專利名稱：垃圾堆肥中蘇云金芽孢桿菌菌落的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種垃圾堆肥中蘇云金芽孢桿菌菌落的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
堆肥化(Composting)是指在有控制的條件下，使有機(jī)廢棄物在微生物(主要為細(xì)菌)作用下，發(fā)生降解，并同時(shí)使有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)方向轉(zhuǎn)化的過(guò)程。堆肥化后的產(chǎn)物稱之為堆肥(Compost)。堆肥過(guò)程可以將混合物的體積有效地減少40%-50%，并且可以依靠在高溫階段中代謝產(chǎn)生的熱量殺死垃圾中的病原物質(zhì)。堆肥不是一項(xiàng)新的技術(shù)，但用這種方法處理城市固體垃圾，符合環(huán)境的利益，因?yàn)樵诙逊蔬^(guò)程中清除或者減少了城市固體垃圾中的毒性并使得最終的產(chǎn)物可以被用來(lái)進(jìn)行再利用。堆肥的程序包括原料的預(yù)處理、原料發(fā)酵和后處理，堆肥過(guò)程受水分、氧含量、C/N比、溫度、pH和通風(fēng)情況等因素的影響。堆肥化過(guò)程的實(shí)質(zhì)是微生物在適宜條件下的代謝作用，在堆肥化過(guò)程中，生活垃圾中的可溶解有機(jī)物質(zhì)透過(guò)微生物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而被微生物所吸收，而微生物通過(guò)自身的生命活動(dòng)過(guò)程，把吸收的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)物。微生物在堆肥過(guò)程中扮演著重要角色， 與堆肥周期和堆肥質(zhì)量密切相關(guān)。因此，堆肥中微生物的研究對(duì)開發(fā)堆肥微生物資源，加速堆肥過(guò)程，減短堆肥周期，提高堆肥質(zhì)量都具有重要的意義。微生物種類繁多，自然界中僅有極少數(shù)的微生物得到鑒定，能夠存活、培養(yǎng)的種類更是少之又少，至多為微生物總量的1%。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于堆肥中的微生物進(jìn)行了一系列理論和實(shí)踐的研究。但是堆肥中存在著非常復(fù)雜的微生物體系，整個(gè)堆肥過(guò)程中的微生物結(jié)構(gòu)的變化和演替也非常巨大，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生理生化實(shí)驗(yàn)方法和手段難以完全認(rèn)識(shí)，但隨著研究手段的改善和研究方法的創(chuàng)新，分子生物學(xué)方法、雜交技術(shù)、PCR和DNA指紋等新技術(shù)的應(yīng)用，為堆肥微生物學(xué)的研究提供了新的途徑。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和研究手段，可以直接對(duì)堆肥微生物的總DNA進(jìn)行研究，突破了菌株分離和培養(yǎng)的限制，能夠動(dòng)態(tài)地研究微生物的群落多樣性，有利于更加深入的了解堆肥中的微生物群落，并可能發(fā)現(xiàn)新的微生物物種。蘇云金芽孢桿菌是目前國(guó)際上生產(chǎn)量最大并成功地用于防治農(nóng)、林、貯糧害蟲和一些衛(wèi)生害蟲的微生物殺蟲劑，蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的同時(shí)，可以形成一種由殺蟲晶體蛋白組成的伴孢晶體，它的主要?dú)⑾x活性成分是伴孢晶體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白對(duì)多種農(nóng)林害蟲具有特異性殺傷作用。昆蟲取食芽孢晶體混合物后，晶體在昆蟲體內(nèi)的中腸堿性環(huán)境和蛋白酶的作用下被降解形成殺蟲活性蛋白，研究結(jié)果表明這些毒蛋白單獨(dú)作用或不同蛋白間協(xié)同作用對(duì)昆蟲具有不同程度的毒殺作用，進(jìn)一步加強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌在防治和控制害蟲危害方面的研究，對(duì)于保護(hù)人類生存環(huán)境實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。近幾年來(lái)，由于化學(xué)制劑引起的環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重，以及人們環(huán)保意識(shí)的日益增強(qiáng)，利用微生物制劑作為化學(xué)農(nóng)藥的補(bǔ)充或替代品來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治植物病害，已經(jīng)成為當(dāng)前生防制劑開發(fā)的重點(diǎn)并引起人們的高度重視。研究發(fā)現(xiàn)，垃圾堆肥中微生物種類豐富、數(shù)量龐大，生長(zhǎng)活躍，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，將堆肥中部分微生物提取出來(lái)制成復(fù)合菌劑對(duì)草坪植物生長(zhǎng)、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收均有顯著地提高。本研究從堆肥懸濁液中取出部分懸濁液，在適合不同的菌株生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離，分離后的菌株分別進(jìn)行純化培養(yǎng)，從而將堆肥中有利于增強(qiáng)植物抗逆性的有益菌種進(jìn)行鑒定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用的蘇云金芽孢桿菌(拉丁名-.Bacillus thuringiensis )菌種保藏號(hào)CFCC10206，保藏單位中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，對(duì)外可以提供。生理生化特性細(xì)胞呈革蘭氏陽(yáng)性，桿狀，大小為1. 0-1. 2X3-5 μ m。形成半孢晶體，對(duì)阿拉伯糖甘露醇不產(chǎn)酸產(chǎn)淀粉酶，硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。蘇云金芽孢桿菌毒性對(duì)人、畜低毒，大鼠口服急性LD5tl 852. 7-856. 7毫克/公斤， 對(duì)家禽、鳥類、魚、畜等低毒。本發(fā)明公開了一種垃圾堆肥中蘇云金芽孢桿菌菌落的測(cè)定方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行
(1)將新鮮堆肥樣品稱取log，放入加有20粒玻璃珠的90ml無(wú)菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml 無(wú)菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成10_2、10_3、 10_4、10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；
(2)分別用移液槍吸取0.1毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板上，每一稀釋度重復(fù)三次，無(wú)菌水為空白對(duì)照；
(3)用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整個(gè)培養(yǎng)基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天；
(4)用接菌環(huán)直接挑起待分離純化的菌落，接種到事先準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基中，在平板上自左向右輕輕劃線，然后將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
