專利名稱：一種抗卵白蛋白的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢驗檢疫領(lǐng)域，通過將卵清白蛋白免疫實驗動物獲得單克隆抗體，為建立卵清白蛋白雙抗夾心ELISA檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
食物過敏是對食物中蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生的一種不良免疫反應(yīng)。流行病學調(diào)查顯示， 25%以上的人群受到過敏疾病的困擾。世界衛(wèi)生組織(WHO )將牛奶、雞蛋、魚、甲殼類(蝦、 蟹、龍蝦)、花生、大豆、核果類(杏、板栗、腰果等)及小麥這8類食物定為常見的過敏食物。雞蛋中的蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，除了含有成年人所需要的八種必需氨基酸外， 還含有嬰幼兒必須通過膳食補充的組氨酸，更是唯一一個蛋白質(zhì)生物價達100的天然食物。然而正是這些對人體相當有益的蛋白質(zhì)卻可能成為兒童患過敏性疾病的禍首。不僅是兒童，某些先天性遺傳缺陷的成年人同樣有著對雞蛋過敏的煩擾。據(jù)報道，雞蛋過敏的高危人群為嬰幼兒和兒童，是兒童繼發(fā)性營養(yǎng)不良的原因之一。迄今為止，雞蛋過敏尚無特效療法，嚴格避免食用帶雞蛋的食物是雞蛋過敏患者的最佳選擇。然而雞蛋營養(yǎng)豐富，若從雞蛋過敏患者的膳食中除去雞蛋，勢必造成其營養(yǎng)不均衡。而且，由于現(xiàn)在食物配料的多樣化，使食物的組成變得十分復(fù)雜，雞蛋過敏患者很難避免遭受危害，因此，雞蛋過敏已經(jīng)嚴重影響了部分人群的生活質(zhì)量，甚至危急生命，值得我們?nèi)リP(guān)注和研究。雞蛋中的過敏原主要存在于蛋清中，目前公認蛋清中有4種蛋白成分能與人類血清結(jié)合而引起過敏反應(yīng)，為雞蛋的主要過敏原，它們分別是卵類黏蛋白、卵白蛋白(OVA)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶。目前國內(nèi)檢測卵白蛋白主要利用進口的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，靈敏度高，重復(fù)性好，但是價格昂貴。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種抗卵白蛋白的單克隆抗體及其制備方法，目的是建立能穩(wěn)定、高效分泌抗卵白蛋白的雜交瘤細胞株，從而為研制卵白蛋白雙抗夾心ELISA試劑盒奠定基石出。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
(1)免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速的免疫方法用lmg/mL的卵白蛋白100μ L與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30 μ L ；首免后七天用 lmg/mL的BALB/C 100 μ L與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后 14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；
(2)細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆，具體方法如下
強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1 :5 10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37°C水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔lOOul，放入 37°C,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細胞生長狀況補加或更換 HAT培養(yǎng)基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價， 篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20. 3%和73. 1%，陽性率分別為0和1. 78%，經(jīng)過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5557，分類命名產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數(shù)為 4. 8 X IO8M"1 ο本發(fā)明還包括單抗亞類測定及單抗的大量制備，用鼠免疫球蛋白亞類檢測試劑盒鑒定單抗亞類，用小鼠體外誘生腹水法大量制備腹水；
本發(fā)明還包括單抗分子量及腹水蛋白含量測定
將純化前和純化后的腹水經(jīng)變性SDS-PAGE電泳后，以Marker中標準蛋白在凝膠中的相對遷移率為橫坐標，以標準蛋白分子量的對數(shù)為縱坐標繪制標準曲線。根據(jù)抗體輕鏈和重鏈在凝膠中的遷移情況，計算抗體分子量。采用紫外分光光度法測定腹水蛋白含量，分別測定^Onm和^Onm處的吸光值，按下面的經(jīng)驗公式計算蛋白含量蛋白濃度(mg/ml) =1. 450 X OD280-O. 745X0D26(i。本發(fā)明采用高純度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠，篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗卵白蛋白的雜交瘤細胞株，為進一步研制出快速、有效、低成本的卵白蛋白OVA檢測試劑盒奠定了基石出。
具體實施例方式實施例1用高純度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠具體的免疫方法如下
采用兩種免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠，一種是足墊快速免疫方案用lmg/mL的 0VA100 μ L與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min。使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30 μ L。首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上， 首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價。另一種是常規(guī)免疫方案首次免疫乳化方法同足墊快速免疫法，腹腔及背部皮下多點注射100yg/100yL的卵白蛋白，兩周后進行加強免疫，100 μ g/100 μ L抗原與等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫每次間隔兩周，四免后三天斷尾檢測小鼠血清效價。實施例2細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆具體操作步驟如下
