肺癌和結(jié)直腸癌中的bard1同工型及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：肺癌和結(jié)直腸癌中的bard1同工型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的新型BARDl同工型、其檢測(cè)方法和用于治療和/或預(yù)防肺癌和結(jié)直腸癌的方法。
背景技術(shù)：
肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因。外科手術(shù)之外的治療方法不是非常有效并且會(huì)引起抗性。因此，迫切需要了解肺癌及其發(fā)展的病因?qū)W。結(jié)直腸癌是癌癥相關(guān)死亡的另一主要原因，是全球第四大常見癌癥。結(jié)直腸癌患者的存活和預(yù)后取決于診斷時(shí)的腫瘤階段。早期結(jié)直腸癌是可以被治愈的。不幸的是，在診斷時(shí)超過57%的患者該疾病已經(jīng)區(qū)域性擴(kuò)散或遠(yuǎn)端擴(kuò)散。盡管在處理癌癥中進(jìn)行了巨大投資并取得了發(fā)展，但是對(duì)于晚期結(jié)直腸癌患者而言五年存活率僅為15%。最近，許多研究組通過將腫瘤中的蛋白、RNA和微RNA與健康組織進(jìn)行比較而提出了驅(qū)動(dòng)肺癌的機(jī)制。除了 TP53(肺癌中最常缺失或突變的基因)之外，認(rèn)為P53-ARF途徑的組分也缺失、突變或在表觀遺傳學(xué)上經(jīng)修飾。對(duì)于結(jié)直腸癌，挑戰(zhàn)在于理解分子基礎(chǔ)，和確定引起形成(development)和驅(qū)動(dòng)發(fā)展的因素。涉及結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移性發(fā)展的分子事件僅被部分地分類。最近的研究已經(jīng)揭示了結(jié)直腸癌中的分子和生化標(biāo)志物在預(yù)測(cè)化療的后果和對(duì)化療的反應(yīng)上的潛在應(yīng)用，如MLH1、MSH2、β -連環(huán)蛋白和ρ53。分子譜圖作為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的預(yù)測(cè)和預(yù)后參數(shù)而出現(xiàn)，包括DNA損傷修復(fù)中涉及的基因，例如ERCCURRM1和BRCA1。提出了將乳癌易感基因BRCAl的上調(diào)表達(dá)作為對(duì)NSCLC治療的反應(yīng)的預(yù)后和預(yù)測(cè)標(biāo)志物。關(guān)于結(jié)直腸癌，BRCAl的研究主要受限于結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)和BRCAl突變。數(shù)種研究試圖將BRCAl突變與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)起來，但沒有任何明確的結(jié)論。基于當(dāng)前有限的可利用證據(jù)，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為BRCA突變攜帶者具有較高額度結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)。但是結(jié)·直腸癌中BRCAl表達(dá)的具體作用是不清楚的。BRCAl在許多增生組織中表達(dá)并且在DNA修復(fù)途徑和細(xì)胞周期控制中充當(dāng)腫瘤抑制劑。BRCAl蛋白穩(wěn)定性和功能取決于其與BARDl (BRCA1相關(guān)的RING結(jié)構(gòu)域蛋白I)的相互作用。BRCA1-BARD1異二聚體具有E3泛素連接酶活性，由此通過泛素化控制關(guān)鍵靶蛋白的穩(wěn)定性。BARDl還參與p53-依賴性凋亡，在大多數(shù)肺癌中p53_依賴性凋亡是有缺陷的。BARDl穩(wěn)定p53和促進(jìn)其磷酸化，p53在導(dǎo)致凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮正確功能需要BARDl的表達(dá)。因此，BARDl在腫瘤抑制中起雙重作用，同時(shí)為BRCAl和p53的結(jié)合伴侶。數(shù)個(gè)研究已經(jīng)顯示，BARDl在有絲分裂過程中上調(diào)，通過E2F進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和通過磷酸化進(jìn)行翻譯后修飾，并且重要的是，其對(duì)于有絲分裂是重要的。根據(jù)其它研究，BRCAl和BARDl都顯示與hMSH2(通常與遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(HNPCC)相關(guān)的基因)相互作用，hMSH2的突變似乎占HNPCC的約30 40%。BRCAl-hMSH2信號(hào)傳導(dǎo)過程的缺陷導(dǎo)致對(duì)腫瘤形成的易感性增加。W098/12327 (Board of Regents,德克薩斯大學(xué)系統(tǒng))公開了在基于與乳癌蛋白BRCAl結(jié)合的篩選檢測(cè)中鑒定出的數(shù)種基因。這些基因中的一種稱為BARDl，是與BRCAl相互作用的RING蛋白，并且設(shè)想了其在各種癌癥相關(guān)診斷和治療方法中的應(yīng)用，特別是與乳癌、卵巢癌和子宮癌相關(guān)的診斷和治療方法中的應(yīng)用。W02008/119802(日內(nèi)瓦大學(xué))公開了在婦科癌癥中，帶有缺失的BARDl同工型過表達(dá)，異常地定位到細(xì)胞質(zhì)，并且它們的表達(dá)與乳癌和卵巢癌的預(yù)后不良相關(guān)。這些同工型的結(jié)構(gòu)分析表明，它們?nèi)狈εcBRCAl相互作用或誘導(dǎo)凋亡的區(qū)域。這些同工型對(duì)于婦科癌癥具有特異性，被命名為α、β、η、Y、ε、φ、δ和Θ。由于肺癌和結(jié)直腸癌的嚴(yán)重性和不可治愈性，仍然需要開發(fā)可鑒別這些癌癥的有效檢測(cè)方法，和需要進(jìn)一步開發(fā)治療或預(yù)防這些癌癥的有效方法和組合物。主要問題在于，迄今為止尚未開發(fā)出解決該問題的有效方法或策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)獲自受試對(duì)象的生物樣品中對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括檢測(cè)所述樣品中對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的至少一種BARDl同工型的步驟，所述至少一種BARDl同工型選自包含以下同工型的組:同工型JI，同工型JI包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和同工型K，同工型K包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中，在獲自所述受試對(duì)象的樣品中所述對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在是所述受試對(duì)象罹患肺癌和/或結(jié)直腸癌、患肺癌和/或結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增力口、以及/或者治療肺癌和/或結(jié)直腸癌 后具有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志。本發(fā)明還提供一種在權(quán)利要求1 6所述的方法中用作生物標(biāo)志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或與SEQ IDNO:1具有至少95%同源性的序列；和提供一種在權(quán)利要求1 6所述的方法中用作生物標(biāo)志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列。本發(fā)明另一目的是選自包含SEQ ID NO:13 80的組中的肽，所述肽用于本發(fā)明的檢測(cè)BARDl同工型的存在的方法。本發(fā)明的另一目的是用于檢測(cè)獲自受試對(duì)象的樣品中對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在的試劑盒，所述試劑盒包含:至少一種多核苷酸引物或探針，其中所述多核苷酸引物或探針對(duì)編碼至少一種所述BARDl同工型的多核苷酸具有特異性，所述BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO: 1-7,105-106、其生物活性片段和/或與SEQ ID NO:1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列，和/或與至少一種所述BARDl同工型的不同表位特異性結(jié)合的抗體或其片段的組合，所述BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO:1_7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO:1-7,105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列，和/或至少一種選自包含SEQ ID NO: 13 80的組的肽。
