專利名稱：離子液體中修飾纖維素酶原位降解纖維素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種在氯化I-丁基-3-甲基咪唑鹽離子液體/纖維素均相體系下，聚乙二醇衍生物修飾纖維素酶原位酶解纖維素的方法。
背景技術：
纖維素是世界上最豐富的可再生資源，也是解決人類面臨的糧食問題、能源問題和環(huán)境問題的最有前景的資源，現(xiàn)實生活中纖維素材料只有一小部分被用于紡織、造紙、建筑、飼料等方面，這不僅造成了資源的浪費而且還引發(fā)環(huán)境問題。將纖維素酶解為葡萄糖， 再通過發(fā)酵工藝可以生產乙醇、丙酮、丁醇等燃料和化工原料，是纖維素綜合利用的有效途徑。但是纖維素酶水解纖維素成葡萄糖的反應速度緩慢，在很大程度上是由于纖維素的高度結晶結構以致纖維素酶的吸附不到位。所以這種方法要求將纖維素溶解在一定的溶劑中，破壞纖維的晶態(tài)結構，以保證纖維素酶能夠進入纖維素底物內部發(fā)揮作用。離子液體(ILs)，是一類新型的纖維素的優(yōu)良溶劑，也是一種新型的生物催化反應介質。Rogers等首先發(fā)現(xiàn)離子液體氯化I-丁基-3-甲基咪唑鹽([Bmim]Cl)在室溫可以直接溶解纖維素，破壞纖維素的結晶結構，在提高酶水解速度和降低酶用量等方面顯示了巨大潛力。隨后氯化1_烯丙基_3_甲基咪唑鹽([Amim]Cl)、氯化I-(2-輕乙基)-3-甲基咪唑鹽([HeEim]Cl)等相繼被證實能夠溶解纖維素(參見中國專利CN1491974)。但此類離子液體含有鹵素對纖維素酶活性起到抑制作用。為了保持甚至提高離子液體體系中纖維素酶的活性，就要不斷改進離子液體，使之既能滿足纖維素的溶解性又能與纖維素酶的活性相匹配，咸漠等(參見中國專利CN101899487A)提出了咪唑磷酸酯類離子液體中可以進行纖維素酶的原位酶解。但該類離子液體對纖維素的溶解性遠不如[Bmim]Cl離子液體。因此， 創(chuàng)制在[Bmim]Cl離子液體中具有高活性高穩(wěn)定性的纖維素酶是實現(xiàn)離子液體下纖維素原位酶解的有效途徑。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是創(chuàng)制具有高活性高穩(wěn)定性的纖維素酶，以實現(xiàn)在氯化I-丁基-3-甲基咪唑鹽([Bmim]Cl)離子液體體系下纖維素的原位酶解。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的在50_60°C下將微晶纖維素，加入到[Bmim]Cl 離子液體中，得到均相溶液，纖維素占離子液體的重量比5-10%。在50-60°C下加入pH為 4. 8的檸檬酸緩沖液和修飾纖維素酶，檸檬酸緩沖液的加入量為離子液體質量的5-6倍，修飾纖維素酶的加入量為每毫升離子液體O. 5-5mg,反應30分鐘至I小時,纖維素轉化成還原糖的轉化率在80-90%。本發(fā)明采用的修飾纖維素酶是這樣得到的在30_35°C下，在檸檬酸緩沖溶液(pH =4.8)中，加入天然纖維素酶，待其完全溶解后，緩慢加入等質量的聚乙二醇衍生物，混合均勻后，加入聚乙二醇衍生物質量的30-50%的還原劑氰基硼氫鈉(NaCNBH3)，恒溫反應24 小時，然后加入天然纖維素酶質量20倍的甘氨酸，終止反應，通過透析純化得到修飾纖維素酶。本發(fā)明采用聚乙二醇衍生物為修飾劑，具體為單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量分別為 5000，10000，20000，分別標記為 mPEG-ALD 5k，mPEG-ALD 10k，mPEG-ALD 20k;單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺，分子量為5000，標記為mPEG-SPA 5k ;單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺，分子量為5000，標記為mPEG-MAL 5k。本發(fā)明采用的纖維素酶，酶活力1800u/毫克，pH范圍ρΗ2· 5-7. 5最佳ρΗ 4. 8， 溫度范圍30-80°C最佳溫度50°C。本發(fā)明采用微晶纖維素原料的分子量2. 5 5萬，聚合度153 300，灰分 < 0.6%，粒徑 25 190 μ m。發(fā)明效果本發(fā)明提供的新型纖維素酶，能在含有鹵素的離子液體中表現(xiàn)出良好的活性和穩(wěn)定性，很好地促進纖維素降解。使用本發(fā)明的方法可提高天然纖維素酶抵制環(huán)境引起酶失活的能力，從而提高了酶的催化活性，在反應過程中始終保持較高的催化活性，具有明顯的先進性，將為纖維素資源的綜合利用提供一條新的途徑。
