來自丙酸梭菌的丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶的突變體和使用該突變體制備pla或pla共聚物的方法

專利名稱：來自丙酸梭菌的丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶的突變體和使用該突變體制備pla或pla共聚物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體，其能夠在使用微生物制備聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法中高效地將乳酸酯轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A。
背景技術(shù)：
聚乳酸酯(PLA)是一種源自乳酸酯的常見生物可降解聚合物，其極大地應(yīng)用于商業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。目前，雖然PLA的制備涉及微生物發(fā)酵制得的乳酸酯的聚合，但是通過乳酸酯的直接聚合僅僅制得具有大約1000 5000道爾頓的低分子量的PLA。為了合成具有100，000道爾頓以上分子量的PLA，可以使用鏈偶聯(lián)劑聚合由乳酸酯的直接聚合制得的具有低分子量的PLA。然而，在該方法中，由于不容易除去的有機(jī)溶劑或鏈偶聯(lián)劑的加入， 使整個過程變得復(fù)雜。目前，制備高分子量PLA的商業(yè)上可用的方法可包括將乳酸酯轉(zhuǎn)化成交酯并利用交酯環(huán)的開環(huán)縮聚作用合成PLA。在通過乳酸酯的化學(xué)合成來合成PLA時，PLA均聚物容易獲得，但是由多種類型的單體組成的PLA共聚物難以合成并且是商業(yè)上無法利用的。同時，聚羥基鏈烷酸酯(PHA)是一種在如磷⑵、氮(N)、鎂(Mg)和氧(O)等的其它營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而碳源過量時由微生物儲藏作為能量或碳源的聚酯。由于PHA與通常來自石油的合成聚合物具有相似的物理性質(zhì)，并且呈現(xiàn)出完全的生物降解性，所以其被認(rèn)為是常規(guī)合成塑料的替代品。為了使用微生物生產(chǎn)PHA，需要將微生物代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成PHA單體的酶和使用PHA 單體合成PHA聚合物的PHA合酶。當(dāng)使用微生物合成PLA和PLA共聚物時，需要相同的體系，并且除了用于提供羥酰輔酶A(其為PHA合酶的最初底物)的酶以外，還需要用于提供乳酰輔酶A的酶。因此，為了提供乳酰輔酶A，本發(fā)明人使用來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶和來自假單胞菌屬(Pseudomonas) sp. 6-19的使用丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶作為底物的PHA合酶的突變體，由此如在韓國專利申請第10-2006-0116234中所公開的那樣能夠成功地合成PLA和 PLA共聚物。然而，已報道，當(dāng)用非常強(qiáng)的啟動子在大腸桿菌中高表達(dá)來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(作為用于提供乳酰輔酶A的酶)時，會出現(xiàn)嚴(yán)重的代謝紊亂，由此抑制細(xì)胞生長(Selmer等人在Eur. J. Biochem. 269 :372，2002中報道)。此外，因?yàn)榫幋a來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因的密碼子選擇與大腸桿菌的完全不同，所以正常表達(dá)丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶會是非常困難的。因此，為了比常規(guī)系統(tǒng)更加有效地合成PLA和PLA共聚物，非常重要的是，引入平穩(wěn)地提供乳酰輔酶A并且在不會極大地抑制細(xì)胞生長的情況下充分表達(dá)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明旨在一種通過提供能夠有效地供應(yīng)乳酰輔酶A的提供單體的酶而高效地制備聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法。技術(shù)方案本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在使用來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體時，通過在不會極大地抑制細(xì)胞生長的情況下有效地提供乳酰輔酶A而可以高效地制備PLA或PLA共聚物。這一發(fā)現(xiàn)致使他們完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)镮78C、T669C、A1125G和T1158C的SEQ ID NO 3的基因序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)锳1200G的SEQ ID NO :3的基因序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)锳1200G的SEQ ID NO :3的基因序列和其中突變?yōu)镚ly335Asp的對應(yīng)于SEQ ID NO :3的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)門669C、A1125G和T1158C的SEQ ID NO 3的基因序列和其中突變?yōu)锳sp65Gly的對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)門669C、A1125G和T1158C的SEQ ID NO 3的基因序列和其中突變?yōu)锳sp65Asn的對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)門669C、A1125G和T1158C的SEQ ID NO 3的基因序列和其中突變?yōu)門hrl99Ile的對應(yīng)于SEQID NO 3的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)锳1200G的SEQ ID NO 3的基因序列和其中突變?yōu)锳la243Thr的對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)锳1200G的SEQ ID NO :3的基因序列和其中突變?yōu)锳sp257Asn的對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種用作提供乳酰輔酶A的酶的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體和編碼該突變體的基因，該突變體具有其中突變?yōu)镮78C、T669C、A1125G和T1158C的SEQ ID NO: 3的基因序列和其中突變?yōu)閂all93Ala的對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種用于合成聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的重組載體，該載體
6包含上述基因中的任一種。優(yōu)選地，所述用于合成聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的重組載體包含上述任一種編碼丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體的基因和SEQ ID NO :4的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶基因 (phaClPs6_19300)，該合酶能夠使用乳酰輔酶A作為底物合成PLA或PLA共聚物。本發(fā)明還提供了一種用上述重組載體中的一種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植物。在這種情況下，通過用一種上述重組載體轉(zhuǎn)化不含有丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因的細(xì)胞或植物獲得的細(xì)胞或植物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種制備聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法，該方法包括培養(yǎng)上述細(xì)胞或植物或者使上述細(xì)胞或植物生長。為了制備PLA共聚物，可以在包含羥基鏈烷酸酯的環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞或植物的培養(yǎng)和生長。所述羥基鏈烷酸酯可為選自3-羥丁酸酯、 3-羥戊酸酯、4-羥丁酸酯、具有6 14個碳原子的中鏈長(D)-3-羥基羧酸、2-羥基丙酸、 3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、 3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反式-己烯酸、3-羥基-4-順式-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反式-辛烯酸、3-羥基-6-順式-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順式-十二烯酸、3-羥基-6-順式-十二烯酸、3-羥基-5-順式-十四烯酸、3-羥基-7-順式-十四烯酸、3-羥基-5，8-順式-順式-十四烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋果酸、3-羥基琥珀酸-甲酯、3-羥基己二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-甲酯、3-羥基壬二酸-甲酯、3-羥基癸二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-乙酯、3-羥基癸二酸-乙酯、3-羥基庚二酸-丙酯、3-羥基癸二酸-芐酯、3-羥基-8-乙酰氧基辛酸、3-羥基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對氰基苯氧基-3-羥基己酸、對硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12- 二羥基十二烷酸、3，8- 二羥基-5-順式-十四烯酸、 3-羥基-4，5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順式-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-I I-溴i^一烷酸、3-羥基-2- 丁烯酸、6-羥基-3-十二烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基-2，6- 二甲基-5-庚烯酸中的至少一種。然而，本發(fā)明不限于此。所述羥基鏈烷酸酯可為選自3-羥丁酸酯、4-羥丁酸酯、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、 具有6 14個碳原子的中鏈長(D)-3-羥基羧酸、3-羥戊酸酯、4-羥基戊酸和5-羥基戊酸中的至少一種。更優(yōu)選地，而且是非必需地，所述羥基鏈烷酸酯可為3-羥丁酸酯(3-HB) (參見圖I)。