專(zhuān)利名稱(chēng)：一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
甲魚(yú)，學(xué)名中華鱉，歷來(lái)是藥膳 及滋補(bǔ)佳品。20世紀(jì)80年代，溫室養(yǎng)殖的興起，使原本奉為稀珍的甲魚(yú)的產(chǎn)量大幅提高，隨之而起的是疾病的肆意流行。傳統(tǒng)防治多使用抗生素和化學(xué)藥品進(jìn)行，對(duì)于病毒性疾病，非但沒(méi)有起到治療效果，反而對(duì)甲魚(yú)造成毒害，污染環(huán)境，并導(dǎo)致藥物殘留，打擊消費(fèi)者的消費(fèi)信心。2007年以來(lái)，在浙江地區(qū)，尤以杭州、寧波地區(qū)甲魚(yú)生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)一種系統(tǒng)性敗血癥，主要癥狀為系統(tǒng)性出血性敗血，研究人員經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、組織切片與超薄切片觀察和人工感染試驗(yàn)等研究，確定一種新型球狀病毒是其原發(fā)性致病因子，該新型球狀病毒為甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒。甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒式從發(fā)病甲魚(yú)中分離的一種新型病毒。該病毒能導(dǎo)致甲魚(yú)系統(tǒng)性出血、敗血，來(lái)勢(shì)猛，7-10天內(nèi)累積死亡率可達(dá)90-100%。疫苗是指為了預(yù)防、控制傳染病的發(fā)生、流行，用于人體預(yù)防接種的疫苗類(lèi)預(yù)防性生物制品，其能有效控制疾病的發(fā)生，使用后沒(méi)有污染，無(wú)任何殘留，能有效地保護(hù)生態(tài)環(huán)境和食用產(chǎn)品的品質(zhì)，并且長(zhǎng)期使用也不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。疫苗主要包括滅活疫苗以及亞單位疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗，其中滅活疫苗指選用免疫原性好的細(xì)菌、病毒、立克次體、螺次體等，經(jīng)人工培養(yǎng)，再用物理或化學(xué)方法將其殺滅制成。此種疫苗失去繁殖能力，但保留免疫原性。死疫苗進(jìn)入人體后不能生長(zhǎng)繁殖，對(duì)機(jī)體刺激時(shí)間短，要獲得持久免疫力需多次重復(fù)接種。相對(duì)于亞單位疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗，滅活疫苗以其便于制作、簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)具有無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)。針對(duì)甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥疾病，目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)相關(guān)防治方法的研究，更沒(méi)有關(guān)于甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法的相關(guān)研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用本發(fā)明人從患系統(tǒng)性敗血癥的甲魚(yú)體內(nèi)分離得到的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，制備出安全、有效、免疫力強(qiáng)的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗并提供其制備方法，該滅活疫苗的制備方法簡(jiǎn)單、易行。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為
I、病毒特性
甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemiasphericalvirus, STSSSV)，毒株為 pl015 株，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月 21日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。該病毒無(wú)囊膜，直徑23-40nm，細(xì)胞核內(nèi)、外均可增殖。
2、一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，本疫苗含有保藏號(hào)為CGMCCNo. 5378的經(jīng)滅活的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒。3、一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗的制備方法，步驟如下
(1)病毒純化
取患系統(tǒng)性敗血癥的甲魚(yú)，將發(fā)病甲魚(yú)內(nèi)臟組織剪碎，按質(zhì)量體積比Ig :10ml比例將甲魚(yú)內(nèi)臟加入到TNE緩沖液中 ，于4 °C下，8000r/min離心20min后，取上清液于4 °C下，35000g離心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重懸于5mlTNE緩沖液中，4°C冰箱冰浴過(guò)夜，將過(guò)夜的沉淀輕輕吹打均勻，于4°C下，8000r/min離心20min，取上清液于4°C下，35000g離心lh，得到的白色沉淀即為純化病毒；