具體實施例方式以下結合實施例進一步說明，并非限制本發(fā)明所涉及的范圍。實施例I :微晶纖維素原料分子量2. 5 5萬,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒徑25 190 μ m0還原糖量的測定方法DNS試劑1. 6g DNS和21g NaOH，加入到200mL水中溶解，185g酒石酸鉀鈉溶于 500mL水中，與上溶液混合加入5g結晶酚，5g無水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻定容于IOOOmL 容量瓶，儲于棕色瓶中7-10天后使用。葡萄糖標準曲線將葡萄糖在105°C下烘干2h至恒重，精確稱取O. Ig用蒸餾水溶解，并定容到IOOmL此濃度為I. Omg/mL。取10支20mL的具塞刻度試管，依次加入OmL、 O. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、I. OmT,. I. 2mL、I. 4mL、I. 6mL、I. 8mL 葡萄糖標準溶液，然后每支試管中加入蒸餾水，總體積為2. OmL,再分別加入O. 5mL DNS試劑，搖均后在沸水中準確放置5min,取出用流水迅速冷卻,用蒸懼水定容至20mL,充分搖均后靜置20min。最后在波長 540nm處測各比色管中溶液的吸光值A，以吸光值作縱坐標，相應葡萄糖濃度C (mg/mL)作橫坐標，得到葡萄糖標準曲線。在裝有溫度計、冷凝管和轉子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 4. 8 O. IM的現(xiàn)配檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；設定水浴加熱溫度為35°C，待瓶內溫度穩(wěn)定后加入150mg纖維素酶粉末，緩慢攪拌溶解；稱取150mg分子量5000的單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD 5k)作為修飾劑，并開始計時，混合均勻；再加入46mg氰基硼氫鈉(NaCNBH3)作為還原劑攪拌溶解，使其終濃度保持在20mM/mL以上；反應24h后，加入3. Og甘氨酸以終止纖維素酶的修飾化學反應30min ;反應液通過透析袋(截留7k大分子)在pH = 4. 8 O. IM的朽1檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中透析過夜；得到純化修飾纖維素酶液，凍干得到修飾纖維素酶粉。 記作Cell-ALD 5k，4°C下保存。
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稱取7. 5g[Bmim] Cl于IOOmL三口瓶中，加入375mg微晶纖維素(5% w/w) 60°C溶解
2.5小時，得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH為4. 8的檸檬酸緩沖液37. 5mL(約為離子液體重量的5倍)、15· Omg的Cell-ALD 5k，50°C下反應I小時后，取O. 5mL反應酶液，加入I. 5mLDNS試劑，沸水終止反應顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在540nm 下測定吸光度值，代入標準葡萄糖曲線，得到還原糖量達到4. 85mg/mL，纖維素轉化為還原糖的轉化率為80%。實施例2 微晶纖維素原料分子量2. 5 5萬,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒徑25 190 μ m0還原糖量的測定方法參見實施例I。在裝有溫度計、冷凝管和轉子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 4. 8 O. IM的現(xiàn)配檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；設定水浴加熱溫度為35°C，待瓶內溫度穩(wěn)定后加入150mg纖維素酶粉末，緩慢攪拌溶解；稱取150mg分子量10000的單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD 10k)作為修飾劑，并開始計時，混合均勻；再加入46mg氰基硼氫鈉(NaCNBH3)作為還原劑攪拌溶解，使其終濃度保持在20mM/mL以上；反應24h后，加入3. Og甘氨酸以終止纖維素酶的修飾化學反應30min ;反應液通過透析袋(截留14k大分子)在pH = 4. 8 O. IM的朽1檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中透析過夜；得到純化修飾纖維素酶液，凍干得到修飾纖維素酶粉。 記作 Cell-ALD 10k，4°C下保存。稱取7. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中，加入450mg微晶纖維素(6% w/w)60°C溶解 3小時，得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH為4. 