一種與耐草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種與耐草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與耐草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雜草的存在給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食產(chǎn)量帶來損失，除草劑的開發(fā)與應(yīng)用給人類帶來了福音。草甘膦是目前全球應(yīng)用最為廣泛的除草劑之一，其主要作用機理是競爭性抑制真菌、細(xì)菌、藻類、高等植物、頂復(fù)門寄生蟲體內(nèi)莽草酸合成途徑中的芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成過程中的關(guān)鍵酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enoIpyruvyIshikima te-3-phosphate synthase, EPSPS, EC 2.5.1.19)的活性，擾亂莽草酸合成途徑，干擾蛋白質(zhì)合成，阻止次生產(chǎn)物的形成，最終使植株死亡。草甘膦的唯一靶標(biāo)酶為EPSP合成酶。自1969年Ahmed等在真菌體中芳香族氨基酸的生物合成過程中首次發(fā)現(xiàn)EPSP合成酶之后，研究人員對EPSP合成酶的研究范圍逐漸擴(kuò)大，不僅集中在對其酶活性及動力學(xué)方面的研究，對EPSP合成酶相對應(yīng)的EPSPS基因的研究也逐漸深入。大量研究表明，作物和雜草對草甘膦的抗性多由EPSPS基因及其突變引起，因此各國科學(xué)家投入了大量精力研究各物種中的EPSPS基因。不同作物品種或同種作物不同品系之間對除草劑的抗性水平存在較大差異，利用除草劑抗性表型鑒定，篩選出天然抗性的品種，對其除草劑靶標(biāo)酶基因進(jìn)行克隆和功能檢測，進(jìn)而獲得抗除草劑候選基因，是近年來抗除草劑候選基因及其應(yīng)用的主要手段之一。隨著抗草甘膦候選基因EPSPS的不斷發(fā)現(xiàn)和分離，通過轉(zhuǎn)化抗性候選基因培育抗草甘膦作物的發(fā)展突飛猛進(jìn)。至今，通過轉(zhuǎn)化EPSPS基因，創(chuàng)制出了抗草甘膦的大豆、玉米、油菜、甜菜、苜蓿、棉花等多種作物的抗性品系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與耐草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，命名為PVEPSPS，是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與耐草甘膦相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白中，一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述的序列2由525個氨基酸組成。編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述編碼基因如下(I)-(4)中任意一種的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)序列表中序列I的自5’末端的第207至1784位的核苷酸所示的DNA分子；
(3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼與耐草甘膦相關(guān)蛋白的DNA分子；(4)與(I)或⑵限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與耐草甘膦相關(guān)蛋白的DNA分子。上述編碼基因中，所述嚴(yán)格條件可為如下:在6XSSC，0.5%305的溶液中，在651:下雜交，然后用2 X SSC, 0.1% SDS和1XSSC,0.1% SDS各洗膜一次。上述的序列I由2028個脫氧核苷酸組成，自5’端的第207至1784位核苷酸為PVEPSPS 的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF),組成。含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組載體具體為將所述蛋白的編碼基因插入PGEX4T-1載體的Sma I和Not I酶切位點間，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。上述重組菌為將上述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，在本發(fā)明的實施例中，上述宿主菌具體為BL21 (DE3)。擴(kuò)增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在本發(fā)明的實施例中，上述引物對的一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列3，上述引物對中的另一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列4。本發(fā)明 的另一個目的是提供一種耐草甘膦產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌。上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌在制備耐草甘膦產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌在耐草甘膦中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌在培育耐草甘膦植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第三個目的是提供一種培育耐草甘膦重組菌的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將上述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，所述重組菌的耐草甘膦性高于所述宿主菌，所述宿主菌具體為BL21 (DE3)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個新的蛋白，將其編碼基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，可提高轉(zhuǎn)基因菌株的耐草甘膦能力，得到耐草甘膦產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的基因可用于培育高耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物品種，具有很高的應(yīng)用價值。


圖1為敏感和抗性菜豆莽草酸含量比較。圖2為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜。圖3為表達(dá)PVEPSPS基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)基因菌株(轉(zhuǎn)pGEX4T_PVEPSPS大腸桿菌)的草甘膦抗性鑒定。
圖4為大腸桿菌pGEX4T-PVEPSPS在不同濃度草甘膦處理下生長曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例1、耐草甘膦蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)1、耐草甘膦材料莽草酸含量測定草甘膦作用于植物時，植物體內(nèi)的EPSP合成酶受抑制，作為EPSP合成酶代謝上游的莽草酸不能轉(zhuǎn)換成EPSP。莽草酸途徑的堵塞導(dǎo)致了高量的莽草酸積累。由于莽草酸積累是EPSP合成酶抑制的直接結(jié)果，因此莽草酸積累可作為揭示草甘膦作用的生物指標(biāo)。通過植物體內(nèi)莽草酸積累量的多少可以初步判斷出植物對草甘膦的耐性程度。將不同品種菜豆材料播種，在菜豆長至第二復(fù)葉期時用噴霧器以2.096a.1.kg.ha4草甘膦噴灑處理，以篩選到具有天然抗性的菜豆(Phaseolus vulgaris)為抗性材料，以其他經(jīng)草甘膦處理后死亡的菜豆為敏感材料。草甘膦處理后1(1、3(1、5(1、7(1、10(1、14(1取樣一次，剪取菜豆葉片洗凈晾干，_80°C保存。待菜豆材料表型鑒定后將抗性單株(命名為89-09)和敏感單株，各取樣品0.5g，剪碎于研缽中液氮研磨，加入1.0mL 0.25mol/L HCl,轉(zhuǎn)移至離心管中，4°C, 12000rpm離心15min,收集上清液，4 °C保存待測。(I)莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將莽草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品IOmg溶于0.25mol/L HCl 1.0mL中，分別取0、1、5、10、50、100 μ L上述樣品已0.25mol/L HCl定容至1.0mL0取200 μ L上清液，加入2.0mLl.0 %的過碘酸溶液，3h后加入2.0mL 1.0moI/L的NaOH并混勻，然后加入1.2mL的0.lmol/L甘氨酸混勻，靜置5min,于380nm比色,記錄OD值。(2)菜豆莽草酸含量測定采取與莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的相同步驟測定吸光度OD值。根據(jù)莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
計算出莽草酸含量。莽草酸積累量的測定可以初步判斷材料對草甘膦的敏感性。2.096a.1.kg.ha—1草甘膦處理后抗性(89-09)與敏感菜豆葉片中莽草酸含量的測定，表明在草甘膦作用下抗性與敏感菜豆莽草酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在2.096a.1.kg.h^1草甘膦處理后9d時抗性與敏感菜豆莽草酸含量達(dá)到最大值(圖1)，抗性材料莽草酸含量為敏感材料的50%，說明莽草酸在敏感材料中累積量高于抗性材料。2.096a.1.kg -ha^1草甘膦處理9d后敏感品種莽草酸一直持續(xù)較高的累積量，在調(diào)查的時間范圍(14d)內(nèi)敏感菜豆莽草酸累積量高于抗性品種。由此推斷由于莽草酸途徑中EPSP合酶的作用引起菜豆材料對草甘膦抗性。2、耐草甘膦蛋白的發(fā)現(xiàn)以抗性菜豆單株89-09葉片為材料，提取RNA。(1)3，RACE采用TaKaRa公司3’ -Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒中自帶的反轉(zhuǎn)錄體系。將菜豆 RNA Iyg 和 3’ RACEAdaptor (5 μ M) 1.0 μ L 的混合物 70 °C 變性 IOmindKi2min，然后再加入 5 XM-MLV Buffer 2.0 μ L, dNTPs (IOmM) 1.0 μ L, RNase InhibitorlOU,Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H_) 50U,加入 Nuclease-Free Water 到終體系10 μ L0 42°C 60min,72°C 15min0 產(chǎn)物用于后續(xù)試驗。3’ RACE 所用引物:3’ RACE Adaptor:含有由 TaKaRa 獨特設(shè)計的 dT 區(qū)域及 Adaptor Primer 部分3’ RACE Outer Primer:5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’PV-3’ gspoutF:5’ -ATGCCTGATGTAGCCATGACC-3’PCR 反應(yīng)體系為:反轉(zhuǎn)錄 cDNA 反應(yīng)液，2.