因此，本發(fā)明的PLA或PLA共聚物可為聚乳酸酯、聚(羥基鏈烷酸酯_共_3_乳酸酯)、聚(羥基鏈烷酸酯-共-羥基鏈烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(羥基鏈烷酸酯-共-羥基鏈烷酸酯-共-聚羥基鏈烷酸酯-共-乳酸酯)等，但本發(fā)明不限于此。例如，所述PLA共聚物可為聚(4-羥丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(4-羥丁酸酯-共-3-羥基丙酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羥丁酸酯-共-4-羥丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羥丁酸酯-共-3-羥基丙酸酯-共-4-羥丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(中鏈長 (MCL) 3-羥基鏈烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羥丁酸酯-共-MCL 3-羥基鏈烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羥丁酸酯-共-3-羥戊酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羥丁酸酯-共-3-羥基丙酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羥基丙酸酯-共-乳酸酯)等，但本發(fā)明不限于此。在本發(fā)明中，載體指的是一種包含DNA序列的DNA構(gòu)件，該DNA序列可操作地連接至能夠在適合的宿主內(nèi)表達(dá)DNA的適合控制序列上。載體可為質(zhì)粒、噬菌體顆?；蛘吆唵蔚貪撛诘幕蚪M插入片段。當(dāng)將載體轉(zhuǎn)化到適合的宿主中時，載體能夠不顧宿主基因組而自我復(fù)制或者運(yùn)行，或者在某些情況下，載體可整合到宿主基因組中。因?yàn)橘|(zhì)粒是目前最常見類型的載體，所以在本發(fā)明中有時可以交替地使用“質(zhì)?！焙汀拜d體”。但是，本發(fā)明還包括其它類型的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體或者那些具有相同功能的載體。術(shù)語“表達(dá)控制序列”指的是用于在特定宿主中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。這種控制序列包括轉(zhuǎn)錄所需的啟動子；用于控制轉(zhuǎn)錄的任意操縱基因序列；編碼適合的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列；和用于控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。 例如，適合原核生物的控制序列包括啟動子、任意操縱基因序列和RBS。適合真核生物的控制序列包括啟動子、多腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。在質(zhì)粒中，啟動子是對基因的表達(dá)量具有最大影響的一個因素?？梢允褂肧Ra啟動子或巨細(xì)胞病毒的啟動子作為高表達(dá)啟動子。為了表達(dá)本發(fā)明的DNA序列，各種表達(dá)控制序列中的任何一種都可以用在載體中。例如，表達(dá)控制序列可為SV40或腺病毒的早期和后期啟動子、Iac體系、trp體系、tac 體系、trc體系、T3和T7啟動子、λ噬菌體的主要操縱基因和啟動子區(qū)域、fd編碼蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖解酶的啟動子、例如Pho5的磷酸酶的啟動子、酵母 α交配系統(tǒng)的啟動子、其它已知控制原核生物或真核生物細(xì)胞或它們的病毒的表達(dá)的具有不同的結(jié)構(gòu)或起源的序列及它們的各種組合。當(dāng)將核酸置入與其它核酸序列的功能關(guān)系中時，其被可操作地連接至該核酸序列。適合的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)可為基因和控制序列，二者以在與控制序列結(jié)合時能夠使基因表達(dá)的方式連接。例如，當(dāng)前序列或分泌前導(dǎo)的DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白時，其可操作地連接至該多肽的DNA;當(dāng)啟動子或者增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，其可操作地連接至該編碼序列；當(dāng)RBS影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，其可操作地連接至該編碼序列；或者當(dāng)設(shè)置RBS以便有利于翻譯時，其可操作地連接至編碼序列。總體而言，“可操作地連接”指的是被連接的DNA序列為毗鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況下，是毗鄰的且在閱讀框內(nèi)。但是，增強(qiáng)子不是必須靠近編碼序列。這些序列間的連接可通過合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的連接實(shí)現(xiàn)。但是，在不存在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的情況下，則可以根據(jù)常規(guī)方法使用合成的寡核苷酸接頭或者連接體。在本發(fā)明中，術(shù)語“表達(dá)載體”指的是向其中插入了異源DNA片段的重組載體，其中，所述DNA片段通常是雙鏈DNA片段。這里，所述異源DNA指的是不是在宿主細(xì)胞中天然產(chǎn)生的異型DNA。