8的檸檬酸緩沖液41. OmL (約為離子液體重量的5. 5倍)、21· Omg的Cell-ALD 10k, 50°C下反應I小時后，取O. 5mL反應酶液，加入I. 5mLDNS試劑，沸水終止反應顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在540nm 下測定吸光度值，代入標準葡萄糖曲線，得到還原糖量達到9. 27mg/mL，纖維素轉化為還原糖的轉化率為85%。實施例3 微晶纖維素原料分子量2. 5 5萬,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒徑25 190 μ m0還原糖量的測定方法參見實施例I。在裝有溫度計、冷凝管和轉子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 4. 8 O. IM的現(xiàn)配檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；設定水浴加熱溫度為35°C，待瓶內溫度穩(wěn)定后加入150mg纖維素酶粉末，緩慢攪拌溶解；稱取150mg分子量20000的單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD 20k)作為修飾劑，并開始計時，混合均勻；再加入46mg氰基硼氫鈉(NaCNBH3)作為還原劑攪拌溶解，使其終濃度保持在20mM/mL以上；反應24h后，加入3. Og甘氨酸以終止纖維素酶的修飾化學反應30min ;反應液通過透析袋(截留20k大分子)在pH = 4. 8 O. IM的朽1檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中透析過夜；得到純化修飾纖維素酶液，凍干得到修飾纖維素酶粉。 記作 Cell-ALD 20k，4°C下保存。稱取7. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中，加入600mg微晶纖維素(8% w/w)60°C溶解4小時，得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH為4. 8的檸檬酸緩沖液42. 5mL(約為離子液體重量的5. 7倍)、35· Omg的Cell-ALD 20k，50°C下反應I小時后，取O. 5mL反應酶液，加入I. 5mLDNS試劑，沸水終止反應顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在 540nm下測定吸光度值，代入標準葡萄糖曲線，得到還原糖量達到16. 36mg/mL，纖維素轉化為還原糖的轉化率為90%。實施例4 微晶纖維素原料分子量2. 5 5萬,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒徑25 190 μ m0還原糖量的測定方法參見實施例I。在裝有溫度計、冷凝管和轉子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 7. O O. 2M的現(xiàn)配磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液；設定水浴加熱溫度為35°C，待瓶內溫度穩(wěn)定后加入150mg 纖維素酶粉末，緩慢攪拌溶解；稱取150mg分子量5000的單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺 (mPEG-SPA 5k)作為修飾劑，并開始計時，混合均勻；再加入48mg氰基硼氫鈉(NaCNBH3)作為還原劑攪拌溶解，使其終濃度保持在20mM/mL以上；反應24h后，反應液通過透析袋(截留7k大分子)在pH = 4. 8 O. 2M的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中透析過夜；得到純化修飾纖維素酶液，凍干得到修飾纖維素酶粉。記作Cell-SPA 5k，4°C下保存。稱取I. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中，加入375mg微晶纖維素(5% w/w)60°C溶解2. 5小時，得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH為4. 8的檸檬酸緩沖液40. OmL (約為離子液體重量的5. 3倍)、28· Omg的Cell-SPA 5k，50°C下反應I小時后，取O. 5mL反應酶液，加入I. 5mLDNS試劑，沸水終止反應顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在 540nm下測定吸光度值，代入標準葡萄糖曲線，得到還原糖量達到5. 16mg/mL，纖維素轉化為還原糖的轉化率為86%。實施例5 微晶纖維素原料分子量2. 