專利名稱：接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶尺蠖飼養(yǎng)及茶尺蠖核型多角體病毒繁殖領(lǐng)域，尤其涉及接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法，具體適用于通過(guò)接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)全年規(guī)?；敝矱cobNPV。
背景技術(shù)：
茶尺蠖Ectropis obliqua Warren，屬鱗翅目，尺蛾科，是我國(guó)主要茶樹(shù)害蟲(chóng)之一， 分布遍及各主產(chǎn)茶區(qū)，在長(zhǎng)江中下游，尤以浙、蘇、皖、鄂地區(qū)危害嚴(yán)重。幼蟲(chóng)食葉為害，常致茶叢光禿，嚴(yán)重影響茶樹(shù)的樹(shù)勢(shì)和茶葉產(chǎn)量，除危害茶樹(shù)外，還取食大豆、向日葵、石榴等植物。在我國(guó)茶尺蠖1年發(fā)生5 - 6代，第1代發(fā)生較為整齊，2代后世代重疊，防治難度較大。目前各地針對(duì)茶尺蠖的防治措施各有不同，但均以化學(xué)防治為主?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用，在殺死害蟲(chóng)的同時(shí)，不僅嚴(yán)重污染了茶園生態(tài)環(huán)境，而且也殺傷了大量天敵，并帶來(lái)害蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)、茶葉農(nóng)藥殘留、茶園生態(tài)系統(tǒng)惡化等諸多負(fù)面效應(yīng)，嚴(yán)重威脅茶葉質(zhì)量安全。茶葉作為加工不經(jīng)洗滌、消費(fèi)直接沖泡的飲品，在茶園有害生物防治中要求盡量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，優(yōu)先考慮運(yùn)用生物、農(nóng)業(yè)、物理手段治蟲(chóng)保產(chǎn)。茶尺蠖核型多角體病毒 (Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)稱 EcobNPV)是茶尺蠖的重要病原微生物, 它對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)感染力強(qiáng)，致死率高，對(duì)人、畜及天敵昆蟲(chóng)安全，尤其是可通過(guò)水平擴(kuò)散和垂直傳播途徑，形成病毒流行鏈，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)持續(xù)控制，因此，在茶葉生產(chǎn)中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。由于茶尺蠖核型多角體病毒專擇性極強(qiáng)，只能在寄主活體內(nèi)或細(xì)胞中增殖，生產(chǎn)條件要求相對(duì)嚴(yán)格，因此，能否解決病毒生產(chǎn)問(wèn)題，成為該病毒在生產(chǎn)實(shí)際中能否發(fā)揮作用的關(guān)鍵。用離體細(xì)胞增殖病毒，現(xiàn)已有報(bào)道，但其成本甚高，只能供基礎(chǔ)理論研究應(yīng)用，尚不適應(yīng)我國(guó)茶葉生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)。目前，生產(chǎn)茶尺蠖病毒主要采用宿主活體增殖的方式，即通過(guò)接毒感染宿主幼蟲(chóng)生產(chǎn)病毒。通常野外接毒和室內(nèi)接毒都可以實(shí)現(xiàn)病毒的增殖，但前者更容易受到環(huán)境因素制約，如溫度、濕度、光照、雨水、肉食性昆蟲(chóng)等等，都會(huì)對(duì)病毒的產(chǎn)量造成影響，甚至導(dǎo)致病毒殺蟲(chóng)活性降低；相比之下，室內(nèi)接毒方式可控性強(qiáng)，病毒生產(chǎn)量更為穩(wěn)定，因此，也成為當(dāng)前昆蟲(chóng)病毒活體增殖的最主要途徑。室內(nèi)人工飼養(yǎng)茶尺蠖，為病毒擴(kuò)繁提供齡期和營(yíng)養(yǎng)狀況一致的宿主昆蟲(chóng)，是茶尺蠖病毒活體增殖的關(guān)鍵。但由于使用傳統(tǒng)方法，即用茶葉養(yǎng)蟲(chóng)生產(chǎn)病毒效率低、成本高，不適宜作為飼料養(yǎng)蟲(chóng)增殖病毒，為此，必須篩選新飼料以有效解決茶尺蠖病毒大量擴(kuò)繁的難題。中國(guó)專利專利號(hào)為ZL200710068384.0，授權(quán)公告日為2009年9月16日的發(fā)明專利公開(kāi)了一種茶尺蠖的人工飼料，其制備及茶尺蠖的飼養(yǎng)方法，該發(fā)明中飼料的配方組分與各組分的重量份為瓊脂0. 5 - 6份、山梨酸鉀0. 1 - 0. 8份、精制葡萄糖1 - 8. 5份、可溶性淀粉1. 5 - 10份、脫脂黃豆粉2 - 10份、復(fù)合維生素B 0. 01 - 0. 1份、維生素C 0. 1 - 1. 5份、維生素E 0.02-0. 15份、茶葉粉20 - 40份和純凈水100 - 180份。雖然該發(fā)明用配方飼料替代茶葉克服了以往在冬季與早春因飼料短缺導(dǎo)致茶尺蠖不能全年繼代飼養(yǎng)的難題， 但其仍舊具有以下缺陷
