專利名稱：冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種黑斑病菌的檢測裝置，屬于植物病原菌的檢測領(lǐng)域，特別是適用于冬棗黑斑病菌的田間預(yù)防及貯藏前冬棗黑斑病菌快速檢測的冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
冬棗黑斑病是一種真菌病害，在各冬棗產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，而且有加重的趨勢。冬棗黑斑病在坐果前主要侵染葉片，以后從幼果開始就危害果實。感病果實病斑呈黑褐色，圓形，外圍有不同顏色的暈圈或無果實皮層或部分果肉稍有凹陷或腐爛，造成產(chǎn)量、品質(zhì)下降，不能貯存，嚴(yán)重影響果實的商品性，給棗農(nóng)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。該病病原菌為互隔交鏈孢霉(Alternaria alternate (Fr. )Keissler)，病原菌以菌絲在率樹牙鱗和皮痕內(nèi)越冬，可通過傷口和自然孔口侵入，25°C下潛育期7天左右，7月下旬、8月上旬為發(fā)病盛期，病害的發(fā)生與氣候、樹齡、棗園種植結(jié)構(gòu)、昆蟲危害等因子密切相關(guān)。目前，國內(nèi)對冬棗黑斑病菌檢測主要有分離培養(yǎng)檢測和癥狀觀測檢測，這些檢測具有檢測時間長、靈敏度低的缺點，同時還要求檢測人員具有豐富的實踐經(jīng)驗。而發(fā)病初期，由于病原菌少、病害癥狀不明顯，更使得以上檢測的靈敏度和檢出率受到限制，發(fā)展一種基因水平檢測、靈敏度高、快速、操作簡便的方法，是冬棗黑斑病菌檢測急需解決的問題。目前，分子檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物病原菌的檢測，由于真菌核糖體基因ITS序列在真菌種間的高度變異和種內(nèi)的穩(wěn)定性，為真菌的分子檢測提供了理想的靶序列。近年來，利用PCR擴(kuò)增病原菌核糖體ITS基因區(qū)段進(jìn)行病原菌鑒定、檢測及病害診斷的技術(shù)得到了很大的發(fā)展。PCR技術(shù)在植物病原檢測上的應(yīng)用較傳統(tǒng)檢測方法具有明顯的優(yōu)勢，該方法快速、靈敏，能做到種級水平的特異鑒定。所述的套嵌式PCR方法檢測，是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對PCR引物擴(kuò)增完整的片段，第一對與普通PCR相似，第二對結(jié)合在第一對PCR產(chǎn)物內(nèi)部，其優(yōu)點在于，一是由于第二對引物可以第一對引物擴(kuò)增產(chǎn)物和病原菌DNA為模板，增加擴(kuò)增效率，提高檢測的靈敏度，二是如果第一對引物擴(kuò)增生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低，提高檢測的準(zhǔn)確性。通過檢索，目前尚未見PCR技術(shù)在冬棗病原檢測上應(yīng)用的報導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的在于提供一種不僅利用PCR技術(shù)檢測冬棗病原菌，以提高靈敏度、縮短檢測周期，而且能使器皿有次序排列、防止易損壞、便于攜帶、使用方便的冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式PCR試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采取的技術(shù)方案是該冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式 PCR試劑盒，包括盛有反應(yīng)液的試管和嵌入試管的襯板，在襯板上設(shè)有成行、成列排列的嵌入孔，其特征在于所述襯板擔(dān)置在盒體的子口沿上，盒體的后口沿通過折頁軸連接上盒蓋，在盒蓋設(shè)有蓋鎖；在襯板上設(shè)有的成行、成列排列的嵌入孔內(nèi)按規(guī)定的編號分別插入盛有PCR緩沖液的試管、盛有dNTPs液的試管、盛有Taq DAN聚合酶的試管、盛有含有對套嵌式混合引物的試管、盛有含有冬棗黑斑病菌DNA陽性對照液的試管、盛有雙蒸水的試管。所述的盛有含有對套嵌式混合引物的試管內(nèi)的混合引物，為用于檢測冬棗黑斑病菌的特異性引物，為SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2以及SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4兩對套嵌式引物。所述的SEQ ID No. I為5’ -aaatatgaaggcgggctgg-3’，為第一對引物其上游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 2為5’ -gagagtgcgacttgtgctg-3’，為第一對引物其下游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 3 為 5’-tggaacctctcggggttaca_3’，為第二對引物其上游引物 核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 4 為 5’-ctgcgctccgaaaccagtag-3’，為第二對引物其下游引物核苷酸序列。在襯板的一側(cè)還設(shè)有備用試管的插入孔；所述的盒蓋內(nèi)設(shè)有膠墊層；在襯板的邊 沿處設(shè)有試管編號標(biāo)記。本實用新型的有益效果是不僅利用了 PCR技術(shù)檢測冬棗病原菌，提高了靈敏度、縮短了檢測周期，而且能使器皿有次序排列、防止易損壞、便于攜帶、使用方便?？蓮V泛用于冬棗黑斑病菌的快速檢測。