5 5萬,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒徑25 190 μ m0還原糖量的測定方法參見實施例I。在裝有溫度計、冷凝管和轉子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 7. 00. 2M的現(xiàn)配磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液；設定水浴加熱溫度為35°C，待瓶內溫度穩(wěn)定后加入150mg 纖維素酶粉末，緩慢攪拌溶解；稱取150mg分子量5000的單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺 (mPEG-MAL 5k)作為修飾劑，并開始計時，混合均勻；再加入48mg氰基硼氫鈉(NaCNBH3)作為還原劑攪拌溶解，使其終濃度保持在20mM/mL以上；反應24h后，反應液通過透析袋(截留7k大分子)在pH = 4. 8 O. 2M的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中透析過夜；得到純化修飾纖維素酶液，凍干得到修飾纖維素酶粉。記作Cell-MAL 5k，4°C下保存。稱取7. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中，加入375mg微晶纖維素(5% w/w)60°C溶解
2.5小時，得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH為4. 8的檸檬酸緩沖液45. OmL (約為離子液體重量的6倍)、30· Omg的Cell-MAL 5k，50°C下反應I小時后，取O. 5mL反應酶液，加入I. 5mLDNS試劑，沸水終止反應顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在540nm 下測定吸光度值，代入標準葡萄糖曲線，得到還原糖量達到4. 97mg/mL，纖維素轉化為還原糖的轉化率為82%。
權利要求
1.一種在氯化I-甲基3-丁基咪唑鹽([Bmim] Cl)離子液體下修飾纖維素酶原位酶解微晶纖維素的新方法。其特征在于在50-60°C下將微晶纖維素，加入到[Bmim]Cl離子液體中，得到均相溶液，纖維素占離子液體的重量比5-10%。在50-60°C下加入pH為4. 8的檸檬酸緩沖液和修飾纖維素酶，檸檬酸緩沖液的加入量為尚子液體質量的5-6倍，修飾纖維素酶的加入量為每暈升尚子液體0.5-5mg,反應30分鐘至I小時，纖維素轉化成還原糖的轉化率在80-90%。
2.根據(jù)權利要求I所述修飾纖維素酶在[Bmim]Cl離子液體下原位酶解纖維素的方法，其特征是在30-35°C下，在檸檬酸緩沖溶液(pH = 4. 8)中，加入天然纖維素酶，待其完全溶解后，緩慢加入等質量的聚乙二醇衍生物，混合均勻后，加入聚乙二醇衍生物質量的 30-50%的還原劑氰基硼氫鈉(NaCNBH3)，恒溫反應24小時，然后加入天然纖維素酶質量20 倍的甘氨酸，終止反應，通過透析純化得到修飾纖維素酶。
3.根據(jù)權利要求I所述修飾纖維素酶在[Bmim]Cl離子液體下原位酶解纖維素的方法， 其特征是采用聚乙二醇衍生物為修飾劑，具體為單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量分別為 5000，10000，20000，分別標記為 mPEG-ALD 5k，mPEG-ALD 10k，mPEG-ALD 20k ;單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺，分子量為5000，標記為mPEG-SPA 5k ;單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺， 分子量為5000，標記為mPEG-MAL 5k。
全文摘要
本發(fā)明公開一種在氯化1-甲基3-丁基咪唑鹽離子液體下修飾纖維素酶原位酶解微晶纖維素的新方法。該方法主要包括以下步驟聚乙二醇衍生物與天然纖維素酶以一定比例在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中反應，通過透析純化得到修飾纖維素酶；按一定比例將修飾纖維素酶與檸檬酸-檸檬酸鈉混合，加入到纖維素/氯化1-甲基3-丁基咪唑鹽離子液體的均相體系中，對纖維素進行酶解。本發(fā)明的特點在于修飾纖維素酶穩(wěn)定性提高，催化活性強，在含有鹵素的離子液體中仍能保持纖維素酶活性，為纖維素提供了一條高效酶解的新途徑。
文檔編號C12N9/42GK102586362SQ20121003599
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權日2012年2月9日
發(fā)明者于世濤, 劉仕偉, 劉福勝, 李露, 解從霞, 謝娟 申請人:青島科技大學