專利名稱：一種將抗根結線蟲的rna干擾基因?qū)朦S瓜的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黃瓜轉基因技術，特別是一種獲得表達干擾線蟲MiMpkl基因的RNA干擾片段的黃瓜轉基因方法。
背景技術：
近些年隨著保護地栽培大面積推廣，加之重茬嚴重，根結線蟲對黃瓜生產(chǎn)的危害日趨嚴峻。而現(xiàn)有資源中缺乏抗南方根結線蟲的種質(zhì)資源，目前利用傳統(tǒng)育種手段尚無法解決此問題，因此需通過轉基因技術引入新的抗原，拓寬栽培黃瓜的遺傳基礎。在專利號為ZL200810118726.X，名稱為“一種RNA干擾載體及其應用”的專利中公開了以南方根結線蟲的MiMpkl基因為靶標構建的MiMpkl RNA干擾載體，并將該載體轉入蕃茄中，使蕃茄獲得了較好的對線蟲的抗性,體外飼喂實驗也證明該RNA干擾載體能夠有效干預線蟲體內(nèi)的一個信號轉導酶MARK蛋白的合成，阻礙線蟲的生長和發(fā)育，從而達到防治線蟲的目的?？梢灶A知，將載有該基因的RNA干擾載體轉入黃瓜中獲得抗線蟲的轉基因黃瓜品系，將是一種緩解目前黃瓜受線蟲危害的有效方法，但是為順利實現(xiàn)此目的，須借助高效的轉基因體系。雖然在蕃茄，大豆等作物上，都有轉基因轉化率高的報道，同時未有報道將干擾載體轉化于黃瓜中，通過沉默線蟲自身基因達到防治線蟲的目的。黃瓜的遺傳轉化研究始于1986年，但在黃瓜抗線蟲的遺傳轉化方面的研究仍然很少，于玉梅(2008)從被根結線蟲侵染的黃瓜根系cDNA中擴增出根結線蟲的保守基因16D10，構建植物表達載體，通過花粉管通道法將16D10轉入黃瓜，得到的抗性苗經(jīng)PCR檢測，I株擴增出特異條帶。朱妍妍(2008)采用相同的方法擴增得到基因16D10，構建了抗根結線蟲的RNAi植物表達載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導法和花粉管通道法轉化黃瓜，但最終未得到轉基因植株。魏愛民等(2006)用農(nóng)桿菌介導法將抗蟲基因eqkam導入黃瓜，僅對抗蟲基因轉化黃瓜的影響因素進行了研究說明，未說明是否獲得再生植株，后其又采用花粉管通道法將抗蟲基因eqkam轉化黃瓜，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，獲得了再生植株，但轉化率僅為0. 14%。在植物遺傳轉化研究中，常通過使用乙酰丁香酮(AS)來輔助農(nóng)桿菌轉化，因為AS是一種酚類物質(zhì)，可誘導農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上的Vir區(qū)基因的活化和表達，促進農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細胞核轉移，從而提高轉化效率。AS尤其對單子葉植物的遺傳轉化非常必要，而雙子葉植物由于在外植體受傷后會自行合成酚類物質(zhì)，因此不必外加酚類物質(zhì)就可以使Vir區(qū)基因活化，但實驗證明加入適量AS依然可以提高轉化率。AS被廣泛應用于目前的植物轉基因技術中，在黃瓜的遺傳轉化中利用AS輔助轉化的報道也較多，將IOOmg/LAS添加到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，再生頻率高達83. 3 %，但對轉化效率的影響并不大，有待進一步改進。因此隨著對雙子葉植物轉基因研究的深入和技術的改進，迫切需要開發(fā)輔助轉化效果更明顯、對外植體傷害更小的試劑。以往的研究曾發(fā)現(xiàn)抗氧化劑對促進植物外植體分化、緩解褐化有較好的作用，近些年硫辛酸(lipoic acid，下文簡寫為LA)作為一種超強型抗氧化劑被運用到植物組織培養(yǎng)研究中，并獲得了較好的試驗效果。而目前LA也被應用到大豆和番茄的遺傳轉化研究中，結果顯示轉化效率分別從0. 6%和29. 8%顯著增加到
3.7%和87%，并可顯著降低大豆和番茄的假陽性率；小麥的轉化率從2. 8%提高到5. 7% ;在棉花上，可以使草甘膦抗性芽率由41. 4%增長到61. 2%。而目前在黃瓜的遺傳轉化中利用AS輔助轉化的報道較多，將100mg/L AS添加到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，再生頻率高達83. 3%。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領域的需求和空白，提供一種改進的黃瓜遺傳轉化體系，使黃瓜的遺傳轉化率顯著提高，高效地獲得了能夠表達干擾線蟲MiMpkl基因的轉基因黃瓜，該遺傳轉化體系能減少在遺傳轉化篩選過程中所耗費的時間和人力成本，提高遺傳轉化的工作效率。同時，通過黃瓜表達MiMpkl基因，可有效的沉默根結線蟲的MiMpkl基因，影響其正常發(fā)育，減少對黃瓜的危害。本發(fā)明的方案如下 一種將抗根結線蟲的RNA干擾基因?qū)朦S瓜的方法，包括以下步驟(I)預培養(yǎng)黃瓜外植體子葉或子葉節(jié)；(2)準備用于浸染的含有外源基因載體的農(nóng)桿菌液；(3)將所述外植體置于所述農(nóng)桿菌懸液中浸染15 20mins ；(4)浸染后的外植體接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25°C黑暗條件下培養(yǎng)2 3d ; (5)共培養(yǎng)后的外植體置于初步選擇培養(yǎng)基中初步篩選2 3周，篩選抗生素為潮霉素；(6)初步篩選出的外植體轉入到再次選擇培養(yǎng)基中再次篩選I周，篩選抗生素為
潮霉素；(7)再次篩選出的保持綠色的外植體接種到添加0. 5mg/L GA的BPM培養(yǎng)基中伸長