Ομ L ；1 XcDNA Dilution Buffer11,8.0yL ;PV-3，gspoutF (10 μ Μ)，2.0 μ L ;3’ RACE Outer Primer (10 μ M), 2.0 μ L ；IOXExTaqPCR buffer (含 25 μ mol/mLMg2+)，5.0 μ L ；ExTaq DNA 酶，2.5U ;加入 ddH20 到終體系50 μ L0PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 2min，30個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用GelDoc凝膠成像系統(tǒng)儀在紫外燈下觀察并照相。目的片段的回收:具體操作步驟采用Axygen公司凝膠回收試劑盒提供的方法。在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡表面液體。計算凝膠重量，該重量作為一個凝膠體積(如IOOmg = 100 μ L體積)。加入3個凝膠體積的BufferDE-A,混合均勻后于75°C加熱，間斷混合(每2 3min),直至凝膠塊完全熔化(約6 8min)。加入0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻。吸取上一步中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中(置于2mL離心管)，12000rpm離心lmin，棄濾液。將制備管置回2mL離心管，加500 μ LBuffer Wl，12000rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回2mL離心管，加700 μ L Buffer W2,12000rpm離心30s,棄濾液。用同樣的方法再`用700 μ L Buffer W2洗漆一次，12000rpm離心lmin。將制備管置回離心管中，12000rpm離心lmin。將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在制備膜中央加25 30 μ L Eluent或去離子水，室溫靜止lmin, 12000rpm離心Imin洗脫DNA。目的片段與載體連接:純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接體系為:pMD18-TVector，1.0 μ L ;PCR Product, 2.0 μ L(約 40ng) ；Solution I，5.0 μ L ;加入 ddH20到終體系10 μ L?；旌暇鶆颍?6°C反應(yīng)過夜。目的片段的轉(zhuǎn)化及克隆鑒定:克隆載體pMDlS-Τ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體操作步驟按照天根生化科技有限公司提供的方法進(jìn)行。準(zhǔn)備1^/^!^(5(^8/1^)，1 了641&1固體平板，每板涂IPTG 40 μ L、X-gal 16 μ L，室溫放置I 2h。取出大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞放置于冰上。短暫離心連接管，加入10 μ L連接液于100 μ L的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管底，緩慢單向混勻，于冰上放置30min。42°C熱擊90s，然后立即冰浴2 3min。加入900 μ L LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)lh。4000rpm離心4min,棄掉部分離心液后沉淀回溶。取適量涂于平板上，37°C倒置培養(yǎng)12 16h。挑取白色克隆于1.0mL LB/Amp的液體培養(yǎng)基中于37°C，200rpm,培養(yǎng)6 10h。以培養(yǎng)過夜的陽性克隆子菌液為模板，用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以鑒定插入片段。M13F:5， -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，
M13R:5’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG—3’反應(yīng)體系為:菌液，1.Ομ L ;10XPCR Buffer (含 25 μ mol/mL Mg2+)，2.0 μ L ;2mmol/LdNTPs, 2.0 μ L ；M13F (2 μ mol/L)，1.5 μ L ；M13R(2 μ mol/L)，1.5 μ L ；Taq DNA 酶 2U ；加入ddH20到終體系20 μ L。PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35個循環(huán)；72°C延伸8min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取PCR檢測為陽性的菌液樣品，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。(2)5，RACE取10 μ g 抗性菜豆總 RNA, 10XCIP Buffer 2.0 μ L, Calf Intestine AlkalinePhosphatase (CIP) 2.0 μ L,加入 Nuclease-free Water 到終體系 20 μ L?；旌暇鶆?，37 V Ih0 力口入 Ammo nium Acetate Solution 15 μ L, Nuclease-free Water 115 μ L、acidphenol: chloroform = 1:1 150 μ L,徹底潤旋混勻，室溫 13400rpm 離心 5min,吸取上清至一新離心管中。