專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從成熟紅麻葉片中提取dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種紅麻DNA研究技術(shù)，更具體地涉及一種高質(zhì)量、高產(chǎn)量的紅麻成熟葉片的DNA提取方法。
背景技術(shù)：
紅麻(Kenaf)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬OYi^MM) —年生韌皮纖維作物， 公元前4000年的非洲蘇丹就已栽培，紅麻作為天然纖維作物，具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、 適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，巨大的生物產(chǎn)量為樹(shù)林的3-4倍，極強(qiáng)的二氧化碳吸收能力為森林的4-5 倍，是發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)作物。紅麻纖維除傳統(tǒng)上作為加工麻繩、麻袋、地毯等的原料外， 還是加工汽車(chē)內(nèi)飾、板材、麻碳等的良好材料，其纖維經(jīng)變性可與棉花混紡為面料，具有吸濕、透氣、抑菌等生物功能。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)提取植物DNA進(jìn)行基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化、分子標(biāo)記等已在各種植物的研究中迅速展開(kāi)。在這些技術(shù)的操作過(guò)程中，提取高質(zhì)量 DNA樣品是必要前提，能夠有效提取高質(zhì)量DNA，一直是廣大生物技術(shù)工作者關(guān)心的問(wèn)題。 棉花、荔枝等植物含有大量的酚類(lèi)物質(zhì)及其次生代謝物質(zhì)，在DNA提取過(guò)程中通常會(huì)受到這些次生代謝物質(zhì)的干擾，影響DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，因此對(duì)這類(lèi)植物進(jìn)行DNA分離時(shí)，其提取緩沖液和分離步驟應(yīng)有相應(yīng)的變化(王珍，方宣鈞，2003)、(郭安平，黃明等，1997)。紅麻成熟葉片中含有多糖、多酚及其他次生代謝產(chǎn)物，這些次生物質(zhì)在DNA提取過(guò)程中常與核酸形成復(fù)合物，形成粘稠的膠狀物質(zhì)，并產(chǎn)生不同程度的褐化，對(duì)酶切、PCR擴(kuò)增等操作產(chǎn)生不良影響，從而不能用于分子生物學(xué)研究。而成熟紅麻葉片含有較多多糖、 多酚及其他次生代謝產(chǎn)物，加大了 DNA提取的難度。另外，紅麻雖是自花授粉作物，但在繁種生產(chǎn)中常出現(xiàn)自然雜交株，難以保持品種的特性和純度(何凡，1989)。因此，為確保所提取的紅麻DNA純度，必須根據(jù)紅麻生長(zhǎng)期內(nèi)純合的植株葉片為材料，而不是幼苗期的葉片。目前，有關(guān)紅麻基因組DNA提取方法的報(bào)道較少，且均以幼嫩、新鮮葉片為試材(徐建堂等，2007;郭安平等，1997)，對(duì)成熟、干燥葉片的DNA進(jìn)行提取的研究雖也有報(bào)道(曹德菊， 1999 ；白鳳虎，2007)，但由于步驟操作復(fù)雜，嚴(yán)重影響了紅麻DNA的提取效率。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種高效、穩(wěn)定地從成熟紅麻葉片中提取DNA 的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
稱(chēng)取紅麻成熟葉片l.og，用液氮迅速研磨至粉末狀，將粉末裝入IOml離心管中，管中加入:3ml 65°C預(yù)熱的重量比為4%CTAB提取緩沖液，重量比為3%抗氧化劑β -巰基乙醇； 然后冷卻至室溫，加入等體積的氯仿與異戊醇混合液，混合液中氯仿/異戊醇按體積比為 24/1，輕柔顛倒混勻IOmin ； 1200rpm離心IOmin ；吸取上清液轉(zhuǎn)入IOml離心管中，依次加入1/3體積的3 mol/L NaAc溶液及等體積_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，冰上沉淀30min ；于1200rpm離心IOmin ；將沉淀移入1. 5ml離心管中，用75%無(wú)水乙醇漂洗;3min，重復(fù)1次； 將沉淀真空抽干或于室溫下吹干，加入100 μ 1 TE溶解沉淀，進(jìn)行DNA純化或放入-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。所提取的DNA條帶清晰，用于分子標(biāo)記研究，或紅麻葉綠體DNA和線(xiàn)粒體DNA 的擴(kuò)增研究。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