本發(fā)明還涉及一種將肺癌和結(jié)直腸癌與婦科癌癥相區(qū)分的方法，所述方法包括檢測(cè)獲自受試對(duì)象的生物樣品中至少一種對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的步驟，所述BARDl同工型選自包含以下同工型的組:包含SEQ ID NO:1的同工型π、其生物活性片段或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和
包含SEQ ID NO:2的同工型κ、其生物活性片段或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中所述對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在是肺癌和/或結(jié)直腸癌的標(biāo)志。另外，本發(fā)明涉及在治療和/或預(yù)防肺癌和結(jié)直腸癌的方法中使用的抗體、重組siRNA和本發(fā)明的BARDl同工型的生物活性調(diào)節(jié)劑。


圖1 顯示了 NSCLC 中的 BARDl 表達(dá)。用 BARDl 抗體 Ν19、C20、PVC、WFS 和 BRCAl對(duì)100個(gè)NSCLC病例進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。(A)具有上述蛋白基序作為RING指(RING)、錨蛋白重復(fù)(ANK)和BRCT結(jié)構(gòu)域的BARDl外顯子(1_11)的示意性表示。標(biāo)明各種抗體識(shí)別的表位的大概位置(N19、PVC、WFS、C20)。(B-D)使用BARDl抗體和BRCAl抗體的免疫組織化學(xué)染色的實(shí)例。BARD1N19和C20顯示出細(xì)胞質(zhì)顆粒狀染色，并且有時(shí)共定位在相同的細(xì)胞或區(qū)域。BARDIPVC和WFS染色是細(xì)胞質(zhì)的染色或彌漫性細(xì)胞核和彌漫性細(xì)胞質(zhì)的染色。BRCAl染色與BARD1N19染色共定位(B)。示出了未被或幾乎未被PVC和WFS (C)染色的實(shí)例和被N19和C20染色(D)可忽略不計(jì)的實(shí)例。標(biāo)明了比例尺(上圖=200 μ m ;下圖=100 μ m)。(E)觀察到的用所有四種N19、PVC、WFS和C20探測(cè)的100個(gè)NSCLC病例中的73個(gè)的染色?！?+ ”表示陽性染色，表示陰性染色。具有所有四種抗體的陽性染色是頻率最高的表達(dá)模式。(F)BARD1N19、PVC、WFS和C20染色的成對(duì)比較。BARD1N19和C20以及PVC和WFS強(qiáng)相關(guān)。在N19和PVC之間、N19和WFS之間、C20和PVC之間、C20和WFS之間觀察到弱相關(guān)或不相關(guān)。圖2顯示了在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中的BARDl表達(dá)的比較以及與臨床特征的相關(guān)性。(A) 20名(10名男性和10名女性)NSCLC患者的腫瘤組織和腫瘤周圍組織中的BARD1N19.BARD1C20和BRCAl染色的比較。與“正?！苯M織相比，腫瘤組織中所有抗體的染色增加。(B)在10名女性和10名男性NSCLC患者的腫瘤組織中測(cè)試BARD1N19、BARDIC20和BRCAl染色。與男性患者相比，來自女性患者的腫瘤中所有抗體的染色增加。(C) 100個(gè)NSCLC病例中BARD抗體染色和腫瘤類型的比較。陽性染色在非-腺癌(AC)(包括鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌)中比在腺癌中頻率更高。PVC和WFS染色增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(D-E)BARDl表達(dá)與患者存活的相關(guān)性。(D)如圖1E所定義的根據(jù)4種抗體陽性染色的組合和小于4種抗體陽性染色的組合進(jìn)行的無病存活(DFS)的Kaplan-Meyer分析。(E)如圖1E所定義的根據(jù)4種抗體陽性染色的組合和小于4種抗體陽性染色的組合進(jìn)行的總存活(OS)的 Kaplan-Meyer 分析。圖3顯示了在誘導(dǎo)了肺癌的實(shí)驗(yàn)小鼠模型中BARDl同工型表達(dá)的時(shí)間過程。(A)經(jīng)尿烷(urethane)處理的動(dòng)物的形態(tài)學(xué)正常的肺組織(正常)中的BARDl表達(dá)。在16周(wk)時(shí)BARD1PVC和WFS表位在一些II型肺泡上皮細(xì)胞中檢測(cè)出，但未在I型肺泡上皮細(xì)胞中檢測(cè)出。在24周和32周時(shí)所有表位都在II型和I型肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)，并且從24周至32周表達(dá)上調(diào)。C20染色與其它相反:在16周時(shí)強(qiáng)染色，在24周時(shí)弱染色，在32周時(shí)幾乎是陰性的。(B)腫瘤中的BARDl表達(dá)。在腫瘤區(qū)，從16周至32周BARD1PVC、特別是WFS表達(dá)上調(diào)，而從16周至32周C20表達(dá)下調(diào)。(C-D)在三只小鼠的正常(C)組織和腫瘤
(D)組織中的BARDl表位的表達(dá)模式。標(biāo)出了染色分?jǐn)?shù)、陽性細(xì)胞百分比(O表示陰性染色、I 4表示具有陽性染色的細(xì)胞的強(qiáng)度和數(shù)量增加)。圖4顯示了人肺腫瘤組織和腫瘤周圍組織中BARDl轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)和結(jié)構(gòu)。(A-D)用擴(kuò)增整個(gè)BARDl編碼區(qū)(一個(gè)或多個(gè))的引物進(jìn)行RT-PCR，該編碼區(qū)包含外顯子1_4或1-6。擴(kuò)增GAPDH作為對(duì)照RT-PCR。分子尺寸標(biāo)志物(M)示于左側(cè)。推定的FL BARDl和不同剪接的同工型示于右側(cè)。(A)正常肺組織中的BARD1RNA表達(dá)。對(duì)具有良性肺疾病的個(gè)體的肺活檢組織進(jìn)行的RT-PCR(參見方法部分)顯示BARDl表達(dá)在多數(shù)樣品中不存在，并且在8個(gè)病例中的5個(gè)中顯示各同工型(Y、δ、η)的擴(kuò)增。(B)使用外顯子I中的正向引物、在外顯子11或外顯子4中的反向引物對(duì)FL BARDl和截短的同工型進(jìn)行的擴(kuò)增。對(duì)于來自男性和女性患者的組織，顯示了成對(duì)的正常腫瘤周圍(N)組織和腫瘤(T)組織的實(shí)例。推定的FL BARDl和不同剪接的同工型示于右側(cè)。正常組織和腫瘤組織表達(dá)相同模式的同工型。(C)對(duì)外顯子I 6進(jìn)行擴(kuò)增以區(qū)分FL BARDU β和新型同工型κ和Ji。同工型η在腫瘤中特異性表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或弱表達(dá)。(D)在多數(shù)病例中發(fā)現(xiàn)了通過RT-PCR確定的雌激素受體α的表達(dá)。在男性和女性的正常樣品和腫瘤樣品中發(fā)現(xiàn)類似的表達(dá)水平。(E)已知BARDl同工型和肺癌特異性新形式的同工型κ和Ji的結(jié)構(gòu)。指出了 FL BARDl的示意性外顯子(I 11)結(jié)構(gòu)與蛋白特征(RING，ANK，BRCT)和核定位信號(hào)(NLS)，以及引物的位置。下方以灰·色示出同工型的示意性假定蛋白結(jié)構(gòu)，以白色示出非編碼外顯子，并且以淺灰點(diǎn)(點(diǎn))示出選擇性開放閱讀框(β、Υ和H)。示出了新型同工型κ，其外顯子3缺失并且推定的翻譯起點(diǎn)(ATG)在外顯子4內(nèi)。將新型同工型π指定為具有外顯子4內(nèi)的缺失，指出了定位到該區(qū)域內(nèi)的已知BARDl突變和多態(tài)性。同工型的指定名稱示于左側(cè)，大小(氨基酸)和分子量(MW)示于右側(cè)。圖5顯示了在女性和男性NSCLC患者的形態(tài)學(xué)正常的腫瘤周圍組織(左側(cè))中和在腫瘤組織(右側(cè))中的BARDKBRCAI和Aurora B表達(dá)的比較。