(2)抗原滅活
將步驟(I)得到的純化病毒用0. 9%無(wú)菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度0. 5-lmg/ml,然后加入終體積0. 5%的福爾馬林于37°C恒溫水浴鍋滅活24h，每2-3h進(jìn)行振蕩混勻，得到無(wú)菌的滅活病毒；
(3)乳化
將步驟(2)得到的滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比I :1混合后，于4°C間歇振蕩乳化6-8h得到甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗。所述的TNE 緩沖液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA 0. 9306g 補(bǔ)足雙蒸水至500ml，調(diào)整pH 7. 6，高壓滅菌，4°C冷藏備用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明首次提出了甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法，本發(fā)明是唯一的、高效的生產(chǎn)工藝，本身具有領(lǐng)先性。(2)按本發(fā)明生產(chǎn)甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗對(duì)生產(chǎn)條件要求不高，便于操作和實(shí)施，制備過(guò)程簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)。(3)自然條件下，病毒主要通過(guò)甲魚(yú)吞食病鱉和帶毒池水浸泡而傳染，達(dá)不到本發(fā)明效力檢驗(yàn)中注射的病毒劑量(注射劑量按體重< 100g，注射0. Iml ；100g <體重< 200g，注射0. 2ml ;200g<體重< 300g，注射0. 3ml ;體重> 300g，注射0. 4ml)，故自然環(huán)境中的保護(hù)率可能更高。綜上所述，本發(fā)明一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗具有安全、有效、免疫力強(qiáng)，該滅活疫苗的制備方法簡(jiǎn)單、易行。甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒(Soft-shelledturtle systemic septicemiasphericalvirus, STSSSV)，毒株為 P1015 株，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月 21日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
圖I為純化的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒粒子的電鏡觀察結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
一、具體實(shí)施例
本發(fā)明一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，本疫苗含有保藏號(hào)為CGMCCNo. 5378的經(jīng)滅活的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒。該甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus, STSSSV),毒株為 P1015株，保藏號(hào)為CGMCC No. 5378，于2011年10月21日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。該病毒無(wú)囊膜，直徑23-40nm，細(xì)胞核內(nèi)、外均可增殖。具體制備方法如下
(1)病毒純化
取患系統(tǒng)性敗血癥的甲魚(yú)，將發(fā)病甲魚(yú)內(nèi)臟組織剪碎，按質(zhì)量體積比Ig IOml比例將甲魚(yú)內(nèi)臟加入到TNE緩沖液中，于4°C下，8000r/min離心20min后，取上清液于4°C下，35000g離心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重懸于5mlTNE緩沖液中，4°C冰箱冰浴過(guò)夜，將過(guò)夜的沉淀輕輕吹打均勻，于4°C下，8000r/min離心20min，取上清液于4°C下，35000g離心lh，得到的白色沉淀即為純化病毒；
(2)抗原滅活
將步驟(I)得到的純化病毒用0. 9%無(wú)菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度0. 5mg/ml,然后加入終體積0. 5%的福爾馬林于37°C恒溫水浴鍋滅活24h，每2-3h進(jìn)行振蕩混勻得到無(wú)菌的滅活病毒；
(3)乳化
將滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比I : I混合后，于4°C間歇振蕩乳化6h得到甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗。TNE 緩沖液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA 0. 9306g 補(bǔ)足雙蒸水至500ml，調(diào)整pH 7. 6，高壓滅菌，4°C冷藏備用。除上述實(shí)施例外，病毒蛋白終濃度還可以為lmg/ml或0. 75mg/ml ;歇振蕩乳化時(shí)間還可以為7h或者8h。二、檢驗(yàn)方法