紅麻成熟葉片中富含多糖、色素、酚類(lèi)等次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)極易引起紅麻DNA褐化、降解，嚴(yán)重影響了后續(xù)的PCR擴(kuò)增及條帶亮度。本發(fā)明操作步驟簡(jiǎn)單，節(jié)省了 DNA提取時(shí)間，在磨樣后于提取液中加入了 3% β-巰基乙醇，可有效防止紅麻樣品的色素、酚類(lèi)和醌類(lèi)等次生代謝物質(zhì)的氧化干擾，同時(shí)在第一次離心后得到的上清液加入1/3體積的3 mol/L NaAc (pH4. 8)，有利于變性的紅麻DNA凝聚而沉淀，提高了紅麻基因組DNA的產(chǎn)量。本發(fā)明優(yōu)化的紅麻成熟葉片DNA提取方法重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定、瓊脂糖電泳條帶清晰。本發(fā)明操作步驟簡(jiǎn)單，節(jié)省了 DNA提取時(shí)間，從而有效防止DNA氧化而造成的損失，提高DNA的提取產(chǎn)量，本發(fā)明為進(jìn)一步開(kāi)展紅麻及其麻類(lèi)的基因組學(xué)的研究奠定工作基礎(chǔ)。
圖1兩種方法獲得的紅麻DNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖；1-8泳道SDS法獲得的紅麻福紅952 DNA ；9-18泳道CTAB法獲得紅麻福紅952 DNA。圖2本發(fā)明改良的CTAB方法的紅麻DNA RAPD擴(kuò)增結(jié)果，泳道1_12分別表示來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)麻類(lèi)遺傳育種與綜合利用研究室保存的12個(gè)紅麻品種。12個(gè)品種分別是 福紅 952、8 個(gè)福紅航 952 突變體后代 P4-4，P4-18，P441, P442, P443, P410, P411, P412，福紅 951，08CCV-76，塔什干。圖3引物cp3擴(kuò)增結(jié)果。圖4引物mt4擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體實(shí)施步驟如下
1. 1紅麻成熟葉片DNA提取方法步驟改良SDS法
(1)分別稱(chēng)取紅麻品種福紅952成熟葉片各1. 0g，用液氮迅速研磨1-2遍至粉末狀， 將粉末裝入IOml離心管中，每管中加入:3ml 65°C預(yù)熱的SDS抽提緩沖液(100 mmoL/L Tris-HCl (pH8. 0),0.5 mol / L NaC 1,20 mmol/L EDTA (pH 8. 0))，每管分別加入不同 CTAB 濃度和抗氧化劑組合，8個(gè)不同CTAB濃度和抗氧化劑組合如下。
權(quán)利要求
1.一種從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法，其特征在于所述方法的具體步驟如下稱(chēng)取紅麻成熟葉片1. 0g，用液氮迅速研磨至粉末狀，將粉末裝入IOml離心管中，管中加入:3ml 65°C預(yù)熱的重量比為4%CTAB提取緩沖液，重量比為3%抗氧化劑β-巰基乙醇；然后冷卻至室溫，加入等體積的氯仿與異戊醇混合液，混合液中氯仿/異戊醇按體積比為對(duì)/1，輕柔顛倒混勻IOmin ； 1200rpm離心IOmin ；吸取上清液轉(zhuǎn)入IOml離心管中，依次加入1/3體積的3 mol/L NaAc溶液及等體積_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，冰上沉淀30min ；于1200rpm 離心IOmin ；將沉淀移入1. 5ml離心管中，用75%無(wú)水乙醇漂洗3min，重復(fù)1次；將沉淀真空抽干或于室溫下吹干，加入100 μ 1 TE溶解沉淀，進(jìn)行DNA純化或放入-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
2.如權(quán)利要求1所述的從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法，其特征在于，所提取的DNA 條帶清晰，用于分子標(biāo)記研究，或紅麻葉綠體DNA和線(xiàn)粒體DNA的擴(kuò)增研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效、穩(wěn)定地從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法。本發(fā)明結(jié)合紅麻成熟葉片中含多糖、多酚的特性，在已有的紅麻基因組DNA提取方法上，對(duì)紅麻葉片CTAB法提取基因組DNA提取方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。運(yùn)用本發(fā)明的方法能獲得紅麻基因組DNA條帶清晰，無(wú)拖帶，OD260/OD280為1.7-1.9，酶切完全，其質(zhì)量、產(chǎn)量都高于改良SDS法，可用于擴(kuò)增葉綠體DNA和線(xiàn)粒體DNA。此發(fā)明為進(jìn)一步開(kāi)展紅麻及其麻類(lèi)的基因組學(xué)及亞細(xì)胞基因組組學(xué)的研究奠定工作基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102533729SQ20121000599
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者徐建堂, 方平平, 林培清, 林荔輝, 池仁漫, 祁建民, 陳濤, 陶愛(ài)芬 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)