菌，不用對待測樣品進行長時間的增菌培養(yǎng)，同時加入有檢測引物和探針，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比具有快速、靈敏、安全等優(yōu)點，可應用于粘附性大腸桿菌的檢測。
圖I是本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測試劑盒中陽性對照PCR擴增圖；圖2是本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測試劑盒陰性對照PCR擴增圖；圖3是本發(fā)明實施例一粘附性大腸桿菌檢測試方法中陽性樣本PCR擴增圖；圖4是本發(fā)明實施例一粘附性大腸桿菌檢測試方法中陰性樣本PCR擴增圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實時熒光定量PCR在基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領域都有廣泛應用。其基本原理為在PCR反應體系中引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號強度，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，可進行定量分析。本發(fā)明實施例提供一種粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液，所述PCR反應液包括第一反應液、第二反應液及石蠟，所述第一反應液中包括粘附性大腸桿菌第一引物、粘附性大腸桿菌第二引物、粘附性大腸桿菌探針，所述粘附性大腸桿菌第一引物序列如SEQ ID NO :1所示，粘附性大腸桿菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，粘附性大腸桿菌探針序列如SEQ ID N0:3所示。具體地，本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，其中包括DNA提取液、PCR反應液，可以同時進行粘附性大腸桿菌的檢測；該試劑盒中還包括粘附性大腸桿菌陰性對照，陽性對照。試劑盒的規(guī)格陰性對照的規(guī)格為I管，40μ I/管，陰性對照的規(guī)格為I管，40μ I/管，DNA提取液為5ml/管(I管)，PCR反應液為8管/條X6條，20 μ I/管。該陰性對照為不含有粘附性大腸桿菌基因的Tris-EDTA緩沖液(O. OlM ρΗ8. O)；還包括粘附性大腸桿菌陽性對照，該陽性對照為使用粘附性大腸桿菌和DNA提取制備的陽性模板對照品，使用Tris-EDTA緩沖液(O. OlM ρΗ8. O)稀釋后冷凍保存。該陰性和陽性對照用于檢測時的自我檢驗，防止檢出誤差的出現(xiàn)。請參閱圖I和圖2，圖I顯示試劑盒中陽性對照的PCR擴增圖譜，圖2顯示試劑盒中陰性對照的PCR擴增圖譜。 具體地，該DNA提取液(用于提取DNA)具體成分為Tris_EDTA緩沖液(O. OlMpH8. O)，含 O. 01% NP-40。具體地,該PCR反應液包括第一反應、第二反應液及石蠟,該第一反應液和第二反應液通過石蠟實現(xiàn)分隔，在PCR反應過程中，由于溫度在95°C，石蠟融化，第一反應液和第二反應液混合，PCR反應得以進行，該石蠟的具體內容見專利(200910190112. 7)。該PCR反應試劑存放于普通離心管中，該第一反應液位于下端，石蠟位于中間，該第二反應液位于石蠟上面。具體地，該第一反應液包括緩沖液，氯化鎂，dNTPs，粘附性大腸桿菌第一引物、粘附性大腸桿菌第二引物、粘附性大腸桿菌探針，以及，滅菌超純水，第一反應液的總體積為
18微升/管。該緩沖液為lOXBuffer，該緩沖液中不含有鎂離子(寶生物工程(大連)有限公司)。該緩沖液的體積為2 4微升/管；該該氯化鎂的濃度為25mM，該氯化鎂的體積為2 4微升/管；該dNTPs的濃度為2. 5mM,體積為2 4微升/管；該粘附性大腸桿菌第一引物的濃度為50 μ Μ，體積為O. I O. 2微升/管，例如O. 15微升/管,該粘附性大腸桿菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所不，具體為5’ -CA TGTGAGAATG ATATGAAAT-3’ -；該粘附性大腸桿菌第二引物的濃度為50 μ Μ，體積為O. I O. 2微升/管，例如O. 15微升/管，該粘附性大腸桿菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，具體為5’ -TACAATTAGATGTATATAGTA-3’ ；該粘附性大腸桿菌探針的濃度為50 μ Μ，體積為O. I O. 2微升/管，例如O. 15微升/管，該粘附性大腸桿菌探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，具體為5’ -(FAM)ATTAACAAT ATCAGAATAC ATC (DABCYL)-3’ ；該滅菌超純水的量為5. 