圖I為本實用新型的結(jié)構(gòu)主視示意圖。圖2為本實用新型的襯板俯視示意圖。圖中1、盒體；2、襯板；3、嵌入孔；4、折頁軸；5、盒蓋；6、蓋鎖；7、盛有PCR緩沖液的試管；8、盛有dNTPs液的試管；9、盛有Taq DAN聚合酶的試管；10、盛有含有對套嵌式混合引物的試管；11、盛有含有冬棗黑斑病菌DNA陽性對照液的試管；12、盛有雙蒸水的試管；13、備用試管；14、膠墊層。
具體實施方式
參照圖I、圖2制作本實用新型。該冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式PCR試劑盒，包括盛有反應(yīng)液的試管和嵌入試管的襯板2，在襯板2上設(shè)有成行、成列排列的嵌入孔3，其特征在于所述襯板2擔(dān)置在盒體I的子口沿上，盒體I的后口沿通過折頁軸4連接上盒蓋5，在盒蓋5設(shè)有蓋鎖6 ;在襯板2上設(shè)有的成行、成列排列的嵌入孔3內(nèi)按規(guī)定的編號分別插入盛有PCR緩沖液的試管7、盛有dNTPs液的試管8、盛有Taq DAN聚合酶的試管9、盛有含有對套嵌式混合引物的試管10、盛有含有冬棗黑斑病菌DNA陽性對照液的試管11、盛有雙蒸水的試管12。這樣，將配置的所有反應(yīng)液和對照液置于一個盒內(nèi)，可便于攜帶，使用方便。使用本實用新型時，對冬棗葉片、果實等進(jìn)行簡單快速的處理，以獲得的DNA為PCR擴(kuò)增模板，用兩對嵌套式引物對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，可在10小時內(nèi)完成整個PCR檢測，不但極大地提高了檢測靈敏度，而且縮短了檢測時間，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，是一種行之有效的植物病原菌分子生物學(xué)檢測方法。[0018]所述的盛有含有對套嵌式混合引物的試管10內(nèi)的混合引物，為用于檢測冬棗黑斑病菌的特異性引物，為SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2以及SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4兩對套嵌式引物。所述的SEQ ID No. I為5’ -aaatatgaaggcgggctgg-3’，為第一對引物其上游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 2為5’ -gagagtgcgacttgtgctg-3’，為第一對引物其下游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 3 為 5’-tggaacctctcggggttaca_3’，為第二對引物其上游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 4 為 5’-ctgcgctccgaaaccagtag_3’，為第二對引物其下游引物核苷酸序列。 在襯板2的一側(cè)還設(shè)有備用試管13的插入孔；所述的盒蓋5內(nèi)設(shè)有膠墊層14 ;在襯板2的邊沿處設(shè)有試管編號標(biāo)記。其檢測過程是提取待測樣品DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，PCR擴(kuò)增程序為95°C變性5分鐘，95°C變性I分鐘；60°C退火30秒；72°C延伸I分鐘；35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物取擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓按長度5V/cm電泳30至40分鐘，之后在紫外光下檢測，如果出現(xiàn)分子量約為400bp的DNA條帶，則為陽性對照或待測樣品中含有冬棗黑斑病菌。
權(quán)利要求1.冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式PCR試劑盒，包括盛有反應(yīng)液的試管和嵌入試管的襯板(2)，在襯板(2)上設(shè)有成行、成列排列的嵌入孔(3)，其特征在于所述襯板(2)擔(dān)置在盒體⑴的子口沿上，盒體⑴的后口沿通過折頁軸⑷連接上盒蓋(5)，在盒蓋(5)設(shè)有蓋鎖(6);在襯板(2)上設(shè)有的成行、成列排列的嵌入孔(3)內(nèi)按規(guī)定的編號分別插入盛有PCR緩沖液的試管(7)、盛有dNTPs液的試管(8)、盛有Taq DAN聚合酶的試管(9)、盛有含有對套嵌式混合引物的試管(10)、盛有含有冬棗黑斑病菌DNA陽性對照液的試管(11)、盛有雙蒸水的試管(12)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式PCR試劑盒，其特征在于在襯板(2)的一側(cè)還設(shè)有備用試管(13)的插入孔；所述的盒蓋(5)內(nèi)設(shè)有膠墊層(14)。
專利摘要本實用新型公開了一種冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式PCR試劑盒，包括盛有反應(yīng)液的試管和嵌入試管的襯板，其特征在于所述襯板擔(dān)置在盒體的子口沿上，盒體的后口沿通過折頁軸連接上盒蓋；在襯板上設(shè)有的成行、成列排列的嵌入孔內(nèi)按規(guī)定的編號分別插入盛有PCR緩沖液的試管、盛有dNTPs液的試管、盛有Taq DAN聚合酶的試管、盛有含有對套嵌式混合引物的試管、盛有含有冬棗黑斑病菌DNA陽性對照液的試管、盛有雙蒸水的試管。該冬棗黑斑病菌的便攜套嵌式PCR試劑盒，不僅利用了PCR技術(shù)檢測冬棗病原菌，提高了靈敏度、縮短了檢測周期，而且能使器皿有次序排列、防止易損壞、便于攜帶、使用方便。
文檔編號C12Q1/68GK202415571SQ20112052289
公開日2012年9月5日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者于明禮, 張柱岐, 李明 申請人:濱州職業(yè)學(xué)院