加入氯仿150 μ L,禍旋，室溫13400rpm離心5min,吸取上清至一新離心管中。加入150 μ L異丙醇，渦旋，冰上放置IOmin0 13400rpm離心20min，用500μ L70%乙醇洗漆沉淀，13400rpm離心5min,棄去乙醇,干燥沉淀。用11 μ LNuclease-free Water溶解沉淀,命名為 CIP’d RNA，置于冰上。取 5yL CIP’d RNA，加入 10XTAP Buffer 1.0μ L,Tobacco Acid Pyrophosphatase 2.0 μ L, Nuclease-free Water 2.0 μ L,混勻，37°C lh,處理后的 RNA 命名為 CIP/TAP-treated RNA。取 2.0 μ LCIP/TAP-treated RNA，加入 5’ RACEAdapter 1.0 μ L, 10 X RNA Ligase Buffer 1.0 μ L (用手快速溫?zé)崛芙?、T4RNA Ligase5U、Nuclease-free Water 4.0 μ L,混勻，37°C lh,處理后的 RNA 命名為 Ligated RNA。RT-PCR:Ligated RNA, 2.0 μ L ；dNTPs (2.5mM), 4.0 μ L ；Random Decamers, 2.0 μ L ；10 X RT Buffer,2.0 μ L；RNase Inhibitor,1.0 μ L ；M~MLV Reverse Transcriptase,
1.0 μ L ;加入Nuclease-free Water到終體積20 μ L。混勻，42°C溫育lh, _20°C保存或進(jìn)行PCR。5’ RACE 所用引物:5， RACE Adaptor:5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3，5’ RACE Outer Primer:5’ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3’5’ RACE Inner Primer:5’ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3’PV-5，gspoutR:5，-AGGAATCTCGTGGTGGTCCAGTAAC-3，PV-5，gspinR:5’ -CAGTGACTGCTGCACCAGCTAG-3’Outer PCR 反應(yīng)體系:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，1.0 μ L ；dNTPs (2.5mM), 4.0 μ L ；PV-5’ gspoutR(lOyM)，2.0μ L ;5’ RACE Outer Primer (10 μ Μ), 2.0 μ L ； 10 X ExTaq PCRbuffer (含 25 μ mol/mL Mg2+)，5.0 μ L ;TaKaRa ExTaq DNA 酶，2.5U ;加入 ddH20 到終體積50 μ L0Outer PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 3min 后，94°C變性 30s，68_58°C退火 30s，72°C延伸lmin，每循環(huán)降低1°C，進(jìn)行11個循環(huán);94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin,進(jìn)行26個循環(huán)；72°C延伸lOmin，然后4°C保存。Inner PCR 反應(yīng)體系:Outer PCR 產(chǎn)物，I μ L ;dNTPs (2.0mM)，5.0 μ L ;PV-5，gspinR(10yM)，2.0yL;5，RACE Inner Primer (10 μ Μ), 2.0 μ L ； 10 X ExTaq PCRbuffer (含 25 μ mol/mL Mg2+), 5.0 μ L ；TaKaRa ExTaq DNA 酶，2.5U ;加入 ddH20 至終體積50 μ L0Inner PCR 反應(yīng)體系:94°C預(yù)變性 3min 后，94°C變性 30s，68_58°C退火 30s，72°C延伸lmin，每循環(huán)降低1°C，進(jìn)行11個循環(huán);94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin,進(jìn)行26個循環(huán)；72°C延伸lOmin，然后4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用GelDoc凝膠成像系統(tǒng)儀在紫外燈下觀察并照相。目的片段的回收、目的片段與載體連接、目的片段的轉(zhuǎn)化及克隆鑒定方法同3， RACE0(3)菜豆EPSPS基因全長cDNA的分離以3’RACE和5’RACE拼接的序列結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 5.0和Oligo
6.0軟件設(shè)計菜豆EPSPS cDNA全長引物。PVEPSPAF:5’ -AAACACTTTATGTGACTCAATC-3’PVEPSPAR:5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTC-3’cDNA第一鏈的合成:反轉(zhuǎn)錄合成體系為:1μ g總RNA，加入5 XPrimerScriptTMBu ffer 4.0 μ L, Random 6mers 1.0 μ L> Oligo dT Primer 1.0 μ L>PrimerScript TM RTEnzyme Mix I 1.0 μ L,加入 Nuclease-free Water 至終體積 2O μ L。反轉(zhuǎn)錄合成條件為:37°C，15min;85°C，5s，_20°C保存。