利用BARDl (N19和C20)以及C末端特異性抗體p8、BRCAl和Aurora B抗體染色進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。符號(hào)n=細(xì)胞核染色。圖6顯示了外顯子4內(nèi)的選擇性剪接和/或轉(zhuǎn)錄起始。(A)用外顯子(Ex) 4、外顯子5和外顯子6內(nèi)的正向引物(位于左側(cè))和外顯子11中的反向引物(位于右側(cè))擴(kuò)增的BARDl的各種片段的圖。引物的位置和擴(kuò)增帶的預(yù)期大小在括號(hào)中標(biāo)出(bp)。⑶示出了用A所示的引物對(duì)在男性(左圖)和女性(右圖)NSCLC患者的人肺腫瘤組織(T)和鄰近的正常腫瘤周圍組織(N)中的BARDl轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行的擴(kuò)增。注意用外顯子4內(nèi)的引物進(jìn)行的擴(kuò)增在不同樣品中是可變的，但所有樣品都可以用外顯子5或外顯子6內(nèi)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。BARDl mRNA和蛋白表達(dá)的變化可能歸因于該區(qū)域中轉(zhuǎn)錄的選擇性剪接或不同起始。圖7示出了在女性和男性患者的腫瘤組織(腫瘤)和腫瘤周圍組織(正常)中BARDl mRNA同工型表達(dá)的比較和相關(guān)性。對(duì)20對(duì)腫瘤/形態(tài)學(xué)上正常的組織樣品(包括10名男性和10名女性)的FL BARDl和BARDl同工型進(jìn)行評(píng)分并將其示出。用ImageJ軟件對(duì)表達(dá)進(jìn)行定量(參見方法部分)。結(jié)果在圖中表示為值的平均值土SE(標(biāo)準(zhǔn)誤差)。(A)腫瘤周圍組織和腫瘤組織中FL BARDl和同工型的比較。除了同工型β和κ之外，所有同工型在腫瘤中上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(B-C)在男性(B)和女性(C)中，F(xiàn)LBARDI和BARDl同工型都在腫瘤組織中比在腫瘤周圍組織中更豐富。(D/E)腫瘤組織(D)中和正常組織(E)中男性和女性之間BARDI表達(dá)的比較。在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中，BARDl同工型β和κ在來自男性的組織中比來自女性的組織中表達(dá)更多。這具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中，F(xiàn)L BARDl和BARDl同工型γ、ε和η在來自女性的組織中可能比來自男性的組織中表達(dá)更多，但這不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(F)在年輕(〈60歲)和老年(>60歲)患者組中FL BARDl和同工型的比較。FL BARDl和同工型Y在年輕(〈60歲)患者中上調(diào)。這具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖8顯示了結(jié)直腸癌中BARDl和BRCAl表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析的實(shí)例。通過BARDl抗體N19、C20、PVC、WFS和BRCAl對(duì)148個(gè)結(jié)直腸癌病例的樣品進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。將所有樣品都表示為組織微陣列，每個(gè)病例一式四份。免疫組織化學(xué)檢測(cè)后145個(gè)樣品對(duì)于分析是合格的。⑷針對(duì)BARDl的BRCAl抗體的陽性染色病例的頻率。四個(gè)抗體中的每一個(gè)的陽性染色率是可變的。BARDl N19和C20染色以及BRCAl染色頻率較低。在多數(shù)結(jié)直腸癌病例中觀察到BARDl PVC和WFS陽性染色。(B)結(jié)直腸癌中的BARDl表達(dá)模式?；诿總€(gè)病例的陽性⑴染色和陰性㈠染色，用4種BARDl抗體獲得表達(dá)模式。PVC和WFS陽性染色，但N19和C20陰性染色是頻率最高的表達(dá)模式，“所有四種抗體陽性”染色其次，N19陰性但PVC、WFS和C20陽性染色是觀察到的頻率第三高的表達(dá)模式。(C-F)使用BARDl抗體和BRCAl抗體的免疫組織染色的實(shí)例。BARDl N19和C20顯示出細(xì)胞質(zhì)顆粒狀染色，并且共定位在相同的細(xì)胞和區(qū)域。BARDl PVC和WFS染色是彌漫性細(xì)胞質(zhì)的。BRCAl染色在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都是顆粒狀。示出了以下實(shí)例:使用BARDl抗體和BRCAl抗體的陽性染色(C)、使用N-19和C20(D)的可忽略不計(jì)的染色(D)、使用所有四種BARDl抗體的陽性染色
(E)和使用N19(F)的陰性染色。標(biāo)明了比例尺(上圖=200 μ m;下圖=50 μ m)。圖9顯示了對(duì)于結(jié)直腸癌中BARDl和BRCAl的不同抗體染色之間的相關(guān)性。(A)BARDl N19、PVC、WFS和C20染色的相關(guān)性。BARDl N19和C20染色強(qiáng)相關(guān)，PVC和WFS、PVC和C20以及WFS和C20弱相關(guān)。N19和PVC之間以及N19和WFS之間未觀察到相關(guān)。(B)BRCAl和BARDl的抗體染色的相關(guān)性。BRCAl染色不與四種BARDl抗體的任何染色相關(guān)。圖10顯示了 BARDl和BRCAl的不同表位表達(dá)與結(jié)直腸癌中的臨床變量的相關(guān)性。BARDl N19陽性染色在女性中頻率更高(P=0.014) (A)。在不同抗體的BARDl和BRCAl染色與腫瘤組織病理學(xué)級(jí)別(級(jí)別)(B)、腫瘤大小或附近的組織浸潤(rùn)(腫瘤)(C)、淋巴結(jié)累及(結(jié))(D)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移)(E)和腫瘤階段(階段)(F)之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。通過X 2檢驗(yàn)獲得P值。圖11顯示了結(jié)直腸癌組織(T )和正常腫瘤周圍組織(N)中BARDl轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)和結(jié)構(gòu)。(A)使用外顯子I中的正向引物和外顯子Il(Exl-1l)或外顯子4(Exl-4)中的反向引物對(duì)FL BARDl和/或截短的同工型進(jìn)行的擴(kuò)增。作為實(shí)例，示出了 5名男性患者和5名女性患者的成對(duì)的腫瘤周圍組織和腫瘤組織。對(duì)于相同的樣品示出甘油醛3-磷酸脫氫酶表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)物。分子標(biāo)志物示于左側(cè)(M)。推定的FL BARDl和截短的同工型示于右偵U。腫瘤周圍組織和腫瘤組織表達(dá)不同模式的同工型:腫瘤周圍組織比腫瘤組織中的表達(dá)頻率低。也在NSCLC中鑒定出的兩種新型同工型，κ和Ji，在結(jié)直腸癌中表達(dá)。(B)相同樣品中雌激素受體a (ERa)的擴(kuò)增，使用MCF-7作為陽性對(duì)照(右側(cè))。在結(jié)直腸組織中，無論在男性還是女性的腫瘤周圍樣品中還是腫瘤樣品中都未觀察到ERa表達(dá)。圖12示出了在患有結(jié)直腸癌的男性和女性患者的腫瘤組織(腫瘤)和腫瘤周圍(正常)組織中的BARDl mRNA同工型表達(dá)的比較。對(duì)結(jié)直腸癌的20對(duì)腫瘤組織/腫瘤周圍組織樣品(包括10名男性和10名女性)的FL BARDl和BARDl同工型進(jìn)行評(píng)分并將其示出?；诟鱾€(gè)腫瘤周圍樣品或腫瘤樣品(A)中的存在或不存在，和各個(gè)同工型(B、C、D)的表達(dá)的存在或不存在，對(duì)表達(dá)進(jìn)行定量。(A)基于任何形式的BARDl的存在和不存在，對(duì)腫瘤周圍組織和腫瘤組織中(包括在男性樣品、女性樣品中和在聯(lián)合樣品中)BARDl表達(dá)的比較。無論在女性(P=O-OOlO)中還是在男性(P=0.0679)中，BARDl表達(dá)在來自腫瘤的組織中比在來自腫瘤周圍的組織中更豐富和頻率更高(P=0.0003)。(B)腫瘤周圍組織和腫瘤組織中的FL BARDl和同工型表達(dá)的比較。腫瘤中所有形式都上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(對(duì)于所有形式P〈0.05)。(C/D)在來自男性和女性的結(jié)直腸組織中的FL BARDl和同工型表達(dá)的比較。