專利名稱：人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞的二甲基亞礬誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞的二甲基亞礬誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的損傷與再生一直是困擾人類健康的難題，也是科學(xué)家們致力于研究的焦點(diǎn)。源于胚胎組織的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stern cells，NSC污)曾被認(rèn)為是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的希望，但它的利用因來源的缺乏和倫理道德的約束而受到明顯的限制。近年來通過對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能產(chǎn)生骨骼肌、 心肌、肝細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究，已說明這種橫向分化具有相當(dāng)?shù)钠毡樾裕簿褪钦f，“橫向分化”可以利用患者自身的健康組織干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為病損組織的功能細(xì)胞，從而達(dá)到治療各種組織壞損性疾病的目的。人臍血(human umbilieal cord blood, HUCB)是胎兒出生時(shí)臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，其主要包含造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其中間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞相似，具有較強(qiáng)的可塑性，能發(fā)育成多種不同的細(xì)胞。將臍血細(xì)胞通過鼠尾靜脈注射入腦損傷模型的大鼠體內(nèi)，于腦組織損傷部位可檢測(cè)到有臍血源性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞抗原的表達(dá)，且在功能上有明顯的恢復(fù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的方法擬通過體外條件下獲取臍血MSCs，探討其在體外培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增的最佳條件，并應(yīng)用二甲基亞礬誘導(dǎo)向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向分化，論證其可塑性，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)提供一種新的細(xì)胞來源。具體的，為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞的二甲基亞礬誘導(dǎo)方法包括如下步驟Si.臍血的收集和單個(gè)核細(xì)胞的分離無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶血40-60ml，肝素抗凝，濃度為20U/ml，所有樣本均于采集后12h內(nèi)分離。用Hank’ S平衡鹽溶液1 1稀釋、混勻，疊加于Fieoll-Hypaque上面，相對(duì)密度為1.0779/L，稀釋血與 Fieoll-Hypaque液的柱高比為2 1，以2000r/min離心20min，取界面層的單個(gè)核細(xì)胞，力口 Hank' S平衡鹽溶液離心、洗滌兩次，加入培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為IxlOfVml左右。S2.細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增培養(yǎng)基采用Mesencult 培養(yǎng)液，并調(diào)整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印，將細(xì)胞分裝于25T培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-7 后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3-5d半量換液一次。待細(xì)胞達(dá)到80% -90%融合時(shí)，用1 1的2. 5g/L胰蛋白酶和 0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。傳代培養(yǎng)過程中每3d半量換液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復(fù)上述操作，傳代培養(yǎng)記為幾代，其余類推。S3.定向誘導(dǎo)MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化取傳至第3代的MSCS按虹105/1密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片，用含有l(wèi)mmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20 % FCS)預(yù)誘導(dǎo)Mh，PBS洗滌3遍后，換成含10g/L的二甲基亞礬(DMSO)和 lOOmmol/L的丁化輕基苯甲醚(BHA)的無血清DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔30min在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。S4.免疫組織化學(xué)鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3 遍，加入過氧化物酶阻斷液以消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清工作液室溫下封閉20min， 去除血清后分別加入小鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)絲蛋白(NF)單抗工作液，置于濕盒中4°C下過夜，PBS洗滌3遍，分別滴加羊抗小鼠的Ig-FITC和TRITC的二抗工作液，37°C下孵育》i，PBS漂洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察。鏡下隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野 (X100)，計(jì)算NSE和NF-M陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。