RT-PCR 反應(yīng)體系為:cDNA 第一鏈模板，0.5yL;10XPCR Buffer (含 25 μ mol/mLMg2+)，2.0 μ L ;2mmol/L dNTPs, 2.0 μ L ；PVEPSPF(2 μ mol/L)，2.5 μ L ；PVEPSPR(2 μ mol/L)，2.5 μ L ；ExTaq DNA 酶 IU ;加入 ddH20 至終體積 20 μ L。RT-PCR反應(yīng)程序:在Tl/Thermocycler擴(kuò)增儀上進(jìn)行。94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，65-54°C退火30s(每循環(huán)降低I。。)，72°C延伸2min，進(jìn)行12個循環(huán)；94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸2min，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用GelDoc凝膠成像系統(tǒng)儀在紫外燈下觀察并照相。目的片段的回收、目的片段與載體連接、目的片段的轉(zhuǎn)化及克隆鑒定方法同3， RACE0PCR擴(kuò)增得到2.0kb左右的片段，即獲得的全長cDNA命名為PVEPSPS。經(jīng)過測序表明，PVEPSPS長2028bp，具有序列表中序列I的核苷酸序列，自序列I的5’端的第207至1784位核苷酸為PVEPSPS的編碼序列，編碼一條長526個氨基酸的蛋白PVEPSPS，PVEPSPS具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。自序列2的氨基端第1-526氨基酸為EPSPS結(jié)構(gòu)域序列。上述PVEPSPS也可以通過人工合成序列I獲得。實施例2、耐草甘膦蛋白及其編碼基因的功能驗證1、耐草甘膦蛋白的獲得將PVEPSPS的ORF克隆pGEX4T_l載體，具體方法為:根據(jù)上述PVEPSPS編碼區(qū)cDNA序列設(shè)計引物，序列如下所示:PVEPSPF，5’ -TTCCCGGGTATGGCCCAGGTGAGCAGAG-3’ (下劃線標(biāo)注的是Sma I 酶識別位點，序列 3) ;PVEPSPR，5’-遼CGGCCGCTCCTAGTGCTTGGTGAACCTCTCG-3，(下劃線標(biāo)注的是 Not I 酶識別位點，序列 4)。將菜豆89-09單株(陶波，秦智偉，曲桂琴等.1993.菜豆抗草甘膦基因篩選的研究.中國農(nóng)學(xué)通報.9 (5):31 33，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以該cDNA為模板，以PVEPSPF和PVEPSPR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。也可以以人工合成的序列I作為模板，以PVEPSPF和PVEPSPR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1578bp的片段，測序表明，該片段具有序列I的自5’末端的第207至1784位的核苷酸序列。2、原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物1578bp的片段用Sma I和Not I雙酶切，得到酶切片段與經(jīng)過同樣酶切得到的PGEX4T-1載體(購自GE Healthcare，產(chǎn)品目錄號27-4580-01)連接，得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列I的自5’末端的第207至1784位的核苷酸插入pGEX4T_l載體的Sma I和Not I酶識別位點之間，得到重組載體，將該重組載體命名為pGEX4T-PVEPSPS。4、轉(zhuǎn)pGEX4T-PVEPSPS大腸桿菌的獲得用核酸構(gòu)建體導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法獲得轉(zhuǎn)pGEX4T-PVEPSPS大腸桿菌，具體方法為:制作大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將核酸構(gòu)建體PGEX4T-PVEPSPS轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)細(xì)胞中獲得重組菌株，通過氨芐抗性篩選重組菌。以培養(yǎng)的大腸桿菌陽性克隆轉(zhuǎn)化子為模板，以PVEPSPF和PVEPSPR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增到1578bp的片段的為陽性重組菌，將該重組菌株命名為BL21(DE3)/PGEX4T-PVEPSPS。采用同樣的方法，將空載體PGEX4T-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21(DE3)細(xì)胞中，得到重組菌BL21 (DE3) /pGEX4T-l，提取質(zhì)粒，以PVEPSPF和PVEPSPR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未得到1578bp的片段，重組菌BL21(DE3)/pGEX4T-l為轉(zhuǎn)空載體重組菌。5、轉(zhuǎn)pGEX4T-PVEPSPS大腸桿菌的草甘膦抗性鑒定挑取重組單菌落BL21 (DE3)/pGEX4T-PVEPSPS接種至LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至OD600為0.6后，加入終濃度為1.0mmol.T1IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)。在IPTG誘導(dǎo)后0h、2h、4h、6h、8h、12h分別取2mL菌液(分裝于2個2mL Eppendorf管中)，其中一管12000rpm離心30s收集菌體，另一管進(jìn)行草甘膦抗性鑒定。