一旦將該表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中，其可以不顧宿主基因組DNA而進(jìn)行復(fù)制，從而可產(chǎn)生幾個拷貝的載體和插入它們中的(異源)DNA如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，為了提高宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染的基因的表達(dá)水平，相應(yīng)的基因必須可操作地連接至在選擇的表達(dá)宿主中起轉(zhuǎn)錄和翻譯作用的表達(dá)控制序列上。優(yōu)選地，將表達(dá)控制序列和基因包含在單一表達(dá)載體中，所述載體同時包含細(xì)菌篩選標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)表達(dá)宿主是真核細(xì)胞時，表達(dá)載體必須進(jìn)一步包含在真核生物表達(dá)宿主中可用的表達(dá)標(biāo)記。在本發(fā)明中，可以采用包括質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體和酵母人工染色體 (YAC)載體的各種載體作為重組載體。為了本發(fā)明的目的，可以使用質(zhì)粒載體作為重組載體。用于本發(fā)明目的的典型質(zhì)粒載體包含(a)復(fù)制起點(diǎn)，用于有效復(fù)制以使各宿主細(xì)胞包含幾百個質(zhì)粒載體；(b)抗生素抗性基因，用于篩選用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞；和(C) 限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，其中可以插入外源DNA片段。即使在沒有適合的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的情況下，根據(jù)常規(guī)方法使用合成的寡核苷酸接頭或者連接體可以容易地連接載體與外源DNA。根據(jù)本發(fā)明的重組載體可以使用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。宿主細(xì)胞可為細(xì)菌、酵母或真菌等，但本發(fā)明不限于此。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞可為例如大腸桿菌的原核細(xì)胞。適合的原核宿主細(xì)胞的例子可以包括大腸桿菌菌株JM109、大腸桿菌菌株DH5a、大腸桿菌菌株JM101、大腸桿菌K12菌株294、大腸桿菌菌株W3110、大腸桿菌菌株X1776、大腸桿菌XL-IBlue (Stratagene)、大腸桿菌B等。然而，還可以使用例如FMB101、NM522、NM538和 NM539的其它大腸桿菌菌株和其它原核細(xì)胞種屬。除了上述大腸桿菌以外，還可以使用例如土壤桿菌(Agrobacterium)A4的土壤桿菌屬菌株、例如枯草桿菌(Bacillus subtilis)的桿菌屬菌株、例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的其它腸細(xì)菌和各種假單胞菌屬菌株作為宿主細(xì)胞。但是，本發(fā)明不限于上述實(shí)例。另外，真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以使用根據(jù)描述在Sambrook等人(supra)的章節(jié) I. 82中的氯化I丐法容易地進(jìn)行?；蛘?，也可以使用電穿孔法(Neumann等人，EMBO J. , I 841(1982))來轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞。為了制備含有根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酶的基因和合酶的基因的植物，可以使用土壤桿菌、病毒載體等通過常規(guī)方法進(jìn)行植物的轉(zhuǎn)染。例如，用含有根據(jù)本發(fā)明的基因的重組載體轉(zhuǎn)化土壤桿菌屬微生物，并且轉(zhuǎn)化后的土壤桿菌屬微生物可以感染目標(biāo)植物的組織，從而得到轉(zhuǎn)染的植物。更具體而言，轉(zhuǎn)染植物的制備可包括(a)預(yù)培養(yǎng)目標(biāo)植物的外植體和共培養(yǎng)該外植體與轉(zhuǎn)化的土壤桿菌以轉(zhuǎn)染外植體；(b)在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的外植體以得到愈傷組織；和(C)切割并在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的愈傷組織以得到芽。在本發(fā)明中，術(shù)語“外植體”指的是從植物上切下的組織塊并包括子葉或胚軸?？梢允褂米尤~或胚軸作為本發(fā)明的方法所用的植物的外植體?？梢詢?yōu)選使用通過消毒和清洗植物的種子并在Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基中使該種子發(fā)芽而得到的子葉。在本發(fā)明中，要被轉(zhuǎn)染的目標(biāo)植物可為煙草、番茄、辣椒、豆子、水稻作物、玉米等， 但本發(fā)明不限于此。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是，即使轉(zhuǎn)化所用的植物是可有性再生的，通過組織培養(yǎng)可以使其無性再生。
有益效果如上所述，通常，在大腸桿菌中表達(dá)丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶是困難的，因此阻礙了乳酰輔酶A的有效提供。然而，根據(jù)本發(fā)明，將來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體弓I入重組大腸桿菌中以促進(jìn)乳酰輔酶A的提供，從而高效地制備聚乳酸酯(PLA)和PLA共聚物。