無論在腫瘤周圍組織(C)中還是在腫瘤組織(D)中，F(xiàn)L BARDl和同工型的表達(dá)在來自男性和女性的組織中相似(對(duì)于所有形式P〈0.05)。通過X 2檢驗(yàn)獲得P值。圖13顯示FL BARDl和同工型mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌中的臨床病理變量的相關(guān)性。(A)在年輕(〈60歲)和老年(>60歲)患者中FL BARDl和同工型表達(dá)的比較。FL BARDl和除同工型β之外的所有同工型，在老年患者中比在年輕患者中上調(diào)更多。具體而言，同工型φ、δ和Ji的表達(dá)與老年患者顯著相關(guān)(P〈0.01)。(B-E)通過原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)狀態(tài)、以及腫瘤階段和級(jí)別，比較FL BARDl和同工型表達(dá)。BARDl同工型κ表達(dá)與較大尺寸的腫瘤或附近的組織浸潤(rùn)(B)、淋巴結(jié)累積(C)、以及晚期(III期和IV期)(D)顯著相關(guān)。在BARDl同工型表達(dá)和腫瘤組織病理學(xué)級(jí)別之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(E)。通過X 2檢驗(yàn)獲得P值。未示出Ρ>0.05的比較 。圖14顯示用于對(duì)血液或血清中的BARDl同工型特異性抗體檢測(cè)的ELISA測(cè)試的實(shí)例。圖15顯示用位于ATG處和π中的缺失連接(deletion junction)處的引物進(jìn)行的同工型η的擴(kuò)增。鑒定出由外顯子2的另外缺失導(dǎo)致的第二同工型，π’。圖16顯示了對(duì)HeLa、MCF7、RPEl和NLF細(xì)胞用抗-Bardl抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡。Ab Bethyl BL518 (BL)識(shí)別在中部外顯子4中編碼的表位。針對(duì)由外顯子I中的β-特異性選擇性O(shè)RF編碼的表位產(chǎn)生Ab PGP。識(shí)別了 BARDl同工型β和BARDl同工型β-d_5 ( β ’)和BARDl同工型η。圖17顯示BARDl同工型的siRNA抑制。A) siRNA靶序列的位置。使用外顯子4中的兩個(gè)siRNA，K401和K423。K401位于同工型π的缺失內(nèi)，Κ423在缺失的上游。B_C)K401比K423對(duì)生長(zhǎng)的作用小。B) siRNA表達(dá)與GFP表達(dá)相結(jié)合。許多陽性細(xì)胞在表達(dá)K401的細(xì)胞中生長(zhǎng)，少量在表達(dá)K423的細(xì)胞中生長(zhǎng)。C)生長(zhǎng)曲線確認(rèn)，K423抑制細(xì)胞生長(zhǎng)與之前報(bào)道的靶向所有形式的BARDl的K78 —樣有效。圖18顯示微RNA影響B(tài)ARDl和BARDl同工型表達(dá)。RT-PCR顯示所有形式的BARDl都被miR-203輕微抑制。蛋白質(zhì)印跡顯示miR-203過表達(dá)對(duì)FL、β和π的強(qiáng)烈抑制。
具體實(shí)施例方式雖然可將與本文所述類似或等效的方法和材料用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，但合適的方法和材料描述如下。通過參考并入本文提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容。提供本文所述的出版物和申請(qǐng)僅僅是為了公開在本申請(qǐng)的提交日之前的內(nèi)容。此處決不能解釋為承認(rèn)由于之前的發(fā)明導(dǎo)致本發(fā)明沒有資格早于此類出版物。此外，材料、方法和實(shí)例僅是說明性的，不是意圖進(jìn)行限制。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。除非另外定義，本文所用所有科技術(shù)語具有與本文主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。如本文所用，為了便于理解本發(fā)明提供以下定義。術(shù)語“包含”通常以包括的意思使用，也就是說允許存在一種或多種特征或成分。如說明書和權(quán)利要求所用，單數(shù)形式的"a"、" an"和"the"包括多個(gè)指代對(duì)象，除非上下文明確做出了不同規(guī)定。例如BARDl同工型是指至少一種BARDl同工型。如本文所用術(shù)語“同工型”是同一蛋白的數(shù)種不同形式中的一種，如本發(fā)明的BARDl蛋白。諸如BARDl等蛋白的不同形式，可以從相關(guān)基因生產(chǎn)，或可以由同一基因通過選擇性剪接而產(chǎn)生。大量同工型可由單核苷酸多態(tài)性或SNP(同一基因的等位基因之間的較小遺傳學(xué)差異)引起。這些出現(xiàn)在基因的特定的個(gè)別核苷酸位置。如本文所用術(shù)語“受試對(duì)象”或“患者”是本領(lǐng)域公知的，并且在本文中用于指哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在某些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象是需要治療的受試對(duì)`象或患有肺癌和/或結(jié)直腸癌的受試對(duì)象。但是，在其它實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象可以是尚未發(fā)展出肺癌和/或結(jié)直腸癌癥狀的正常受試對(duì)象或已經(jīng)進(jìn)行針對(duì)肺癌和/或結(jié)直腸癌的治療的受試對(duì)象。該術(shù)語不指示特定的年齡或性別。因此，意圖覆蓋成年或幼年受試對(duì)象，無論男性還是女性。如本文所用，術(shù)語“肽”、“蛋白”、“多肽”和“肽的(p^tidic) ”可以相互替換地使用，來指通過相鄰殘基的α-氨基和羧基之間的肽鍵連接到其它氨基酸的一系列氨基酸殘基。與所預(yù)期的相反，申請(qǐng)人已經(jīng)令人驚奇地在來自100例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和165例結(jié)直腸癌的患者群組的每個(gè)樣品中鑒定出除已知的同工型α、β、η、Υ、ε
和Θ之外的兩個(gè)新的其它BARDl同工型。另一令人驚奇的特征是同工型α在來自100例NSCLC和165例結(jié)直腸癌的患者群組的每個(gè)樣品中都不存在。將這些新型同工型命名為κ和。實(shí)際上BARDl同工型在NSCLC和結(jié)直腸癌的腫瘤組織中表達(dá)相似的模式，它們都表達(dá)兩種新型的同工型κ和，同工型κ和Ji不同于在婦科癌癥中鑒定出的BARDl同工型(W02008/119802)。該發(fā)現(xiàn)表明BARDl的異常表達(dá)在女性激素依賴性腫瘤組織和非女性激素依賴性腫瘤組織中可能是不同的。新型同工型κ帶有外顯子3的缺失，從外顯子2翻譯到外顯子4中不是框內(nèi)的，但是翻譯可以在外顯子4內(nèi)開始。所得的蛋白產(chǎn)物的抗體反應(yīng)性與同工型β相似。新型同工型帶有在外顯子4內(nèi)的編碼第301 436位氨基酸的408bp的缺失。同工型π的翻譯會(huì)產(chǎn)生與抗體PVC和WFS反應(yīng)但卻缺少重要的NLS的蛋白(圖4C、E和圖6)。同工型π源自新的剪接機(jī)制，該剪接機(jī)制產(chǎn)生外顯子4的部分缺失，但保留外顯子1-3以及外顯子4的開始部分，因此保留BRCAl結(jié)合性RING指結(jié)構(gòu)域。同工型π保留外顯子1-3以及外顯子4的開始部分，因此保留了被PVC和WFS識(shí)別的表位，所述表位為未在任何其它同工型中發(fā)現(xiàn)的表位的組合。同工型η可以用抗體PVC和WFS檢測(cè)，這些抗體在小鼠晚期肺腫瘤中顯示出染色增加。因此，同工型η可以是NSCLC中腫瘤發(fā)展的致癌驅(qū)動(dòng)物。同工型η中外顯子4的部分缺失可能是重要的區(qū)域，因?yàn)槠渚哂袛?shù)種癌癥相關(guān)突變和NLS (圖4Ε)，這可能解釋PVC和WFS染色的細(xì)胞質(zhì)定位。異常的胞內(nèi)定位可能影響蛋白修飾，例如磷酸化和蛋白-蛋白相互作用。同工型π對(duì)于肺癌似乎特別重要，這是因?yàn)槠涫俏ㄒ坏脑谀[瘤組織中顯著上調(diào)和在腫瘤周圍組織中缺乏或僅弱表達(dá)的同工型，而所有其它BARDl同工型在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中都相似地表達(dá)(圖4Β ;圖7)。外顯子4的部分缺失引起B(yǎng)ARDl上重要的NLS的喪失，這可能解釋細(xì)胞質(zhì)定位。由外顯子2的缺失導(dǎo)致的另外的同工型π ’，在肺癌和結(jié)直腸癌中與同工型π共表達(dá)。