強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟(足墊免疫小鼠無菌取出胭淋巴結(jié))，用注射器吸取1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細胞懸液(或者用注射器研磨胭淋巴結(jié)制備細胞懸液)，按1 :(5 10)的比例與SP2/0細胞充分混合，在37°C水浴下與50%PEG1000進行細胞融合，將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的 HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔lOOul，放入37°C、 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細胞生長狀況補加或更換HAT培養(yǎng)基，待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價，篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高，細胞生長狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止，先后兩次細胞融合的融合率分別為20. 3% 和73. 1%，陽性率分別為0和1. 78%，經(jīng)過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，命名為4E9，2011年11月7日在地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5557，分類命名產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株。實施例3單抗亞類鑒定及腹水大量制備具體方法如下
(1)用檢測原卵白蛋白OVA包被酶標板，4°C過夜；
(2)PBST洗滌3次，甩干；
(3 )加入適當稀釋的腹水或細胞培養(yǎng)上清，37°C，Ih ；
(4)PBST洗滌3次，加入單抗亞類鑒定試劑，37°C，Ih ；
(5)PBST洗滌3次，甩干；
(6)每孔加入IOOul底物溶液，37°C顯色15min，酶標儀讀值判斷陽性結(jié)果。單克隆抗體亞類鑒定
權(quán)利要求
1.一種抗卵白蛋白的單克隆抗體，其特征在于是由下列方法制成的(1)免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊的快速免疫方法用lmg/mL的卵白蛋白100μ L與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30 μ L ；首免后七天用 lmg/mL的BALB/C 100 μ L與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后 14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；(2)細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆，具體方法如下強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1 :5 10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37°C水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔lOOul，放入 37°C,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細胞生長狀況補加或更換 HAT培養(yǎng)基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價， 篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20. 3%和73. 1%，陽性率分別為0和1. 78%，經(jīng)過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5557，分類命名產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數(shù)為 4. 8 X IO8M"1 ο
2.如權(quán)利要求1所述的一種抗卵白蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括下列步驟(1)免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速的免疫方法用lmg/mL的卵白蛋白100μ L與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30 μ L ；首免后七天用 lmg/mL的BALB/C 100 μ L與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后 14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；(2)細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆，具體方法如下強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1 :5 10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37°C水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔lOOul，放入 37°C,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細胞生長狀況補加或更換 HAT培養(yǎng)基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價， 篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20. 3%和73. 1%，陽性率分別為0和1. 78%，經(jīng)過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5557，分類命名產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數(shù)為 4. 8 X IO8M"1 ο
3.如權(quán)利要求1所述的一種抗卵白蛋白的單克隆抗體在制備ELISA檢測試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗卵白蛋白的單克隆抗體及其制備方法，屬于生物檢驗檢疫領(lǐng)域。免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速免疫方法細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No.5557，為進一步研制出快速、有效、低成本的卵白蛋白OVA檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/20GK102558350SQ20121001049
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者任洪林, 劉 東, 盧士英, 周玉, 宋杰, 張茂林, 李兆輝, 李巖松, 柳增善 申請人:吉林大學