圖I為使用葡萄糖、3HB和乳酸酯在細(xì)胞內(nèi)合成乳酸酯共聚物(聚(3HB-共-乳酸酯))的途徑的示意圖。圖2為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例制備包含來自假單胞菌屬sp. 6-19的聚羥基鏈烷酸酯 (PHA)合酶基因和來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體基因的重組表達(dá)載體的方法的示意圖。
具體實(shí)施例方式在下文中，將通過實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯而易見的是，提供的實(shí)施例僅僅用來詳細(xì)說明本發(fā)明，而本發(fā)明并不限于實(shí)施例。根據(jù)本發(fā)明人的在先發(fā)明韓國專利申請第10-2006-0116234號公開的內(nèi)容，為了提供作為合成聚乳酸酯(PLA)和PLA共聚物所需的單體的乳酰輔酶A，現(xiàn)將更加詳細(xì)地描述操縱子型持續(xù)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，在該系統(tǒng)中，來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(CP-PCT) 和聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶一起被表達(dá)。實(shí)施例1-1 :來自假單胞菌屬sp. 6-19的PHA合酶基因的克隆以及表達(dá)載體的制備為了從本發(fā)明中所用的假單胞菌屬sp.6_19(KCTC 11027BP)中分離PHA合酶 (phaClPs6_19)基因，提取假單胞菌屬sp. 6-19的總DNA，根據(jù)phaClPs6_19基因的序列(Ae_ j in Song, Master' s Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST，2004)制備堿基序列為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6的引物，并且進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到phaClPs6_19基因。SEQ ID NO 5 5/ -GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAGTAA CG-3'SEQ ID NO 6 5/ -CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC-3'對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果，確認(rèn)了對應(yīng)于phaClPs6_19基因的I. 7kbp 基因片段。用BamHI/EcoRI 從 pSYL105 載體(Lee 等人，Biotech. Bioeng. , 1994,44 : 1337-1347)中切下含有來自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)H16的產(chǎn)生PHB的操縱子的DNA片段,并將其插入到pBluescript II (Stratagene)的BamHI/EcoRI識別位點(diǎn)， 由此制備PReCAB重組載體。用PHB操縱子啟動子持續(xù)表達(dá)PHA合酶(phaCKE)和提供單體的酶(phaAKE和 phaBEE)的pReCAB載體也有效地在大腸桿菌中運(yùn)行(Lee等人，Biotech. Bioeng. , 1994, 44 :1337-1347),這是已知的。用BstBI/Sbfl酶切pReCAB載體以除去富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16PHA合酶(phaCEE)，并且將phaClPs6_19基因插入到BstBI/Sbfl識別位點(diǎn)，由此制備 pPs619Cl-ReAB 重組載體。
為了產(chǎn)生只在任一端具有BstBI/Sbfl識別位點(diǎn)的phaClPs6_19合酶基因片段，在沒有改變氨基酸的情況下，使用定點(diǎn)誘變(SDM)去除內(nèi)源BstBI位點(diǎn)，并且使用SEQ ID NO 7 和 SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9 和 SEQ ID N0:10 和 SEQ ID N0:11 和 SEQ ID N0:12 的引物進(jìn)行重疊PCR從而加入BstBI/Sbfl識別位點(diǎn)。SEQIDNO7 5/-ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA-3/
SEQIDNO8 5/-CGTTACTCTTGTTACTCATGA TTTGATTGTCTC TC-3
SEQIDNO9 5/-GAGAGACAATCAAATCATGAG TAACAAGAGTAACG-3'
SEQIDNO10 5-CACTCATGCAAGCGTCAC CGT TCG TGC ACG TAC-3'
SEQIDNO11 5-GTACGTGCACGAACGGTGACG CTTGCATGAGTG-3'