申請(qǐng)人:證明，F(xiàn)LBARDI (全長(zhǎng)BARD1)和剪接同工型在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中表達(dá)，并且可能促成腫瘤發(fā)生和發(fā)展。但是，同工型η在腫瘤中特異性表達(dá)，可能參與致癌發(fā)展。FL BARDl在mRNA水平上表達(dá)，但不存在FL BARDl的蛋白翻譯。因此在蛋白水平上，BARDl同工型，而不是FL BARDl，在來自100個(gè)NSCLC和165個(gè)結(jié)直腸癌患者群組的每個(gè)樣品中表達(dá)。同工型表達(dá)和定位與BRCAl不相關(guān)，表明BRCA1-BARD1異二聚體的E3泛素連接酶功能在兩種類型的癌癥中受損。BRCAl蛋白的穩(wěn)定性和定位極大地依賴于BARDl。導(dǎo)致BRCA1-BARDI缺乏腫瘤抑制功能喪失的FL BARDl的缺失引起基因組不穩(wěn)定和對(duì)凋亡的抗性。除了 FL BARDl的喪失的這個(gè)效果之外，過表達(dá)的差異性剪接BARDl同工型可能是腫瘤形成的驅(qū)動(dòng)物。選擇性剪接是肺癌中經(jīng)常觀察到的現(xiàn)象，并且對(duì)于許多調(diào)控性蛋白都得到驗(yàn)證。剪接同工型能夠翻譯成具有拮抗功能的異常蛋白同工型。對(duì)于兩種BARDl剪接變體，BARDl β和BARDl δ，這已經(jīng)得到驗(yàn)證，BARDl β和BARDl δ分別通過穩(wěn)定Aurora B和作用在Era上對(duì)FL BARDl功能起拮抗作用。因此，NSCLC中的BARDl同工型表達(dá)可能不僅是旁觀者，還可能是腫瘤形成的驅(qū)動(dòng)者。實(shí)際上，分別被抗體PVC和WFS識(shí)別的定位到外顯子3和4的表位的表達(dá)在誘導(dǎo)了肺癌的小鼠模型的肺腫瘤的侵襲階段中增加。所有的腫瘤組織樣品和腫瘤周圍組織樣品還表達(dá)在婦科癌癥中發(fā)現(xiàn)的同工型；具體而言是同工型δ。BARDl同工型δ結(jié)合和穩(wěn)定ER a，與BRCA1-BARD1異二聚體的功能相反。由于ERa也在所有樣品中表達(dá)，BARDl同工型可能通過雌激素而得到上調(diào)并參與肺癌中的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)。因此，數(shù)種BARDl同工型似乎與癌形成相關(guān)。由于癌細(xì)胞需要BARDl或BARDl同工型以增殖，NSCLC和結(jié)直腸癌中的BARDl同工型表達(dá)不僅是旁觀者，還可能是腫瘤形成的驅(qū)動(dòng)者。特別是表達(dá)定位到外顯子3和4的表位的同工型，似乎與NSCLC和結(jié)直腸癌中的較短存活都相關(guān)。這些表位在小鼠肺癌模型的侵襲性腫瘤中上調(diào)。NSCLC和結(jié)直腸癌中表達(dá)的BARDl同工型源自選擇性剪接。例如，剪接同工型能夠翻譯成具有拮抗功能的異常蛋白同工型。

所有的肺腫瘤樣品和腫瘤周圍組織樣品都表達(dá)ERa和同工型δ。但是，在系列結(jié)直腸癌病例中不存在ERa mRNA表達(dá)，并且在BARDl同工型表達(dá)和性別之間未發(fā)現(xiàn)差異。但是，令人感興趣的是，高頻率的N19陽性染色與結(jié)直腸癌的女性性別顯著相關(guān)(P=0.014)，并且該發(fā)現(xiàn)和NSCLC中與女性性別相關(guān)的BARDlN端表位的表達(dá)一致(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性是臨界的，P=0.051)。NSCLC中，在女性中觀察到BARDl同工型γ、ε和η的高mRNA水平的表達(dá)，而在男性中同工型β和κ過表達(dá)。同工型Y和ε表達(dá)能夠通過BARDl Ν19檢測(cè)，而同工型β、κ和η不能。因此，BARDl同工型表達(dá)的蛋白水平和mRNA水平是一致的，表明性別特異性BARDl同工型在這些癌癥中表達(dá)。BARDl同工型在NSCLC和結(jié)直腸癌的腫瘤組織與腫瘤周圍組織中顯示了不同的表達(dá)模式。NSCLC中，除了同工型π之外的所有同工型在腫瘤周圍組織中表達(dá)并在腫瘤組織中僅輕微增加，但在獲自良性肺疾病的對(duì)照組織中觀察到任何形式的BARDl表達(dá)較少或不表達(dá)。相反，在結(jié)直腸癌中，BARDl同工型在腫瘤組織中表達(dá)的頻率較高，但在腫瘤周圍組織中不表達(dá)或表達(dá)較少。該結(jié)果可以通過根據(jù)不同細(xì)胞類型對(duì)外部刺激或某些病理學(xué)狀況和/或在肺組織和結(jié)直腸組織之間ERa表達(dá)的差異的應(yīng)答而多樣性調(diào)節(jié)選擇性剪接來解釋。用PVC抗體或WFS抗體或二者獲得的陽性染色與NSCLC患者的存活減少相關(guān)。但是，四種抗體的陽性染色模式與結(jié)直腸癌中的存活較長(zhǎng)顯著相關(guān)，對(duì)于Ν19陽性染色情況也是如此；而PVC和WFS陽性染色模式 ，而不是它們各自的陽性染色，與存活較短強(qiáng)相關(guān)。事實(shí)上，不同的表達(dá)模式不僅反映了不同BARDl同工型的表達(dá)，還反映了同工型的組合的表達(dá)。根據(jù)BARDl表達(dá)的不同表位的相關(guān)性，似乎觀察到數(shù)種BARDl同工型:NSCLC和結(jié)直腸癌中的N端和C端截短形式以及內(nèi)部缺失形式，以及結(jié)直腸癌中N端喪失的其它形式。四種抗體陽性染色的表達(dá)模式未表明同工型η的表達(dá)，但可能反映了 BARDl的不同同工型的同時(shí)表達(dá)。事實(shí)上，BARDl同工型π的表達(dá)與被PVC和WFS識(shí)別的表位一致，所述表位為未在任何其它同工型中發(fā)現(xiàn)的表位的組合。實(shí)際上，PVC和WFS染色是細(xì)胞質(zhì)的染色。PVC和WFS的表達(dá)與NSCLC和結(jié)直腸癌的不良預(yù)后明顯相關(guān)，PVC和WFS染色還與小鼠肺癌模型中的癌癥發(fā)展相關(guān)。PVC和WFS反應(yīng)性表位的強(qiáng)表達(dá)，加上N端和C端表位的弱表達(dá)可能表明這些表位被空間構(gòu)型和/或蛋白-蛋白相互作用封閉。FL BARDl與BARDl同工型的翻譯后調(diào)節(jié)或差異性蛋白穩(wěn)定性可能還解釋說明了在蛋白水平上FL BARDl的不存在，而其在mRNA水平上存在。申請(qǐng)人:證明BARDl同工型的表達(dá)在NSCLC和結(jié)直腸癌中是常見的。這些同工型的表達(dá)與NSCLC和結(jié)直腸癌的預(yù)后(不良預(yù)后或良好預(yù)后)顯著相關(guān)，強(qiáng)烈地表明BARDl同工型參與了腫瘤形成、發(fā)展和致死性。因此，BARDl及其同工型可以是有前景的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，不僅用于鑒定對(duì)更具侵襲性的治療具有不良預(yù)后可能的個(gè)體，還為搜尋有效的分子靶向治療指明了新方向。例如，諸如κ和等BARDl同工型可以是肺癌和結(jié)直腸癌治療新策略的靶標(biāo)。檢測(cè)特異性同工型K和π有助于在潛在的治愈性外科手術(shù)治療之前和/或之后鑒定有死于NSCLC和結(jié)直腸癌的最高風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象，這是因?yàn)槠涫沁x擇用輔助性化療進(jìn)行隨后治療的受試對(duì)象的關(guān)鍵步驟。
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)獲自受試對(duì)象的生物樣品中對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括檢測(cè)所述樣品中對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的至少一種BARDl同工型的步驟，所述至少一種BARDl同工型選自包含以下同工型的組:同工型Ji，其包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和同工型κ，其包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中，在獲自所述受試對(duì)象的樣品中所述對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的所述BARDl同工型的存在是所述受試對(duì)象罹患肺癌和/或結(jié)直腸癌、具有升高的患肺癌和/或結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)、以及/或者治療肺癌和/或結(jié)直腸癌后具有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志。