專利名稱：一種產(chǎn)鳥氨酸的菌株及用該菌株生物合成鳥氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)鳥氨酸的一種新微生物菌株及其培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸或含有精氨酸酶的菌體，并將該菌體用于生物制備鳥氨酸的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。更具體的說本發(fā)明涉及來源于土壤的見/-Wii如《7ΛΛ5 pycnus (SK23. 002)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466，利用該菌株生物合成鳥氨酸 (ornithine)。
背景技術(shù)：
近年發(fā)現(xiàn)鳥氨酸可刺激腦垂體分泌成長激素，促進蛋白質(zhì)合成及糖與脂肪之代謝(基礎(chǔ)代謝)，在結(jié)合運動情況下攝食鳥氨酸可減少體內(nèi)脂肪堆積，增強肌肉和體力，起到減肥保健的作用，此外鳥氨酸還可促進腸道成長提高腸道免疫功能；L-鳥氨酸也是細(xì)胞成長因子聚胺合成之前體可能有助于美膚作用，在提高免疫功能和抗癌功能上也有一定作用。 L-鳥氨酸加在運動員保健品支鏈氨基酸中，還具有脫苦作用，所以鳥氨酸是一多功能的氨基酸，故成為關(guān)注的熱點。本發(fā)明所制的鳥氨酸具有以下特征。分子式=C5H12N2O2,分子量132. 19，熔點 140°C (細(xì)微結(jié)晶，120°C軟化)，溶解性易溶于水和乙醇，微溶于乙醚，其溶液呈堿性，易溶于水、乙醇，微溶于乙醚。通常作為試劑使用的是其單鹽，L-鳥氨酸單鹽易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚。在生物體內(nèi)，鳥氨酸主要參與尿酸循環(huán)，對于體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要作用。鳥氨酸在醫(yī)藥上除作為試劑與注射液外，通常與精氨酸一起用于配置恢復(fù)疲勞的發(fā)泡飲料。近年來，鳥氨酸在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用日益廣泛。目前鳥氨酸的生產(chǎn)主要有合成法、酶法和發(fā)酵法3種方法。合成法是早期研究鳥氨酸時的制備方法，其過程復(fù)雜，成本較高，D-鳥氨酸及L-鳥氨酸都有，不好分離，故已被淘汰。酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，生成L-鳥氨酸，此法產(chǎn)品純度高，但價格昂貴， 精氨酸及精氨酸酶均不易獲得，限于實驗室制備。發(fā)酵法生產(chǎn)的鳥氨酸，此法簡便易行，只要選擇合適的菌種，可以達(dá)到較高的產(chǎn)量，適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。所以，隨著鳥氨酸在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用日益廣泛，對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)鳥氨酸的研究就具有重大的理論意義和經(jīng)濟意義。本發(fā)明人深入調(diào)查和研究了現(xiàn)有技術(shù)，并從土壤中篩出多株生產(chǎn)鳥氨酸的菌株進行了研究，最終篩選到一株能高產(chǎn)鳥氨酸的新微生物，優(yōu)化后可達(dá)90%以上的轉(zhuǎn)化率，并通過分離純化以及濃縮干燥等手段得到較純的鳥氨酸。基于上述發(fā)現(xiàn)提出了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的微生物，它能夠高產(chǎn)鳥氨酸，且發(fā)酵過程中可不依賴精氨酸的誘導(dǎo)。其二，是提供一種該菌株生產(chǎn)鳥氨酸的方法，以得到高的轉(zhuǎn)化率。再者，是提供一種鳥氨酸分離純化與精制的方法，以得到高純度的鳥氨酸。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種來源于土壤的RwmeliibaciIlus pycnus(SK23-002)，保藏編號為 CCTCC NO :M 2010073。本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)鳥氨酸的菌株，其分類命名為Rmmeliibacillus pycnus (SK23-002)，是通過根據(jù)一定法則的菌類學(xué)性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)的分析和16sRNA序列的測定而得出。利用該微生物，發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸的方法，步驟如下
(1)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基=L-Arg l-20g/L，酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L以及加或不加少量無機鹽等，調(diào)pH6. 0-7. 5 ；
種子培養(yǎng)條件=CCTCC NO =M 2011466菌株于30-37°C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-1 活化該菌株。(2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-100g/L，L-Arg l_20g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L以及加或不加少量無機鹽等，調(diào)pH6. 0-7. 5 ；
發(fā)酵條件接種量1%_10%，30-37°C、轉(zhuǎn)速100-500rpm的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵 5-72h。(3)發(fā)酵后處理
發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心后收集含鳥氨酸的發(fā)酵液及含精氨酸酶的濕菌體，并用0. 1%的生理鹽水和pH6. 0的0. lmol/L醋酸鹽緩沖液清洗菌體，得靜息細(xì)胞進行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，經(jīng)檢測轉(zhuǎn)化率在80%以上。(4)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)底物精氨酸濃度10_200g/L，靜息細(xì)胞量0. l_10g/L，此反應(yīng)在pH4. 0-8. 0，30-70°C的條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間5_40h，得到轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液，
(5)鳥氨酸的分離純化