培養(yǎng)；(8)生根培養(yǎng)獲得再生植株；其特征在于所述含有外源基因載體為pCAGC1341_dsMiMpkl，⑵中的農(nóng)桿菌懸液中和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。所述外植體為子葉，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2. Omg/L BA+1. 0mg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。所述外植體為子葉節(jié)，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L BA+2. 0mg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/l AS pH = 5. 4。所述外植體為子葉，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為10mg/L，25mg/L0所述外植體為子葉節(jié)，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為7mg/L，15mg/L0所述外植體為子葉，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+2. Omg/L BA+1. Omg/L ABA+10mg/L Hyg+400mg/L cef,pH= 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+25mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4。
所述外植體為子葉節(jié)，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+15mg/L Hyg+400mg/lcef pH = 5. 4。所述(I)中，所述預培養(yǎng)指外植體為子葉，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中生長I 2天后，切除胚根，子葉部分十字對切成4塊，獲得子葉外植體；或所述外植體為子葉節(jié)，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)后轉入光下培養(yǎng)4 5天，當子葉呈直立狀態(tài)時切取，去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸，并在預培養(yǎng)基PM上培養(yǎng)2天得到子葉節(jié)外植體。本發(fā)明為了獲得抗線蟲轉基因黃瓜，以專利號為ZL200810118726.X，名稱為“一種RNA干擾載體及其應用”中公開的RNA干擾載體pCAGC1341-dsMiMpkl為外源基因載體轉化黃瓜，希望獲得抗線蟲的轉基因黃瓜品種。鑒于目前報道的黃瓜遺傳轉化方法不夠高效難以獲得轉基因再生植株的現(xiàn)狀，發(fā)明人對于現(xiàn)有的黃瓜轉基因方法進行了改進。在外源基因載體轉化到外植體的階段，本發(fā)明在浸染菌液與共培養(yǎng)培養(yǎng)基中都加硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS),顯著提高了獲得轉化效率,轉化效率(％ ) = PCR或southern blot檢測為的陽性植株數(shù)/再生植株總數(shù)X 100%。本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)表明，在適當濃度的如50 100mg/L LA搭配適當濃度的如50mg/L AS的情況下，二者共同作用于農(nóng)桿菌轉化時，抗性芽率相比對照或者單獨使用LA或AS時都有顯著提高，且Southern-blot檢驗下的轉化效率也有所增長，證明LA與AS協(xié)同作用更有利于黃瓜的遺傳轉化，其中LA可緩解自由基對細胞的傷害、減緩組織的氧化過程，而AS促進Vir區(qū)基因的活化，兩者共同作用下使轉化率得以提高。但是，本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)同時也表明，LA與AS之間的合作協(xié)調(diào)作用僅限于非常小的濃度范圍內(nèi)，超過某些閾值，可能二者之間的作用存在相互拮抗，因為在一些情況下，如表3和表4所示，搭配使用的結果出人意料地比單獨使用AS或LA都低。本發(fā)明還提供了含有AS和LA的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配方，以使本發(fā)明的遺傳轉化體系得到整體上的優(yōu)化和改進。本發(fā)明還研究了在對轉化體初步篩選及再次篩選中，采用潮霉素進行篩選的方案，現(xiàn)有技術中一般都采用從一而終的高濃度潮霉素篩選抗性轉化體。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，采用梯度篩選即先低濃度后高濃度的潮霉素對初步轉化體進行選擇，與對照相比，能夠顯著降低假陽性率，提高獲得陽性再生植株的比例。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同的外植體對于潮霉素的耐受力不相同，因此，不同的外植體采用不同的梯度設置，如以子葉為外植體時，潮霉素篩選梯度為10mg/L, 25mg/L。如以子葉節(jié)為外植體時,潮霉素篩選梯度為7mg/L, 15mg/L。
圖I黃瓜子葉節(jié)的遺傳轉化過程I :預培養(yǎng)；2 :選擇培養(yǎng)；3 :抗性植株；4 :對照。圖2不同選擇壓對子葉節(jié)遺傳轉化的影響每組柱形圖從左到右依次為對照、15mg/L Hyg篩選、梯度Hyg篩選。圖3黃瓜抗性植株的PCR檢測圖4黃瓜抗性植株的southern blot檢測圖5黃瓜MiMPKl轉化植株的根結線蟲田間接種試驗I對照；2黃瓜轉化植株圖6黃瓜轉基因植株田間接種根結線蟲鑒定結果縱坐標表示平均根結數(shù)(根結數(shù)/株)、
圖7不同LA/AS處理對黃瓜子葉節(jié)再生頻率的影響左縱坐標表示再生頻率(％ )，右縱坐標表示再生芽數(shù)/外植體(個)圖8PCR驗證黃瓜子葉節(jié)再生植株轉化效率