優(yōu)選的是，所述檢測(cè)步驟包括檢測(cè)BARDl同工型π和BARDl同工型κ，BARDl同工型π包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，BARDl同工型κ包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列。還優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)所述生物樣品中由SEQ ID NO:1組成的BARDl同工型和由SEQ ID NO:2組成的BARDl同工型κ的步驟。本發(fā)明的方法還包括檢測(cè)所述生物樣品中選自包含以下同工型的組中的至少一種BARDl同工型:同工型JI ’，同工型’包含SEQ ID NO: 105、其生物活性片段或與SEQ ID NO:105具有至少95%同源性的序列，同工型β，同工型β包含SEQ ID NO:5、其生物活性片段或與SEQ ID NO:5具有至少95%同源性的序列，同工型δ，同工型δ包含SEQ ID NO:6、其生物活性片段或與SEQ ID NO:6具有至少95%同源性的序列，和同工型Y，同工型Y包含SEQ ID NO:7、其生物活性片段或與SEQ ID NO:7具有至少95%同源性的序列，同工型β ’，同工型β ’包含SEQ ID NO: 106、其生物活性片段或與SEQ ID NO:106具有至少95%同源性的序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法還包括檢測(cè)所述生物樣品中選自包含以下同工型的組中的至少一種BARDl同工型:同工型Ji ’，同工型JI ’包含SEQ ID NO: 105、其生物活性片段或與SEQ ID NO:105具有至少95%同源性的序列，同工型β，同工型β包含SEQ ID NO:5、其生物活性片段或與SEQ ID NO:5具有至少95%同源性的序列，同工型β ’，同工型β ’包含SEQ ID NO: 106、其生物活性片段或與SEQ ID NO:106具有至少95%同源性的序列。還優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)所述生物樣品中由SEQ ID NO:1組成的BARDl同工型、由S EQ ID NO:2組成的BARDl同工型κ和由SEQ ID NO:5組成的BARDl同工型β的步驟。在本發(fā)明的上下文中，“生物活性片段”是指本發(fā)明的BARDl同工型的區(qū)域，其對(duì)于BARDl同工型的正常功能，例如拮抗功能而言是必須的。生物活性片段包括包含與SEQID NO:1 7、105 106的氨基酸序列具有足夠同源性或源自SEQ ID Ν0:1 7、105 106的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含的氨基酸比全長(zhǎng)BARDl同工型少，并且展示至少一種拮抗活性。通常，生物活性片段包含具有至少一種拮抗活性的結(jié)構(gòu)域或基序。本發(fā)明的BARDl同工型的生物活性片段可以是長(zhǎng)度為例如10個(gè)、25個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的多肽。此外，其中缺失其它區(qū)域的其它生物活性片段可以通過重組技術(shù)制備，并對(duì)其就本發(fā)明的天然BARDl同工型的一種或多種功能活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，同工型π的一種生物活性片段可以由SEQ ID NO:3組成，同工型κ的一種生物活性片段可以由SEQ ID Ν0:4組成，同工型β的一種生物活性片段可以由SEQ ID NO:4組成。

在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明的BARDl同工型是以下多肽，所述多肽包含與包含SEQ ID NO:1 7、105 106的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%，優(yōu)選為95%同源性的氨基酸序列，并且保持包含SEQ ID NO:1 7、105 106的BARDl同工型的活性。為了確定兩個(gè)氨基酸序列的同源性百分比，為了最佳比較目的將序列進(jìn)行比對(duì)(例如，為了與第二氨基酸序列進(jìn)行最佳比對(duì)，可以在第一氨基酸序列中引入空位)。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置處的氨基酸殘基。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c在第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是同源的。比對(duì)和百分比同源性可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的軟件，例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等(eds) 1987, Supplement30,第7.7.18小節(jié))中描述的軟件確定。優(yōu)選的程序包括 GCG Pileup 程序、FASTA(Pearson 等(1988)Proc.Natl, Acad.Sci USA 85:2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual, Altschul 等,Natl.Cent.Biotechnol.1nf., NatlLib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda, Md.，和 Altschul 等，(1997) NAR25:3389-3402)。另一優(yōu)選的比對(duì)程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA),優(yōu)選使用默認(rèn)參數(shù)。發(fā)現(xiàn)有用的另一序列軟件程序是Sequence Software Package Version6.0中可獲得的 TFASTA Data Searching Program (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, ffis.)。片段是與本發(fā)明的BARDl同工型的各序列在長(zhǎng)度上共有至少40%的氨基酸的序列?？梢允褂眠@些序列，只要它們展現(xiàn)與它們所源自的天然序列相同的生物學(xué)性質(zhì)，例如拮抗活性。優(yōu)選的是，這些序列與其所源自的各序列在長(zhǎng)度上共有超過70%、優(yōu)選超過80%特別是超過90%且最優(yōu)選95%的氨基酸。這些片段可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法和技術(shù)(例如化學(xué)合成)來制備。本發(fā)明還包括BARDl同工型的變體。變體是這樣的肽或多肽，它們具有的氨基酸序列在一定程度上不同于天然序列的肽或多肽，它們是通過保守性氨基酸取代而不同于天然序列的氨基酸序列，由此一個(gè)或多個(gè)氨基酸被具有相同特征和構(gòu)象作用的另外的氨基酸取代。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內(nèi)的某些位置處擁有取代、缺失、側(cè)鏈修飾和/或插入。此處將保守性氨基酸取代定義為在以下五組中的一組內(nèi)的交換:1.小的脂肪族的非極性或輕微極性的殘基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
I1.極性的帶正電的殘基:His、Arg、LysII1.極性的帶負(fù)電的殘基及其酰胺:Asp、Asn、Glu、GlnIV.大的芳香族殘基:Phe、Tyr、TrpV.大的脂肪族的非極性殘基:Met、Leu、lie、Val、Cys。應(yīng)該理解，一些非常規(guī)氨基酸也可以是天然存在的氨基酸的合適的取代物。例如，Lys殘基可以被鳥氨酸、高精氨酸、nor-Lys、N-甲基-Lys、N, N- 二甲基-Lys和N, N, N-三甲基-Lys取代。Lys殘基還可以被合成的堿性氨基酸取代，所述堿性氨基酸包括，但不限于，N-1-(2-吡唑啉基)-Arg、2-(4-哌啶基)-Gly、2-(4-哌啶基)_Ala、2_[3_(2S)吡咯啉基]-Gly和2-[3-(2S)吡咯啉基]-Ala。Tyr殘基可以被4-甲氧基酪氨酸(MeY)、間-Tyr、鄰-Tyr、nor-Ty;r、1251_Tyr、單齒素-Tyr、二齒素-Tyr、0_ 橫-Tyr、0_ 憐-Tyr 和硝基-Tyr取代。Tyr殘基還可以被3_羥基或2_羥基異構(gòu)體(分別為間-Tyr或鄰-Tyr)和相應(yīng)的O-磺-和O-磷衍生物取代。Tyr殘基還可以被合成的含有羥基的氨基酸取代，合成的含有羥基的氨基酸包括但不限于4-羥基甲基-Phe、4-羥基苯基-Gly、2，6- 二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr。脂肪族氨基酸可以被帶有非天然脂肪族支鏈或直鏈側(cè)鏈CnH2n+2的合成衍生物取代，CnH2n+2 中η是從I至最多8且包括8的數(shù)值。