通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞的二甲基亞礬誘導(dǎo)方法的步驟流程圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示的本發(fā)明的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞的二甲基亞礬誘導(dǎo)方法的步驟流程圖，所述實(shí)施例的方法具體步驟如下Si.臍血的收集和單個(gè)核細(xì)胞的分離無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶血40-60ml，肝素抗凝，濃度為20U/ml，所有樣本均于采集后12h內(nèi)分離。用Hank’ S平衡鹽溶液1 1稀釋、混勻，疊加于Fieoll-Hypaque上面，相對(duì)密度為1.0779/L，稀釋血與 Fieoll-Hypaque液的柱高比為2 1，以2000r/min離心20min，取界面層的單個(gè)核細(xì)胞，力口 Hank’ S平衡鹽溶液離心、洗滌兩次，加入培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為IxlOfVml左右。S2.細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增培養(yǎng)基采用Mesencult 培養(yǎng)液，并調(diào)整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印，將細(xì)胞分裝于25T培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-7 后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3-5d半量換液一次。待細(xì)胞達(dá)到80% -90%融合時(shí)，用1 1的2. 5g/L胰蛋白酶和 0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。傳代培養(yǎng)過程中每3d半量換液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復(fù)上述操作，傳代培養(yǎng)記為幾代，其余類推。S3.定向誘導(dǎo)MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化取傳至第3代的MSCS按虹105/1密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片，用含有l(wèi)mmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20 % FCS)預(yù)誘導(dǎo)Mh，PBS洗滌3遍后，換成含10g/L的二甲基亞礬(DMSO)和 lOOmmol/L的丁化輕基苯甲醚(BHA)的無血清DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔30min在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。
S4.免疫組織化學(xué)鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3 遍，加入過氧化物酶阻斷液以消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清工作液室溫下封閉20min， 去除血清后分別加入小鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)絲蛋白(NF)單抗工作液，置于濕盒中4°C下過夜，PBS洗滌3遍，分別滴加羊抗小鼠的Ig-FITC和TRITC的二抗工作液，37°C下孵育》i，PBS漂洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察。鏡下隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野 (X100)，計(jì)算NSE和NF-M陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1.臍血MSCs的純化、擴(kuò)增從臍血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)基 (MeseneultTM)中48_7池后開始有細(xì)胞貼壁，逐漸伸出突起，4_7d出現(xiàn)大量的貼壁細(xì)胞，很少有集落形成，以間充質(zhì)樣細(xì)胞為主，同時(shí)有大量的破骨樣細(xì)胞混雜。破骨樣細(xì)胞胞體較大，多個(gè)核，圓形，MSCs為成纖維樣的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，單個(gè)核，有較長(zhǎng)的突起，折光性強(qiáng)。隨著在條件培養(yǎng)基的環(huán)境下培養(yǎng)，1-2周后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80% -90%融合。傳代后，細(xì)胞擴(kuò)增明顯減慢，傳至P3代后，大部分細(xì)胞(包括破骨樣細(xì)胞)逐漸被去除，剩下形態(tài)為成纖維樣細(xì)胞和略寬大的扁平形細(xì)胞，即為臍血源性的MSCs，形態(tài)上類似于骨髓MSCs，將這些細(xì)胞再次傳代培養(yǎng)，1-2周左右可達(dá)到融合，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的傳代擴(kuò)增能力。2. MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察臍血源性MSCs在含件琉基乙醇的 DMEM (20% FCS)預(yù)誘導(dǎo)24h后，換成DMSO和BHA的無血清DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)24h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，胞質(zhì)逐漸回縮，呈典型的核周形態(tài)，有突起伸出，7-8h后，大多數(shù)細(xì)胞均轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃粕窠?jīng)元樣的形態(tài)，伸出較長(zhǎng)的突起，并可見一級(jí)和二級(jí)分支，類似樹突樣。3.免疫組化鑒定采用神經(jīng)元標(biāo)志物NSE和NF進(jìn)一步鑒定MSCs經(jīng)DMSO和BllA 誘導(dǎo)他后，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為NSE和NF熒光染色陽性，NSE用FITC標(biāo)記，NF用TRITC標(biāo)記。從雙極到多極細(xì)胞均有出現(xiàn)，對(duì)照組則無陽性標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)。隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)算結(jié)果顯示誘導(dǎo)后大多數(shù)細(xì)胞均轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞，NSE陽性細(xì)胞占67. 4%士 2. 6%,NF 陽性細(xì)胞為65. 8%土 2.3%。