首先，該發(fā)明只提及了配方飼料的養(yǎng)蟲(chóng)情況，而沒(méi)有提及配方飼料養(yǎng)蟲(chóng)后的產(chǎn)毒效率、 病毒毒力等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)，該發(fā)明由于缺乏這些數(shù)據(jù)，因而無(wú)法確定它是否能替代茶葉滿足規(guī)?；a(chǎn)EcobNPV的需要。其次，該發(fā)明采取的配方飼料為人工配料，不僅種類繁多，而且配制要求較高，因而成本較大，不適合于大范圍的推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的無(wú)法規(guī)?；a(chǎn)EcobNPV、成本較高的缺陷與問(wèn)題，提供一種能夠規(guī)?；a(chǎn)EcobNPV、成本較低的接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁 EcobNPV的方法。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，該方法依次包括以下步驟
第一步先采集健康茶尺蠖(Ectropis obliqua Warren)的蛹，再置于消毒后的養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)，并在室溫下飼養(yǎng)至成蟲(chóng)羽化；
第二步待上述蟲(chóng)蛹羽化后，先在養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)放入10%蔗糖溶液供成蟲(chóng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，再用高密紗布覆蓋養(yǎng)蟲(chóng)容器供交配后的雌蟲(chóng)在其表面產(chǎn)卵；
第三步始見(jiàn)卵孵出幼蟲(chóng)后，開(kāi)始用接骨草(Sambucus chinensis)喂養(yǎng)茶尺蠖幼蟲(chóng)，先將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍以供孵出的幼蟲(chóng)取食，當(dāng)接骨草上的接蟲(chóng)量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)部供孵出的幼蟲(chóng)取食，在整個(gè)幼蟲(chóng)飼養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)接骨草的新鮮程度和被取食程度，更換和添加接骨草3 - 4次，飼養(yǎng)直至幼蟲(chóng)化蛹為止。所述第一步中每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)承裝蟲(chóng)蛹400 - 500頭。所述第三步中，先將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍以供孵出的幼蟲(chóng)取食，當(dāng)接骨草上的接蟲(chóng)量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)部供孵出的幼蟲(chóng)取食的操作步驟為先用細(xì)口瓶水培接骨草，并將細(xì)口瓶置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍，以供孵出的幼蟲(chóng)取食細(xì)口瓶中水培的接骨草，當(dāng)每個(gè)細(xì)口瓶中接骨草的接蟲(chóng)量達(dá)到80 - 120頭時(shí)，再將細(xì)口瓶及瓶中水培的接骨草一并轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲(chóng)容器中，每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器承裝4瓶接骨草，共飼養(yǎng)齡期一致的幼蟲(chóng)300 - 500頭，且在養(yǎng)蟲(chóng)容器上覆蓋雙層高密紗布以防止幼蟲(chóng)逃逸。所述細(xì)口瓶中水培的接骨草的原料使用狀態(tài)為當(dāng)接骨草長(zhǎng)至60cm以上，先用枝剪剪取該植株頂部25 - 30cm長(zhǎng)嫩梢，再選取8 - 10根長(zhǎng)度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶?jī)?nèi)水培。用所述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法；所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角體病毒，全稱為Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)稱為EcobNPV ；所述擴(kuò)繁EcobNPV的方法依次包括以下步驟
第一步先將感染病毒死亡的茶尺蠖蟲(chóng)尸加少量無(wú)菌水置組織勻漿器皿中勻漿 3min - 5min,再取出漿液按1 :6加無(wú)菌水混勻，然后在500r/min的條件下離心5min以去除細(xì)胞組織碎片和沉淀，再取上清液在3500r/min的條件下離心30 min，然后棄去上清液，并用無(wú)菌水懸浮沉淀，再重復(fù)上述離心操作2 - 3次以得到最終沉淀，然后將該最終沉淀用無(wú)菌水懸浮即可得到茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液；
第二步先將上述得到的茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液用無(wú)菌水稀釋至5X IO6PIB/ ml以得到病毒液，再在4°C下保存?zhèn)溆茫?br>