合適的被非常規(guī)氨基酸保守性取代的實(shí)例在W002/064740中給出。插入包括加入一個(gè)或多個(gè)天然存在的或非常規(guī)的氨基酸殘基。缺失包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失。此外，由于天然肽(為L(zhǎng)型)的固有問題是被天然酶降解，可以將本發(fā)明的生理活性蛋白制備為包括所述肽的D型和/或“逆反異構(gòu)體(retro-1nverso isomers) ”。優(yōu)選的是，制備本發(fā)明生理活性蛋白的較短部分的逆反異構(gòu)體、變體或組合。例如如Sela和Zisman在出版于FASEB J.1997 May; 11 (6):449-56的綜述中所述，為已知序列的肽制備逆反肽?！澳娣串悩?gòu)體”是指直鏈肽的異構(gòu)體，其中序列的方向相反并且各氨基酸殘基的手性反轉(zhuǎn)，因此可以不存在端基互補(bǔ)。本發(fā)明還包括其中一個(gè)或多個(gè)肽鍵已經(jīng)被備選類型的不容易受肽酶切割影響的共價(jià)鍵代替的類似物(“肽模擬物”)。在注入受試對(duì)象之后肽的蛋白水解降解成為問題的情況下，將特別敏感的肽鍵替換為不可切割的肽模擬物會(huì)使所得的肽更穩(wěn)定，因此作為活性物質(zhì)更有用。此類模擬物以及將它們弓I入肽的方法是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選的是，所述生物樣品選自包含以下樣品的組:活組織檢查樣品、組織學(xué)樣品、肺液、冷凍組織樣品、腫瘤組織樣品、糞便樣品、腦脊髓液(CSF)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)和血液樣品，更優(yōu)選的是受試對(duì)象是人類。最優(yōu)選的是生物樣品是源自獲自受試對(duì)象的血液樣品的血清。檢測(cè)本發(fā)明的BARDl同工型的存在可以通過常規(guī)方法進(jìn)行，例如蛋白免疫染色、蛋白免疫沉淀、免疫電泳、免疫印跡、BCA蛋白檢驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡、分光光度法。BARDl同工型的存在還可以利用常規(guī)方法經(jīng)由其相應(yīng)的mRNA的存在來檢測(cè)，所述常規(guī)方法例如RNA印跡、核酸酶保護(hù)檢驗(yàn)(NPA)、原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。優(yōu)選的是，在循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)中檢測(cè)BARDl同工型特異性RNA的表達(dá)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，BARDl同工型的存在通過使用對(duì)本發(fā)明的BARDl同工型具有特異性的抗體來檢測(cè)。優(yōu)選的是，所述抗體是與至少一種BARDl同工型特異性結(jié)合的多克隆抗體或單克隆抗體或它們的片段，所述BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO:1_7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO:1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列。還優(yōu)選的是，所述抗體是與至少一種BARDl同工型的不同表位特異性結(jié)合的抗體或其片段的組合，所述BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO: 1_7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO: 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列。優(yōu)選的是，所述表位是外顯子3和4。優(yōu)選的是，所述多克隆抗體或單克隆抗體或抗體的所述組合與至少一種BARDl同工型特異性結(jié)合，所述BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO:1和2、其生物活性片段或與SEQ ID NO:1-2具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列。例如，允許檢測(cè)本發(fā)明的BARDl同工型的抗體為以下抗體:- N19、C20 和 H300(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),-生成PVC和WSF(外顯子4的開始部分)并如之前所述應(yīng)用(Irminger-Finger
I等，Mol Cell 8:1255-66, 2001 ;Feki A 等，Oncogene 24:3726-36, 2005 ；Hayami R等，Cancer Res 65:6-10, 2005 ；Li L 等，Int J Biochem Cell Biol 39:1659-72, 2007 ；Redente EF 等，Anti cancer Res 29:5095-101, 2009 ；Fabbro M等，J Biol Chem 277:21315-24，2002)，- BL(Bethy Laboratories),- JH2 和 JH3 (Gautier 等 Cancer Rsearch, 2000),- PGP(Ryser 等 ，Cancer Research, 2000),- ELS 和 KPD,由 Applicants 生產(chǎn)- MIQ(Irminger-Finger 等，JCB1998)所述檢測(cè)可以通過免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行，并總結(jié)于表I中:- BARDl同工型π應(yīng)該對(duì)Ν19 (或PVC或MIQ)加上或者BL(或WFS)為陽性，并且對(duì)JH2為陰性。為了區(qū)分同工型π和η ’ U-d-2)，可以通過蛋白質(zhì)印跡中的尺寸(size)來完成。- BARDl同工型κ應(yīng)該對(duì)BL(或WFS)為陽性，并且對(duì)Ν19 (或PVC或MIQ)為陰性。- BARDl同工型β應(yīng)該對(duì)PGP，以及或者WFS或BL為陽性。為了區(qū)分同工型β和β’(β-(1-5)，同工型β對(duì)ELS為陽性。- BARDl同工型δ應(yīng)該對(duì)Ν19為陽性，對(duì)PVC (或MIQ)為陰性并且對(duì)BL (或WFS)為陰性。- BARDl同工型Y應(yīng)該對(duì)Ν19以及任一 PVC(或MIQ)為陽性，但對(duì)C20 (或KPD)為陰性。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)獲自受試對(duì)象的生物樣品中對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括在所述樣品中檢測(cè)對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的至少一種BARDl同工型的步驟，所述至少一種BARDl同工型選自包含以下同工型的組 同工型Ji，同工型Ji包含SEQ ID NO :I、其生物活性片段或與SEQ ID NO :I具有至少95%同源性的序列，和 同工型K，同工型K包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或與SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列， 其中，在獲自所述受試對(duì)象的樣品中所述對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在是所述受試對(duì)象罹患肺癌和/或結(jié)直腸癌、患肺癌和/或結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加、以及/或者治療肺癌和/或結(jié)直腸癌后具有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述方法包括在所述生物樣品中檢測(cè)由SEQIDNO 1組成的BARDl同工型和由SEQ ID NO 2組成的BARDl同工型κ的步驟。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述方法還包括在所述樣品中檢測(cè)選自包含以下同工型的組中的至少一種BARDl同工型 同工型Ji ’，同工型Ji ’包含SEQ ID NO : 105、其生物活性片段或與SEQ ID NO :105具有至少95%同源性的序列， 同工型β，同工型β包含SEQ ID NO :5、其生物活性片段或與SEQ ID NO :5具有至少95%同源性的序列， 同工型δ，同工型δ包含SEQ ID NO :6、其生物活性片段或與SEQ ID NO 6具有至少95%同源性的序列，和 同工型Y，同工型Y包含SEQ ID NO :7、其生物活性片段或與SEQ ID NO :7具有至少95%同源性的序列， 同工型β'，同工型β'包含SEQ ID NO : 106、其生物活性片段或與SEQ ID NO :106具有至少95%同源性的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述方法包括在所述生物樣品中檢測(cè)由SEQIDNO 1組成的BARDl同工型、由SEQ ID NO 2組成的BARDl同工型κ和由SEQ ID NO 5組成的BARDl同工型β。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述生物樣品選自包含以下樣品的組活組織檢查樣品、組織學(xué)樣品、肺液、冷凍組織樣品、腫瘤組織樣品、糞便樣品、腦脊髓液(CSF)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)和血液樣品。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試對(duì)象是人類。