將含鳥氨酸的發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液經(jīng)脫色后利用強酸性陽離子交換樹脂001 X 7， 氨水洗脫，進行鳥氨酸分離純化。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明涉及一株從土壤中篩選而來的RimmeliibaciIlus pycnus (SK23-002)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466，以此芽孢菌為出發(fā)酵菌株，以葡萄糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)含有精氨酸酶的菌體，發(fā)酵所得菌體添加到5%-20%精氨酸溶液中轉(zhuǎn)化合成鳥氨酸，經(jīng)檢測可知，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上， 而且此發(fā)酵過程可不依賴精氨酸誘導(dǎo)作用。本發(fā)明方法生產(chǎn)的鳥氨酸安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性產(chǎn)品，被廣泛的應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。該發(fā)明能高效地生產(chǎn)鳥氨酸，適于進行大規(guī)模生產(chǎn)。生物材料樣品保藏一種產(chǎn)鳥氨酸的菌株，其分類命名為(MmmelUbaciIlus pycnus) SK23. 002，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466，保藏日期2011年12月12日。
具體實施例方式議飛良Rummeliibaci 1 Ius pycnus (SK23. 002)進行發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸的實施例，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于所列出的幾個實例，在不改變其要點的前提下，可做各種改變進行實施。另外，本發(fā)明的技術(shù)范圍延及均等的范圍。實施例1 SK23. 002號菌株的發(fā)酵培養(yǎng)使用菌株SK23. 002，在含L-Arg 0. 5%、葡萄糖1%、酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，無機氮源 0. 1%以及含或不含少量無機鹽等，調(diào)pH6. 0的培養(yǎng)基中，37°C，190 rpm的條件下培養(yǎng)22h， 冷凍離心，制得具有精氨酸酶活的靜息細(xì)胞。實施例2轉(zhuǎn)化反應(yīng)
使用實施例1所得菌體，在含精氨酸質(zhì)量濃度為50g/L、靜息細(xì)胞量0. l-10g/L的 IOOmM醋酸緩沖液(HAc-NaAc、pH6. 0)中，在37°C下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)5_40h，合成鳥氨酸。實施例3鳥氨酸產(chǎn)量的測定
將實施例2中進行的反應(yīng)液經(jīng)滅酶(TCA沉淀)、稀釋，通過安捷倫液相色譜儀，分別對精氨酸、鳥氨酸進行定量。分析條件如下儀器型號Agilent 1100，色譜柱(250*4.6)mm 5 μ m ODS HYPERSIL,柱溫40°C。實施例4新型鳥氨酸產(chǎn)生菌的鑒定
將新型鳥氨酸生產(chǎn)菌送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心測定該菌的形態(tài)特征、生理生化特性以及16SrRNA基因序列分析，鑒定為TP-Wii^ciBm pycnus,是安全菌株。實施例5鳥氨酸的分離純化
將轉(zhuǎn)化所得的反應(yīng)液經(jīng)脫色后，利用強酸性陽離子交換樹脂001X7，用不同濃度的氨水進行洗脫，得到純化的鳥氨酸。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)鳥氨酸的菌株，其分類命名為OP-WiihciB^S pycnus)^2 ,. 002，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466。
2.用權(quán)利要求1所述的CCTCCNO =M 2011466菌株發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸的方法，其特征在于，經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸及通過發(fā)酵生產(chǎn)具有精氨酸酶活性的菌體細(xì)胞，然后進行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，合成鳥氨酸；步驟為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基=L-Arg l-20g/L，酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L,調(diào)ρΗ6· 0-7. 5，去離子水配制；種子培養(yǎng)條件=CCTCC NO =M 2011466菌株于30-37°C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-1 活化該菌株；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-100g/L，L-Arg l_20g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L，調(diào)ρΗ6· 0-7. 5，去離子水配制；發(fā)酵條件接種量1%_10%，30-37°C、轉(zhuǎn)速100-500rpm的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵 5-72h ；(3)發(fā)酵后處理發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心后收集含鳥氨酸的發(fā)酵液及含精氨酸酶的濕菌體，并用0. 1%的生理鹽水和pH6. 0的0. lmol/L醋酸鹽緩沖液清洗菌體，得靜息細(xì)胞進行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，經(jīng)檢測轉(zhuǎn)化率在80%以上；(4)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)底物精氨酸濃度10-200g/L，靜息細(xì)胞量0.l-10g/L,此反應(yīng)在 pH4. 0-8. 0，30-70°C的條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間5_40h，得到轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液，(5)鳥氨酸的分離純化將含鳥氨酸的發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液經(jīng)脫色后利用強酸性陽離子交換樹脂001 X 7， 氨水洗脫，進行鳥氨酸分離純化。
全文摘要
一株產(chǎn)鳥氨酸的菌株及用該菌株生物合成鳥氨酸的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一株從土壤中篩選而來的Rummeliibacilluspycnus(SK23-002)，保藏編號為CCTCCNOM2011466，以此芽孢菌為發(fā)酵菌株，以葡萄糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸或含有精氨酸酶的菌體并將所得菌體添加到5%-20%精氨酸溶液中轉(zhuǎn)化合成鳥氨酸，經(jīng)檢測可知，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上，而且此發(fā)酵過程可不依賴精氨酸誘導(dǎo)作用。本發(fā)明方法生產(chǎn)的鳥氨酸安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性產(chǎn)品，被廣泛的應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。該發(fā)明能高效地生產(chǎn)鳥氨酸，適于進行大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/01GK102433288SQ20121001202
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者張濤, 江波, 沐萬孟, 王瑩, 繆銘 申請人:江南大學(xué)