具體實施例方式以下通過實驗具體描述本發(fā)明的技術方案，但以下實驗不應被解釋為對本發(fā)明的限制。試驗材料本試驗所用的試驗材料是新泰密刺黃瓜，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所黃瓜育種課題組提供。根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105。質(zhì)粒載體為pCAGC1341_dsMiMpkl，含有潮霉素抗性基因和線蟲基因MiMPKl，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所植物病理實驗室惠贈。以上生物材料，本實驗室亦有保存，可自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗證實驗。其它試劑MS基本培養(yǎng)基(M5519)、硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS)購自Sigma (上海)生物技術公司，6-BA、ABA、IAA、AgN03、頭孢霉素(Cef)、卡納霉素(Km)、利福平(Rif)、潮霉素(Hyg)、NaCl、酵母粉、蛋白胨均購自北京拜爾迪生物技術公司。所配制的MS固體(液體)培養(yǎng)基和LB固體(液體)培養(yǎng)基高壓滅菌后常溫保存?zhèn)溆?；試驗所需試劑配制為母液后用一次性過濾器(0. 22um)過濾除菌，-20°C保存?zhèn)溆茫囵B(yǎng)基配方如表I所不。表I本發(fā)明最終確定的黃瓜遺傳轉化用優(yōu)化培養(yǎng)基
權利要求
1.一種將抗根結線蟲的RNA干擾基因?qū)朦S瓜的方法，包括以下步驟 (1)預培養(yǎng)黃瓜外植體子葉或子葉節(jié)； (2)準備用于浸染的含有外源基因載體的農(nóng)桿菌液； (3)將所述外植體置于所述農(nóng)桿菌懸液中浸染15 20mins； (4)浸染后的外植體接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25°C黑暗條件下培養(yǎng)2 3d ; (5)共培養(yǎng)后的外植體置于初步選擇培養(yǎng)基中初步篩選2 3周，篩選抗生素為潮霉素； (6)初步篩選出的外植體轉入到再次選擇培養(yǎng)基中再次篩選I周，篩選抗生素為潮霉素； (7)再次篩選出的保持綠色的外植體接種到添加0.5mg/L GA的BPM培養(yǎng)基中伸長培養(yǎng); (8)生根培養(yǎng)獲得再生植株； 其特征在于所述含有外源基因載體為pCAGC1341-dsMiMpkl，(2)中的農(nóng)桿菌懸液中和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.Omg/LBA+1. Omg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉節(jié)，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/LBA+2. Omg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
4.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為10mg/L, 25mg/L。
5.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉節(jié)，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為7mg/L, 15mg/L。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+2.Omg/L BA+1. Omg/LABA+1 Omg/L Hyg+400mg/L cef, pH = 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+25mg/L Hyg+400mg/L cefpH = 5. 4。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+15mg/L Hyg+400mg/Lcef pH = 5. 4。
8.根據(jù)權利要求I 7任一所述的方法，(I)中所述預培養(yǎng)指外植體為子葉，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中生長I 2天后，切除胚根，子葉部分十字對切成4塊，獲得子葉外植體；或所述外植體為子葉節(jié)，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)后轉入光下培養(yǎng)4 5天，當子葉呈直立狀態(tài)時切取，去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸，并在預培養(yǎng)基PM上培養(yǎng)2天得到子葉節(jié)外植體。
全文摘要
本發(fā)明“一種將抗根結線蟲的RNA干擾基因?qū)朦S瓜的方法”，涉及黃瓜轉基因技術。其特征在于在轉化過程中，利用含有外源基因載體pCAGC1341-dsMiMpkl，在農(nóng)桿菌懸液中和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中均添加硫辛酸100mg/L和乙酰丁香酮50mg/L以提高農(nóng)桿菌轉化效率，此外本發(fā)明還采用了潮霉素梯度篩選的方法以及相應的培養(yǎng)基方案，進一步提高了獲得黃瓜陽性轉化體的效率。
文檔編號C12N15/82GK102634539SQ20121001685
公開日2012年8月15日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權日2012年1月18日
發(fā)明者張圣平, 王燁, 苗晗, 謝丙炎, 陳國華, 顧興芳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所