7.如權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通過使用對(duì)所述BARDl同工型具有特異性的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述抗體是與至少一種BARDl同工型的不同表位特異性結(jié)合的抗體或其片段的組合，所述至少一種BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO : 1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通過檢測(cè)編碼至少一種BARDl同工型的mRNA的水平來檢測(cè)，所述至少一種BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO : 1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通過檢測(cè)獲自所述受試對(duì)象的血液樣品中對(duì)所述BARDl同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在來檢測(cè)，并且其中使用選自包含SEQ ID NO :13-80的組中的至少四種抗原以檢測(cè)對(duì)所述BARDl同工型具有特異性的所述自身免疫抗體。
11.如權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通過以下方式來檢測(cè) 檢測(cè)編碼至少一種BARDl同工型的mRNA的水平，所述至少一種BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO :1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列，和 檢測(cè)獲自所述受試對(duì)象的血液樣品中對(duì)所述BARDl同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在，并且其中使用選自包含SEQ ID NO :13-80的組中的至少四種抗原以檢測(cè)對(duì)所述BARDl同工型具有特異性的所述自身免疫抗體。
12.—種在權(quán)利要求I 6所述的方法中用作生物標(biāo)志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO: I、其生物活性片段或與SEQ ID NO : I具有至少95%同源性的序列。
13.—種在權(quán)利要求I 6所述的方法中用作生物標(biāo)志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或與SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列。
14.選自包含SEQID NO : 13 80的組中的肽，所述肽在權(quán)利要求I 6所述的用于檢測(cè)BARDl同工型的存在的方法中使用。
15.一種用于檢測(cè)獲自受試對(duì)象的樣品中對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在的試劑盒，所述試劑盒包含 至少一種多核苷酸引物或探針，其中所述多核苷酸引物或探針對(duì)編碼至少一種所述BARDl同工型的多核苷酸具有特異性，所述至少一種BARDl同工型包含選自包含SEQ IDNO : 1-7、105-106、其生物活性片段和/或與SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列，和/或 與至少一種所述BARDl同工型的不同表位特異性結(jié)合的抗體或其片段的組合，所述至少一種BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO : 1_7、105-106、其生物活性片段或與SEQ IDNO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列，和/或 至少一種選自包含SEQ ID NO : 13 80的組中的肽。
16.一種將肺癌和結(jié)直腸癌與婦科癌癥相區(qū)分的方法，所述方法包括在獲自受試對(duì)象的生物樣品中檢測(cè)至少一種對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的步驟，所述BARDl同工型選自包含以下同工型的組 同工型Ji，同工型Ji包含SEQ ID NO :I、其生物活性片段或與SEQ ID NO :I具有至少95%同源性的序列，和 同工型κ，同工型κ包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或與SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列，其中，所述對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的BARDl同工型的存在是肺癌和/或結(jié)直腸癌的標(biāo)志。
17.選自包含SEQID NO : 13 80的組中的肽，所述肽在檢測(cè)獲自受試對(duì)象的生物樣品中BARDl同工型的存在的方法中用作抗原，其中所述BARDl同工型的存在通過檢測(cè)對(duì)所述BARDl同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在來檢測(cè)，并且其中所述BARDl同工型在所述樣品中的存在是所述患者罹患癌癥的標(biāo)志。
18.一種抗體或其片段，所述抗體或其片段與SEQ ID NO :144所示的表位結(jié)合。
19.一種在治療和/或預(yù)防肺癌和結(jié)直腸癌的方法中使用的抗體或其片段，所述抗體或其片段與SEQ ID NO :144所示的表位結(jié)合。
20.一種在治療和/或預(yù)防肺癌和結(jié)直腸癌的方法中使用的重組SiRNA分子，所述重組siRNA分子與單鏈或雙鏈RNA分子結(jié)合，其中所述單鏈或雙鏈RNA分子包含編碼至少一種BARDl同工型的mRNA Jy^iSBARDl同工型包含選自包含SEQ IDNO : 1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列，由此所述BARDl同工型的表達(dá)受到抑制。
21.一種在治療和/或預(yù)防肺癌和結(jié)直腸癌的方法中使用的BARDl同工型的生物活性的調(diào)節(jié)劑，所述BARDl同工型包含選自包含SEQ ID NO : 1_7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID N0:l-7、105-106具有至少95%同源性的序列的組中的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求20所述的BARDl同工型的生物活性的調(diào)節(jié)劑，其中，所述調(diào)節(jié)劑是選自包含SEQ ID NO. 111 140的組中的微RNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)肺癌和結(jié)直腸癌具有特異性的新型BARD1同工型、其檢測(cè)方法以及用于治療和/或預(yù)防肺癌和結(jié)直腸癌的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103238069SQ201180044183
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者I·艾爾明格-菲格爾, 張永強(qiáng) 申請(qǐng)人:日內(nèi)瓦大學(xué), 日內(nèi)瓦大學(xué)醫(yī)院