第三步按上述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法飼養(yǎng)茶尺蠖，在飼養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)茶尺蠖幼蟲(chóng)長(zhǎng)至3齡時(shí)開(kāi)始接種病毒，接種病毒采用上述病毒液進(jìn)行，接毒濃度為5X106PIB/ml，接毒方式為在每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)的接骨草上噴灑病毒液50ml，且初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換；
第四步接種病毒5天后開(kāi)始逐日收集染毒死蟲(chóng)，并將收集的蟲(chóng)尸與50%甘油按1 1的比例混合后置一 20°C下保存?zhèn)溆?，此時(shí)即可得到所需的EcobNPV。所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)為第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3齡幼蟲(chóng)。所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)為第1代茶尺蠖的3齡幼蟲(chóng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為
1、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中不僅涉及到茶尺蠖的飼養(yǎng)方法，而且提及了用該飼養(yǎng)方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，整個(gè)過(guò)程以EcobNPV的規(guī)?；a(chǎn)為目標(biāo)，應(yīng)用本發(fā)明可以獲得明確的養(yǎng)蟲(chóng)數(shù)據(jù)與產(chǎn)毒數(shù)據(jù)，根據(jù)試驗(yàn)本發(fā)明在飼養(yǎng)茶尺蠖時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照無(wú)顯著差異；本發(fā)明在擴(kuò)繁EcobNPV時(shí)，能使85%以上幼蟲(chóng)至末齡幼蟲(chóng)期染毒死亡，降低幼蟲(chóng)提早死亡或化蛹的比例，按照感病宿主蟲(chóng)尸生物量與病毒產(chǎn)量正相關(guān)原則，以接骨草為飼料增殖病毒量(平均每頭重量0. 0507g)高于茶葉養(yǎng)蟲(chóng)的產(chǎn)毒量(平均每頭重量0. 0490g)，產(chǎn)毒效率高，毒力強(qiáng)。因此，本發(fā)明不僅能替代茶葉對(duì)茶尺蠖進(jìn)行全年、 繼代的飼養(yǎng)，而且能滿足規(guī)模化生產(chǎn)EcobNPV的需要。2、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在飼養(yǎng)茶尺蠖時(shí)，用接骨草替代茶葉，接骨草(拉丁學(xué)名=Sambucus chinensis)的優(yōu)點(diǎn)如下首先，不僅養(yǎng)蟲(chóng)效果較好，而且產(chǎn)毒效率高、病毒毒力強(qiáng)；其次，接骨草不僅獲取方便、成本低廉，而且枯萎期長(zhǎng)、減少更換，一般只需更換3 - 4次即可，以3次為多，而現(xiàn)有飼料至少要替換4-6次或更多，大大增加了操作難度。因此本發(fā)明不僅成本低廉，而且操作難度較低。3、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在飼養(yǎng)茶尺蠖時(shí)，用 10%蔗糖溶液供成蟲(chóng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，其原因在于10%蔗糖溶液不僅能延長(zhǎng)成蟲(chóng)壽命，而且能顯著提高產(chǎn)卵量，有利于提高養(yǎng)蟲(chóng)效果與產(chǎn)毒效果。因此本發(fā)明的養(yǎng)蟲(chóng)效果與產(chǎn)毒效果均較好。4、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在擴(kuò)繁EcobNPV時(shí)，要求初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換的原因在于如果低于2天，則不能充分接毒，從而影響產(chǎn)毒效果。因此本發(fā)明的接毒效果較好、產(chǎn)毒效果較佳。5、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在擴(kuò)繁EcobNPV時(shí)，要求接種病毒的茶尺蠖幼蟲(chóng)為3齡幼蟲(chóng)的原因在于幼蟲(chóng)3齡前接毒相對(duì)敏感，4 - 5齡幼蟲(chóng)敏感性較差，為確保獲得較多的幼蟲(chóng)尸體以提高產(chǎn)毒量，故要求接種病毒的茶尺蠖幼蟲(chóng)為3 齡幼蟲(chóng)；同時(shí)，對(duì)于3齡幼蟲(chóng)要求其為第1代、第2代、第3代或第6代，尤以第1代為佳的原因在于在茶尺蠖不同世代中，以第1代、第2代、第3代或第6代發(fā)生期的溫度更適宜繁殖病毒，故其病毒產(chǎn)量較高，尤其以第1代的病毒產(chǎn)量最高。因此本發(fā)明的產(chǎn)毒效果較佳。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，該方法依次包括以下步驟
第一步先采集健康茶尺蠖(Ectropis obliqua Warren)的蛹，再置于消毒后的養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)，并在室溫下飼養(yǎng)至成蟲(chóng)羽化；