本發(fā)明的方法應(yīng)用含10g/L的二甲基亞礬和lOOmmol/L的丁化輕基苯甲醚的無血清DMEM誘導(dǎo)來源于人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化成神經(jīng)元細(xì)胞。無菌條件下收集正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶血，經(jīng)肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離臍血的單個(gè)核細(xì)胞，以偏酸性的Mesencul 作為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和純化，獲得貼壁細(xì)胞， 取擴(kuò)增第三代后的應(yīng)用二甲基亞礬誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化，免疫組化標(biāo)記顯示經(jīng)誘導(dǎo)后的MSCs表達(dá)神經(jīng)絲蛋白(NF)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。人臍血MSCs在體外可以培養(yǎng)、擴(kuò)增，應(yīng)用二甲基亞礬誘導(dǎo)能向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)提供一種新的細(xì)胞來源。本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1. 一種人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞的二甲基亞礬誘導(dǎo)方法，其包括如下步驟S1.臍血的收集和單個(gè)核細(xì)胞的分離無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶血 40-60ml，肝素抗凝，濃度為20U/ml，所有樣本均于采集后12h內(nèi)分離；用Hank，S平衡鹽溶液1 1稀釋、混勻，疊加于Fieoll-Hypaque上面，相對(duì)密度為1.0779/L，稀釋血與 Fieoll-Hypaque液的柱高比為2 1，以2000r/min離心20min，取界面層的單個(gè)核細(xì)胞，力口 Hank’ S平衡鹽溶液離心、洗滌兩次，加入培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為IxlOfVml左右；S2.細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增培養(yǎng)基采用Mesencult 培養(yǎng)液，并調(diào)整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印，將細(xì)胞分裝于25T培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-7 后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每 3-5d半量換液一次；待細(xì)胞達(dá)到80% -90%融合時(shí)，用1 1的2. 5g/L胰蛋白酶和0. 2g/ LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代；傳代培養(yǎng)過程中每3d半量換液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復(fù)上述操作，傳代培養(yǎng)記為幾代， 其余類推；S3.定向誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化取傳至第3代的MSCS按虹105/1密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片，用含有l(wèi)mmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20 % FCS)預(yù)誘導(dǎo)Mh，PBS洗滌3遍后，換成含10g/L的二甲基亞礬(DMSO)和 100mmol/L的丁化輕基苯甲醚(BHA)的無血清DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔30min在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；以及S4.免疫組織化學(xué)鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3遍， 加入過氧化物酶阻斷液以消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清工作液室溫下封閉20min，去除血清后分別加入小鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)絲蛋白(NF)單抗工作液， 置于濕盒中4°C下過夜，PBS洗滌3遍，分別滴加羊抗小鼠的Ig-FITC和TRITC的二抗工作液，37°C下孵育2h，PBS漂洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察；鏡下隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野 (X100)，計(jì)算NSE和NF-M陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。
全文摘要
本發(fā)明提出一種應(yīng)用含二甲基亞礬和丁化輕基苯甲醚的無血清DMEM誘導(dǎo)來源于人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元細(xì)胞。在無菌條件下收集正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶血，經(jīng)肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離臍血的單個(gè)核細(xì)胞，以偏酸性的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和純化，獲得貼壁細(xì)胞，取擴(kuò)增第三代后的應(yīng)用二甲基亞礬誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化，免疫組化標(biāo)記顯示經(jīng)誘導(dǎo)后的MSCs表達(dá)神經(jīng)絲蛋白(NF)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。人臍血MSCs在體外可以培養(yǎng)、擴(kuò)增，應(yīng)用二甲基亞礬誘導(dǎo)能向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)提供一種新的細(xì)胞來源。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102533644SQ20111044784
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者陸華 申請(qǐng)人:陸華