SEQIDNO12 5-AACGGGAGGGMCCTGCA GG-3'通過序列測定確認(rèn)了制備的pPs619Cl_ReAB重組載體的phaClPs6_19基因的堿基序列并且用SEQ ID N0:13表示，而用SEQ ID NO : 14表示由此編碼的氨基酸序列。基因序列相似性分析結(jié)果顯示，phaClPs6_19基因與來自假單胞菌屬sp.菌株61_3 的 phaCl (Matsusaki 等人，J. Bacteriol.，180 6459,1998)具有 84. 3 % 的同源性以及 88. 9%的氨基酸序列同源性。因此，證實(shí)了這兩種合酶是非常相似的酶。結(jié)果，證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明得到的phaClPs6_19合酶是II型PHA合酶。實(shí)施例1-2 :來自假單胞菌屬sp. 6-19的PHA合酶的底物特異性突變體的制備在各種PHA合酶中，II型PHA合酶已知為用于聚合具有相對較多個碳原子的底物的中鏈長PHA (MCL-PHA)合酶，并且預(yù)期MCL-PHA合酶十分適用于PLA共聚物的生產(chǎn)。盡管來自假單胞菌屬sp. 61-3的phaCl合酶是II型PHA合酶，其與根據(jù)本發(fā)明得到的phaClPs6_19 合酶具有高度同源性，但是已報道，PhaCl合酶的底物特異性的范圍相對較寬(Matsusaki 等人，J. Bacteriol.，180 :6459，1998)，并且也報道了對適合生產(chǎn)短鏈長PHA(SCL-PHA)的突變體的研究結(jié)果(Takase等人，Biomacromolecules, 5 :480, 2004)?；谏鲜鲅芯?本發(fā)明人通過氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)了影響SCL激活的三個氨基酸位點(diǎn)，并且使用表I中所示的引物(SEQ ID N0:15 SEQ ID NO :20)通過SDM方法制得了 phaClPs6_19合酶的突變體。表I
權(quán)利要求
1.一種編碼提供乳酰輔酶A的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因，該基因具有其中突變?yōu)?A1200G的SEQ ID NO 3的基因序列。
2.一種編碼提供乳酰輔酶A的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因，該基因具有其中突變?yōu)?A1200G的SEQ ID NO 3的基因序列和其中突變?yōu)镚ly335Asp的對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
3.一種編碼提供乳酰輔酶A的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因，該基因具有其中突變?yōu)?A1200G的SEQ ID NO :3的基因序列和其中突變?yōu)锳la243Thr的對應(yīng)于SEQ ID NO :3的氨基酸序列。
4.一種編碼提供乳酰輔酶A的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因，該基因具有其中突變?yōu)?A1200G的SEQ ID NO 3的基因序列和其中突變?yōu)锳sp257Asn的對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
5.一種用于合成聚乳酸酯或聚乳酸酯共聚物的重組載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求I 4 中任一項(xiàng)所述的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其進(jìn)一步包含SEQID NO :4的聚羥基鏈烷酸酯合酶基因(phaClPs6_19300),該酶能夠使用乳酰輔酶A作為底物合成聚乳酸酯或聚乳酸酯共聚物。
7.一種用根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
8.一種用根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
9.一種制備聚乳酸酯或聚乳酸酯共聚物的方法，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)菌或者使根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)菌生長。
10.一種制備聚乳酸酯或聚乳酸酯共聚物的方法，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)菌或者使根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)菌生長。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，在包含羥基鏈烷酸酯的環(huán)境中進(jìn)行所述培養(yǎng)或生長。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯為選自3-羥丁酸酯、3-羥戊酸酯、4-羥丁酸酯、具有6 14個碳原子的中鏈長(D) -3-羥基羧酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基i^一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、 4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反式-己烯酸、3-羥基-4-順式-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反式-辛烯酸、3-羥基-6-順式-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順式-十二烯酸、3-羥基-6-順式-十二烯酸、3-羥基-5-順式-十四烯酸、3-羥基-7-順式-十四烯酸、3-羥基-5，8-順式-順式-十四烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋果酸、3-羥基琥珀酸-甲酯、3-羥基己二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-甲酯、3-羥基壬二酸-甲酯、3-羥基癸二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-乙酯、3-羥基癸二酸-乙酯、3-羥基庚二酸-丙酯、3-羥基癸二酸-芐酯、3-羥基-8-乙酰氧基辛酸、3-羥基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對氰基苯氧基-3-羥基己酸、對硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12- 