第二步待上述蟲(chóng)蛹羽化后，先在養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)放入10%蔗糖溶液供成蟲(chóng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，再用高密紗布覆蓋養(yǎng)蟲(chóng)容器供交配后的雌蟲(chóng)在其表面產(chǎn)卵；
第三步始見(jiàn)卵孵出幼蟲(chóng)后，開(kāi)始用接骨草(Sambucus chinensis)喂養(yǎng)茶尺蠖幼蟲(chóng)，先將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍以供孵出的幼蟲(chóng)取食，當(dāng)接骨草上的接蟲(chóng)量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)部供孵出的幼蟲(chóng)取食，在整個(gè)幼蟲(chóng)飼養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)接骨草的新鮮程度和被取食程度，更換和添加接骨草3 - 4次，飼養(yǎng)直至幼蟲(chóng)化蛹為止。所述第一步中每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)承裝蟲(chóng)蛹400 - 500頭。所述第三步中，先將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍以供孵出的幼蟲(chóng)取食，當(dāng)接骨草上的接蟲(chóng)量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)部供孵出的幼蟲(chóng)取食的操作步驟為先用細(xì)口瓶水培接骨草，并將細(xì)口瓶置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍，以供孵出的幼蟲(chóng)取食細(xì)口瓶中水培的接骨草，當(dāng)每個(gè)細(xì)口瓶中接骨草的接蟲(chóng)量達(dá)到80 - 120頭時(shí)，再將細(xì)口瓶及瓶中水培的接骨草一并轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲(chóng)容器中，每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器承裝4瓶接骨草，共飼養(yǎng)齡期一致的幼蟲(chóng)300 - 500頭，且在養(yǎng)蟲(chóng)容器上覆蓋雙層高密紗布以防止幼蟲(chóng)逃逸。所述細(xì)口瓶中水培的接骨草的原料使用狀態(tài)為當(dāng)接骨草長(zhǎng)至60cm以上，先用枝剪剪取該植株頂部25 - 30cm長(zhǎng)嫩梢，再選取8 - 10根長(zhǎng)度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶?jī)?nèi)水培。用所述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法；所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角體病毒，全稱為Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)稱為EcobNPV ；所述擴(kuò)繁EcobNPV的方法依次包括以下步驟
第一步先將感染病毒死亡的茶尺蠖蟲(chóng)尸加少量無(wú)菌水置組織勻漿器皿中勻漿 3min - 5min,再取出漿液按1 :6加無(wú)菌水混勻，然后在500r/min的條件下離心5min以去除細(xì)胞組織碎片和沉淀，再取上清液在3500r/min的條件下離心30 min，然后棄去上清液，并用無(wú)菌水懸浮沉淀，再重復(fù)上述離心操作2 - 3次以得到最終沉淀，然后將該最終沉淀用無(wú)菌水懸浮即可得到茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液；
第二步先將上述得到的茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液用無(wú)菌水稀釋至5X IO6PIB/ ml以得到病毒液，再在4°C下保存?zhèn)溆茫?br>
第三步按上述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法飼養(yǎng)茶尺蠖，在飼養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)茶尺蠖幼蟲(chóng)長(zhǎng)至3齡時(shí)開(kāi)始接種病毒，接種病毒采用上述病毒液進(jìn)行，接毒濃度為5 X 106PIB/ml，接毒方式為在每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)的接骨草上噴灑病毒液50ml，且初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換；
第四步接種病毒5天后開(kāi)始逐日收集染毒死蟲(chóng)，并將收集的蟲(chóng)尸與50%甘油按1 1的比例混合后置一 20°C下保存?zhèn)溆茫藭r(shí)即可得到所需的EcobNPV。
所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)為第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3齡幼蟲(chóng)。所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)為第1代茶尺蠖的3齡幼蟲(chóng)。本發(fā)明的原理說(shuō)明如下