4 11. 7微升/管，實現(xiàn)第一反應液的總體積為18微升/管。具體地,該第二反應液包括Taq酶、顯色劑及滅菌超純水,該第二反應液的總體積為2微升/管。該Taq酶的體積為O. 15-0. 3微升/管，顯色劑的體積為O. 01-0. 02微升/管，該滅菌超純水的量為I. 84 I. 68微升/管，該顯色劑例如，溴酚蘭。使第二反應液的體積滿足2微升/管。具體地，該石蠟的體積為20微升/管。本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測試劑盒能檢測粘附性大腸桿菌，不用對待測樣品進行長時間的增菌培養(yǎng)，同時加入有檢測引物和探針，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比具有快速、靈敏、安全等優(yōu)點，可應用于粘附性大腸桿菌的檢測。本發(fā)明實施例進一步提供一種粘附性大腸桿菌檢測方法，包括如下步驟步驟SOl，增菌培養(yǎng)和標本處理 提供粘附性大腸桿菌的DNA樣品；步驟S02，實時熒光PCR
進行實時熒光定量PCR檢測，該熒光定量PCR檢測步驟中使用上述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒。具體地，步驟SOl在無菌條件下操作。具體地，步驟SOl中，采集樣本，該樣本中可能含有粘附性大腸桿菌，也可能不含有，需要本發(fā)明實施例的檢測方法進行檢測確定。因此，本步驟SOl中，粘附性大腸桿菌的DNA樣品中可能含有粘附性大腸桿菌的DNA，也可能不含有。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養(yǎng)；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反復抽吸3次充分混勻標本。具體地，步驟S02中，取步驟SOl中所得到的上清液，進行熒光定量PCR分析，本步驟中所使用的熒光定量PCR設備沒有限制，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon2) >Stratagene MX系列、Roche LightCycler、Cepheid SmartCycIer>Corbett Rotor-Gene>杭州博日系列。步驟S02中PCR反應的條件為50-550C 2-5min ；94-95 °C 2-3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循環(huán))。本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測方法中，每次檢測都設置試劑盒中的陽性對照和陰性對照，以防止檢測過程中的污染出現(xiàn)。以下結合具體實施例對上述粘附性大腸桿菌檢測方法進行詳細說明。實施例一本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測方法包括如下步驟I、采集粘附性大腸桿菌的樣本，該樣本數(shù)為20個，其中一些樣本中含有粘附性大腸桿菌，一些樣本沒有粘附性大腸桿菌。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養(yǎng)；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反復抽吸3次充分混勻標本，得到粘附性大腸桿菌的DNA樣品；2、取上述PCR反應液，該PCR反應液中各個組分為第一反應液緩沖劑2微升/管
氯化鎂2微升/管
dNTPs2微升/管 粘附性大腸桿菌第一引物 0.1微升/管 粘附性大腸桿菌第二引物 0.1微升/管 粘附性大腸桿菌探針 0.1微升/管
滅菌超純水11.4微升/管；
石蠟20微升/管第二反應液Taq 酶O. 15 微升 / 管顯色劑 O. 01微升/管滅菌超純水I. 84微升/管；在如下條件下進行實施熒光定量PCR反應，并進行檢測50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C 5-10S, 55-60。。:40_80S ； (40 循環(huán))。實施例二本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測方法包括如下步驟I、采集粘附性大腸桿菌的樣本，該樣本數(shù)為20個，其中一些樣本中含有粘附性大腸桿菌，一些樣本沒有粘附性大腸桿菌。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養(yǎng)；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反復抽吸3次充分混勻標本，得到粘附性大腸桿菌的DNA樣品；2、取上述PCR反應液，該PCR反應液中各個組分為第一反應液緩沖劑3微升/管