二羥基十二烷酸、3，8- 二羥基-5-順式-十四烯酸、3-羥基-4，5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順式-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-I I-溴i^一烷酸、3-羥基-2- 丁烯酸、6-羥基-3-十二烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯為選自3-羥丁酸酯、4-羥丁酸酯、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、具有6 14個碳原子的中鏈長(D)-3-羥基羧酸、3-羥戊酸酯、4-羥基戊酸和5-羥基戊酸中的至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯為3-羥丁酸酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，在包含羥基鏈烷酸酯的環(huán)境中進(jìn)行所述培養(yǎng)或生長。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯為選自3-羥丁酸酯、3-羥戊酸酯、4-羥丁酸酯、具有6 14個碳原子的中鏈長(D)-3-羥基羧酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基i^一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反式-己烯酸、3-羥基-4-順式-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、 3-羥基-6-反式-辛烯酸、3-羥基-6-順式-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順式-十二烯酸、3-羥基-6-順式-十二烯酸、3-羥基-5-順式-十四烯酸、3-羥基-7-順式-十四烯酸、3-羥基-5，8-順式-順式-十四烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋果酸、3-羥基琥珀酸-甲酯、3-羥基己二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-甲酯、3-羥基壬二酸-甲酯、3-羥基癸二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-乙酯、3-羥基癸二酸-乙酯、3-羥基庚二酸-丙酯、3-羥基癸二酸-芐酯、3-羥基-8-乙酰氧基辛酸、3-羥基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對氰基苯氧基-3-羥基己酸、對硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12- 二羥基十二烷酸、3，8- 二羥基-5-順式-十四烯酸、 3-羥基-4，5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順式-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-I I-溴i^一烷酸、3-羥基-2- 丁烯酸、6-羥基-3-十二烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基-2，6- 二甲基-5-庚烯酸中的至少一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯為選自3-羥丁酸酯、4-羥丁酸酯、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、具有6 14個碳原子的中鏈長(D)-3-羥基羧酸、3-羥戊酸酯、4-羥基戊酸和5-羥基戊酸中的至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯為3-羥丁酸酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體，其能夠在使用微生物制備聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法中高效地將乳酸酯轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A。與傳統(tǒng)的在大腸桿菌中弱表達(dá)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶不同，在將來自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變體引入重組大腸桿菌中時，可以非常平穩(wěn)地提供乳酰輔酶A，因此確保了聚乳酸酯(PLA)和PLA共聚物的高效制備。
文檔編號C12N1/21GK102586292SQ201210044570
公開日2012年7月18日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月14日
發(fā)明者姜惠玉, 樸時載, 李恩政, 李相賢, 梁宅鎬, 金泰完 申請人:Lg化學(xué)株式會社