一、接骨草
替代性強(qiáng)接骨草為茶尺蠖野生寄主植物，幼蟲(chóng)喜食，生長(zhǎng)發(fā)育正常。在武漢地區(qū)，以接骨草為飼料飼養(yǎng)茶尺蠖(第4代)，幼蟲(chóng)發(fā)育歷期14. 5天，存活率85. 7%，蛹?xì)v期8. 25天，羽化率84. 3%，每雌平均產(chǎn)卵量138. 6粒，其各項(xiàng)生物學(xué)特征參數(shù)與茶葉飼養(yǎng)的參數(shù)值無(wú)顯著性差異。成本低廉接骨草為多年生草本植物，喜溫濕氣候，分布廣泛，在我國(guó)浙江、安徽、 江西、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、四川等省區(qū)野生或栽培，其人工栽培可種子繁殖或分株繁殖。通常在茶園附近、林間、溝邊生長(zhǎng)，來(lái)源廣泛，容易獲得，成本十分低廉。更換次數(shù)少接骨草出現(xiàn)萎蔫一般在5天以上，比茶葉從投料至更換需要的時(shí)間更長(zhǎng)，有利于減少換料次數(shù)，一般只需更換3 - 4次即可，以3次為多，而現(xiàn)有飼料至少要替換4-6次或更多。同時(shí)，本發(fā)明對(duì)接骨草的原料使用狀態(tài)要求為當(dāng)接骨草長(zhǎng)至60cm以上， 先用枝剪剪取該植株頂部25 - 30cm長(zhǎng)嫩梢，再選取8 - 10根長(zhǎng)度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶?jī)?nèi)水培。由此可見(jiàn)，不僅要求剪取生命力較強(qiáng)的嫩梢，而且用水培的方法來(lái)延長(zhǎng)嫩梢的生命力，因此該原料使用狀態(tài)能夠進(jìn)一步減少接骨草在飼養(yǎng)中的更換次數(shù)。試驗(yàn)1 接骨草與茶葉飼養(yǎng)茶尺蠖的效果對(duì)比試驗(yàn)
本試驗(yàn)自2010年7月27日至2010年9月10日，采用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖一個(gè)世代， 以茶葉喂養(yǎng)為對(duì)照。參見(jiàn)表1，結(jié)果表明，以接骨草飼養(yǎng)的茶尺蠖幼蟲(chóng)發(fā)育歷期14. 5天，比對(duì)照延長(zhǎng)了 1 - 2天，幼蟲(chóng)存活率85. 7%，蛹重89. 78mg,蛹發(fā)育歷期8. 25天，羽化率84. 3%， 每雌平均產(chǎn)卵量138. 6粒，卵孵化率86. 4%，其各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照無(wú)顯著差異。通過(guò)試驗(yàn)觀察還發(fā)現(xiàn)，水培接骨草存放時(shí)間久，出現(xiàn)萎蔫一般在5天以上，比茶葉投料至更換飼料時(shí)間更長(zhǎng)，減少換料次數(shù)，節(jié)省人工。
表1 接骨萆與茶葉餌養(yǎng)茶尺蠖的效果對(duì)比試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于該方法依次包括以下步驟第一步先采集健康茶尺蠖(Ectropis oblique Warren)的蛹，再置于消毒后的養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)，并在室溫下飼養(yǎng)至成蟲(chóng)羽化；第二步待上述蟲(chóng)蛹羽化后，先在養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)放入10%蔗糖溶液供成蟲(chóng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，再用高密紗布覆蓋養(yǎng)蟲(chóng)容器供交配后的雌蟲(chóng)在其表面產(chǎn)卵；第三步始見(jiàn)卵孵出幼蟲(chóng)后，開(kāi)始用接骨草(Sambucus chinensis)喂養(yǎng)茶尺蠖幼蟲(chóng)，先將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍以供孵出的幼蟲(chóng)取食，當(dāng)接骨草上的接蟲(chóng)量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)部供孵出的幼蟲(chóng)取食，在整個(gè)幼蟲(chóng)飼養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)接骨草的新鮮程度和被取食程度，更換和添加接骨草3 - 4次，飼養(yǎng)直至幼蟲(chóng)化蛹為止。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于所述第一步中每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)承裝蟲(chóng)蛹400 - 500頭。