I、成品檢驗(yàn)充分乳化的滅活疫苗為乳白色油乳劑，取一滴滴于水上5min不散開(kāi)，4°C放置15日不分層。2、無(wú)菌檢測(cè)取IOOul甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，涂布牛肉瓊脂平板，28°C倒置培養(yǎng)24-48h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。無(wú)菌生長(zhǎng)為合格。3、安全檢測(cè)
a.取滅活疫苗接種雞胚，每胚0.15ml，34°C培養(yǎng)10天，觀察雞胚死亡情況；
b.取滅活疫苗接種甲魚(yú),每只0.3ml，觀察甲魚(yú)10天內(nèi)死亡情況；
雞胚接種3-10d和甲魚(yú)接種15d內(nèi)無(wú)死亡為合格。4、效力檢驗(yàn)
(I)免疫
不同規(guī)格甲魚(yú)由后腿肌注疫苗，另設(shè)對(duì)照組按體重注射相應(yīng)劑量生理鹽水。充分乳化后對(duì)甲魚(yú)進(jìn)行免疫，注射劑量按體重〈100g，注射0. Iml ；100g〈體重〈200g，注射0. 2ml ；200g〈體重〈300g，注射0. 3ml ;體重〉300g，注射0. 4ml。另設(shè)對(duì)照組，按體重注射相應(yīng)劑量生理鹽水。
(2)由甲魚(yú)發(fā)病組織 粗提高濃度病毒液作為攻毒液
a.取患系統(tǒng)性敗血癥典型發(fā)病癥狀的甲魚(yú)解剖，取內(nèi)臟放入埋在冰里的燒杯；
b.將內(nèi)臟組織剪碎按m/v=lg10ml加入TM緩沖液勻漿，于4°C，6000g條件下，離心20min,取上清液；
c.將離心所得沉淀用少量TM緩沖液重懸，再次勻漿，于4°C，6000g離心20min，合并兩次離心所得上清液；
d.將合并所得上清液經(jīng)孔徑0.45 y m的濾膜過(guò)濾除去破碎組織后，再將濾液經(jīng)0. 22um針式濾頭過(guò)濾除菌，按體積每毫升濾液加入1000IU青霉素和1000 u g鏈霉素；
e.放入4°C冰箱冰浴過(guò)夜即得攻毒液。(3)取已免疫15天的甲魚(yú)進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組注射經(jīng)上述方法制備的攻毒液，劑量同免疫劑量，每組50只，觀察第3-10日內(nèi)死亡情況。結(jié)果注射生理鹽水的對(duì)照組攻毒后死亡率均為100%;注射滅活疫苗組，用攻毒液注射攻毒后死亡率均低于50%，結(jié)果表明疫苗對(duì)甲魚(yú)有明顯保護(hù)效力。滿足以上四種檢驗(yàn)要求視為合格。
權(quán)利要求
1.一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，其特征在于本疫苗含有保藏號(hào)為CGMCC No. 5378的經(jīng)滅活的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下 (1)病毒純化 取患系統(tǒng)性敗血癥的甲魚(yú)，將發(fā)病甲魚(yú)內(nèi)臟組織剪碎，按質(zhì)量體積比Ig :10ml比例將甲魚(yú)內(nèi)臟加入到TNE緩沖液中，于4 °C下，8000r/min離心20min后，取上清液于4 °C下，35000g離心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重懸于5mlTNE緩沖液中，4°C冰箱冰浴過(guò)夜，將過(guò)夜的沉淀輕輕吹打均勻，于4°C下，8000r/min離心20min，取上清液于4°C下，35000g離心lh，得到的白色沉淀即為純化病毒； (2)抗原滅活 將步驟(I)得到的純化病毒用O. 9%無(wú)菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度O. 5-lmg/ml,然后加入終體積O. 5%的福爾馬林于37°C恒溫水浴鍋滅活24h，每2-3h進(jìn)行振蕩混勻，得到無(wú)菌的滅活病毒； (3)乳化 將步驟(2)得到的滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比I :1混合后，于4°C間歇振蕩乳化6-8h得到甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的TNE緩沖液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA O. 9306g補(bǔ)足雙蒸水至500ml，調(diào)整pH 7. 6，高壓滅菌，4°C冷藏備用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法，特點(diǎn)是該疫苗含有保藏號(hào)為CGMCCNo.5378的經(jīng)滅活的甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒，其制備方法包括將病甲魚(yú)內(nèi)臟剪碎加入TNE緩沖液中，離心取上清液，再離心取白色沉淀，重懸于TNE緩沖液中，將沉淀離心后，取上清液再離心得到白色沉淀即純化病毒的步驟，將純化病毒用無(wú)菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度0.5-1mg/ml，然后加入終體積0.5%的福爾馬林恒溫水浴鍋滅活的步驟；將滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比11完全乳化得到滅活疫苗的步驟，優(yōu)點(diǎn)是首次提出了甲魚(yú)系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒滅活疫苗具有安全、有效、免疫力強(qiáng)，其制備方法簡(jiǎn)單、易行。
文檔編號(hào)C12N7/06GK102626514SQ20121001872
公開(kāi)日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉聯(lián)國(guó), 周永強(qiáng), 彭嬌, 李登峰 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)