(5)蘇云金芽孢桿菌的菌落計(jì)數(shù)方法先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)，若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)，選擇平均菌落數(shù)在3(Γ300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該樣品的微生物菌落總數(shù)。本發(fā)明更加詳細(xì)的測(cè)定方法如下 1實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)菌種分離自天津小淀垃圾堆肥處理廠的垃圾堆肥原料。采樣方式為選取適當(dāng)?shù)牟蓸拥攸c(diǎn)，人工撿去垃圾堆肥中的木頭、塑料、金屬等雜物，再用鐵鏟去去除表層堆肥，取深度為5-15cm處堆肥作為實(shí)驗(yàn)用樣品，放入樣品袋中扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間，地點(diǎn)等。將采集好的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，不能及時(shí)處理的樣品放入4°C冰箱中保存，按照同樣的采樣方法采集天津師范大學(xué)主校區(qū)校園園土作為對(duì)照。1.2實(shí)驗(yàn)方法
1. 2. 1堆肥微生物的分離蘇云金芽孢桿菌的分離采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，具體方法為將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無(wú)菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成10_2、10_3、10_4、10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液。分別用移液槍吸取0. 1毫升濃度為10-2、10-3、10-4、10_5、10-6稀釋液，注入到不同的平板培養(yǎng)基上，每一稀釋度重復(fù)三次，無(wú)菌水為空白對(duì)照。用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整個(gè)培養(yǎng)基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板倒置于37°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。1.2. 2菌種的純化
菌種的純化采用平板劃線分離的方法用接菌環(huán)直接挑起待分離純化的菌落，接種到事先準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基中，在平板上自左向右輕輕劃線，注意接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，劃線完畢，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2微生物菌落總數(shù)及鑒定結(jié)果
菌落計(jì)數(shù)方法先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2 以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)，選擇平均菌落數(shù)在3(Γ300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該樣品的微生物菌落總數(shù)。2. 1蘇云金芽孢桿菌的菌落總數(shù)表1蘇云金芽孢桿菌的菌落數(shù)(個(gè))
結(jié)論通過(guò)在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的蘇云金芽孢桿菌的菌落數(shù)情況可以看出， 堆肥中的蘇云金芽孢桿菌菌落數(shù)高于土壤對(duì)照，由于10_4倍濃度下的土壤中和10_5、10_6的濃度下堆肥和土壤中的菌落數(shù)均少于30，因此無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。
2. 2蘇云金芽孢桿菌的鑒定結(jié)果
在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上挑取與蘇云金芽孢桿菌相似的菌落，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基上形成的菌落為圓形，白色，邊緣光滑，不透明，革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體在顯微鏡下觀察呈橢圓形桿狀，芽孢為橢圓形，用溴酚藍(lán)和番紅染液進(jìn)行伴胞晶體染色，鏡下觀察到有紅色菌體，無(wú)色芽孢以及藍(lán)色伴孢晶體，初步鑒定其為蘇云金芽孢桿菌。
2. 3細(xì)菌的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
將初步鑒定為蘇云金芽孢桿菌的菌株定為測(cè)菌株，對(duì)其進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)，得到結(jié)果如下表
表2細(xì)菌的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種垃圾堆肥中蘇云金芽孢桿菌菌落的測(cè)定方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行(1)將新鮮堆肥樣品稱取log，放入加有20粒玻璃珠的90ml無(wú)菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml 無(wú)菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成10_2、10_3、 10_4、10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；(2)分別用移液槍吸取0.1毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板上；(3)用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整個(gè)培養(yǎng)基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天；(4)用接菌環(huán)直接挑起待分離純化的菌落，接種到事先準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基中，在平板上自左向右輕輕劃線，然后將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；(5)蘇云金芽孢桿菌的菌落計(jì)數(shù)方法先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)，若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)，選擇平均菌落數(shù)在3(Γ300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該樣品的微生物菌落總數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種垃圾堆肥中蘇云金芽孢桿菌菌落的測(cè)定方法，它是先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)，若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)，選擇平均菌落數(shù)在30~300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該樣品的微生物菌落總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在培養(yǎng)基上形成的菌落為圓形，白色，邊緣光滑，不透明，革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體在顯微鏡下觀察呈橢圓形桿狀，芽孢為橢圓形，用溴酚藍(lán)和番紅染液進(jìn)行伴胞晶體染色，鏡下觀察到有紅色菌體，無(wú)色芽孢以及藍(lán)色伴孢晶體，初步鑒定其為蘇云金芽孢桿菌。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102533934SQ20121005198
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者多立安, 程田, 趙樹蘭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)