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于所述第三步中，先將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍以供孵出的幼蟲(chóng)取食，當(dāng)接骨草上的接蟲(chóng)量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)部供孵出的幼蟲(chóng)取食的操作步驟為先用細(xì)口瓶水培接骨草，并將細(xì)口瓶置于養(yǎng)蟲(chóng)容器周圍，以供孵出的幼蟲(chóng)取食細(xì)口瓶中水培的接骨草，當(dāng)每個(gè)細(xì)口瓶中接骨草的接蟲(chóng)量達(dá)到80 - 120頭時(shí)，再將細(xì)口瓶及瓶中水培的接骨草一并轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲(chóng)容器中，每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器承裝4瓶接骨草，共飼養(yǎng)齡期一致的幼蟲(chóng)300 - 500頭，且在養(yǎng)蟲(chóng)容器上覆蓋雙層高密紗布以防止幼蟲(chóng)逃逸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于所述細(xì)口瓶中水培的接骨草的原料使用狀態(tài)為當(dāng)接骨草長(zhǎng)至60cm以上，先用枝剪剪取該植株頂部25 -30cm長(zhǎng)嫩梢，再選取8- 10根長(zhǎng)度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶?jī)?nèi)水培。
5.用權(quán)利要求1所述的接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其特征在于所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角體病毒，全稱為Ectropis grisescens nucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)稱為EcobNPV ；所述擴(kuò)繁EcobNPV的方法依次包括以下步驟第一步先將感染病毒死亡的茶尺蠖蟲(chóng)尸加少量無(wú)菌水置組織勻漿器皿中勻漿 3min - 5min，再取出漿液按1 :6加無(wú)菌水混勻，然后在500r/min的條件下離心5min以去除細(xì)胞組織碎片和沉淀，再取上清液在3500r/min的條件下離心30 min，然后棄去上清液，并用無(wú)菌水懸浮沉淀，再重復(fù)上述離心操作2 - 3次以得到最終沉淀，然后將該最終沉淀用無(wú)菌水懸浮即可得到茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液；第二步先將上述得到的茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液用無(wú)菌水稀釋至5X IO6PIB/ ml以得到病毒液，再在4°C下保存?zhèn)溆?；第三步按上述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法飼養(yǎng)茶尺蠖，在飼養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)茶尺蠖幼蟲(chóng)長(zhǎng)至3齡時(shí)開(kāi)始接種病毒，接種病毒采用上述病毒液進(jìn)行，接毒濃度為5 X 106PIB/ml，接毒方式為在每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)容器內(nèi)的接骨草上噴灑病毒液50ml，且初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換；第四步接種病毒5天后開(kāi)始逐日收集染毒死蟲(chóng)，并將收集的蟲(chóng)尸與50%甘油按1 1的比例混合后置一 20°C下保存?zhèn)溆?，此時(shí)即可得到所需的EcobNPV。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其特征在于所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)為第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3齡幼蟲(chóng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其特征在于所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)為第1代茶尺蠖的3齡幼蟲(chóng)。
全文摘要
接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法，包括接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，以及用該飼養(yǎng)方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其核心是用接骨草替代茶葉飼養(yǎng)茶尺蠖，并配合各種飼養(yǎng)操作與擴(kuò)繁操作以提高養(yǎng)蟲(chóng)效果與產(chǎn)毒效果，不僅能克服傳統(tǒng)飼料無(wú)法全年、繼代飼養(yǎng)茶尺蠖的難題，而且能解決EcobNPV大量擴(kuò)繁的難題。本設(shè)計(jì)不僅成本低廉、操作難度較低，而且產(chǎn)毒效率較高、病毒毒力較強(qiáng)，能夠滿足規(guī)?；a(chǎn)EcobNPV的需要。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102550490SQ20121000311
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者劉明炎, 毛迎新, 譚榮榮, 龔自明 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所