氯化鎂3微升/管
dNTPs3微升/管
粘附性大腸桿菌第一引物0.15微升/管
粘附性大腸桿菌第二引物0.15微升/管
粘附性大腸桿菌探針0.15微升/管
滅菌超純水8.55微升/管；
石蠟20微升/管第二反應液Taq 酶O. 2 微升 / 管顯色劑O. 015微升/管滅菌超純水 I. 785微升/管；在如下條件下進行實施熒光定量PCR反應，并進行檢測50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循環(huán))。實施例三本發(fā)明實施例粘附性大腸桿菌檢測方法包括如下步驟I、采集粘附性大腸桿菌的樣本，該樣本數(shù)為20個，其中一些樣本中含有粘附性大腸桿菌，一些樣本沒有粘附性大腸桿菌。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養(yǎng)；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 μ L，反復抽吸3次充分混勻標本，得到粘附性大腸桿菌的DNA樣品；2、取上述PCR反應液，該PCR反應液中各個組分為第一反應液緩沖劑4微升/管
氯化鎂4微升/管
dNTPs4微升/管
粘附性大腸桿菌第一引物0.2微升/管
粘附性大腸桿菌第二引物0.2微升/
權利要求
1.一種粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括第一反應液、第二反應液及石蠟，所述第一反應液中包括粘附性大腸桿菌第一引物、粘附性大腸桿菌第二引物、粘附性大腸桿菌探針，所述粘附性大腸桿菌第一引物序列如SEQ ID NO :1所示，粘附性大腸桿菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，粘附性大腸桿菌探針序列如SEQ ID NO 3所示。
2.如權利要求I所述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應液和第二反應液通過所述石蠟分隔開。
3.如權利要求2所述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應液還包括滅菌超純水、緩沖液、氯化鎂、dNTPs。
4.如權利要求2所述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第二反應液包括Taq酶、滅菌超純水及顯色劑。
5.如權利要求3或4所述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應液各組分體積為緩沖劑2~4微升/管氯化鎂2 ~ 4微升/管dNTPs2~4微升/管粘附性大腸桿菌第一引物0.1 ~ 0.2微升/管粘附性大腸桿菌第二引物0.1 ~ 0.2微升/管粘附性大腸桿菌探針0.1 ~ 0.2微升/管滅菌超純水5.4 ~ 11.7微升/管。
6.如權利要求3或4所述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第二反應液各組分體積為 Taq酶O. 15 O. 3微升/管 顯色劑O. 01 O. 02微升/管 滅菌超純水 I. 84 I. 68微升/管。
7.一種粘附性大腸桿菌檢測方法，包括如下步驟 提供粘附性大腸桿菌的DNA樣品； 進行熒光定量PCR檢測，所述熒光定量PCR檢測步驟中使用如權利要求1-7任一項所述的粘附性大腸桿菌檢測試劑盒。
8.如權利要求7所述的粘附性大腸桿菌檢測方法，其特征在于，所述PCR反應條件為 50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10S ；55-60 °C 40-80S ； 40循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明適用于微生物技術領域，提供了一種粘附性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒包括DNA提取液、PCR反應液。本發(fā)明粘附性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測方法能同時檢測粘附性大腸桿菌，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比具有快速、靈敏、安全等優(yōu)點，可應用于粘附性大腸桿菌的檢測。
文檔編號C12Q1/10GK102758004SQ201210068098
公開日2012年10月31日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權日2012年3月15日
發(fā)明者盧柳燕, 吳成貢, 汪再興, 田仁鵬, 董紹旺, 黃娟, 龔劍 申請人:深圳市生科源技術有限公司