將菌體懸于80 μ L pH 7.0 0.2mmol.T1Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液中，同時加入 20 μ L5 X SDS上樣緩沖液，于渦旋混勻儀懸浮沉淀，沸水煮8min，以備電泳加樣。采用不連續(xù)垂直SDS-PAGE電泳檢測PVEPSPS基因表達(dá)蛋白，以BL21 (DE3) /pGEX4T_l和BL21 (DE3)為陰性對照，以BL21 (DE3) /pGEX4T-CP4EPSPS為陽性對照。蛋白電泳上層濃縮膠為5 %，下層分離膠為 12%。上述的BL21 (DE3) /pGEX4T_CP4EPSPS 的構(gòu)建方法如下:以孟山都公司第一代抗草甘膦轉(zhuǎn)EPSPS基因的大豆DOl (王曉波，蔣凌雪，魏利，劉林，陸偉，李文欣，王俊，陶波，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟.外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因組中的整合與定位.作物學(xué)報.2010，36 (3):365-375，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)單株的cDNA為模板，用CP4 EPSPS cDNA全長引物:CP4FLF:5’ -GAATTCATGGCACAAATTAACAACATGGC-3，(含 EcoR I 酶切位點)CP4FLR:5’ -GTCGACTCAGGCAGCCTTCGTATCGG-3，(含 Sal I 酶切位點)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1584bp的PCR產(chǎn)物，將該PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切得到的PGEX4T-1連接，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切檢測驗證，得到1584bp的為陽性質(zhì)粒，命名為PGEX4T-CP4EPSPS，將含有該陽性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為BL21(DE3)/pGEX4T-CP4EPSPS。結(jié)果如圖2所示，其中，1-4:1PTG未誘導(dǎo)前;5_8:1PTG誘導(dǎo)后2h ；9~12:1PTG誘導(dǎo)后 4h ；13-16:1PTG 誘導(dǎo)后 6h ； 17-20:1PTG 誘導(dǎo)后 8h ;21_24IPTG 誘導(dǎo)后 12h ;每 4 個樣品順序為 BL21 (DE3)、BL21 (DE3) /pGEX4T_l、BL21 (DE3) /pGEX4T_PVEPSPS、BL21 (DE3) /PGEX4T-CP4EPSPS 陽性樣品，從圖 2 中可以看出，BL21 (DE3) /pGEX4T_PVEPSPS 在 IPTG 誘導(dǎo)后，GST融合蛋白(約為26kDa)能夠正常表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后2h后，BL21 (DE3)/pGEX4T-PVEPSPS、BL21 (DE3) /pGEX4T_CP4EPSPS 陽性樣品蛋白(均約為 55kDa+GST 融合蛋白26kDa = SlkDa)開始表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時間的增長，蛋白表達(dá)量有所增加，當(dāng)誘導(dǎo)達(dá)到6h 12h時，蛋白表達(dá)量處于穩(wěn)定狀態(tài)，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。將上述可以誘導(dǎo)表達(dá)81kDa的重組菌BL21 (DE3)/pGEX4T_PVEPSPS進(jìn)行草甘膦抗性鑒定，同時接種在含有草甘膦濃度0mM、25mM、50mM、75mM、IOOmM的液體LB培養(yǎng)基中7d后觀察菌落生長情況；以BL21 (DE3) /pGEX4T-l和BL21 (DE3)為對照。7d觀察菌 落生長，結(jié)果如圖3，圖3中為培養(yǎng)7d觀察菌落生長，其中A依次為BL21 (DE3) /pGEX4T-PVEPSPS 在草甘膦濃度為 OmM、25mM、50mM、75mM、IOOmM 時生長情況；B 依次為BL21 (DE3)/pGEX4T-l在草甘膦濃度為OmM、25mM、50mM、75mM、IOOmM時生長情況；C依次為BL21 (DE3)在草甘膦濃度為OmM、25mM、50mM、75mM、IOOmM時生長情況，從圖3 可以看出，BL21 (DE3)/pGEX4T_PVEPSPS、BL21 (DE3)/pGEX4T_l 和 BL21 (DE3)在OmM的LB培養(yǎng)基中溶液混濁，菌株均能生長正常，證明三個菌種都具有較強的活力；BL21 (DE3) /pGEX4T-PVEPSPS在含有草甘膦25mM、50mM、75mM的LB培養(yǎng)基中溶液混濁，菌株能夠正常生長，但是渾濁度比在含有草甘膦OmM的LB培養(yǎng)基中程度輕，菌株生長稍弱，可見隨著草甘膦濃度的增加，草甘膦對BL21 (DE3) /pGEX4T-PVEPSPS的抑制作用增強；BL21(DE3)/pGEX4T-l和大腸桿菌BL21 (DE3)在含有草甘膦25mM、50mM的液體LB培養(yǎng)基中能夠生長，在75mM的LB培養(yǎng)基中顏色透亮，菌株不能正常生長，因為菌種大腸桿菌BL21(DE3)本身就具有弱的抗草甘膦能力，但是在高草甘膦濃度下不能生長；大腸桿菌PGEX4T-PVEPSPS在含有草甘膦濃度75mM的液體LB培養(yǎng)基中可以正常生長，而大腸桿菌PGEX4T不能生長，證明轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中成功復(fù)制表達(dá)，其功能得到了發(fā)揮。將1(^1^上述各菌株接種至含有草甘膦0禮、251111、501111、751111、1001111的2011^ LB培養(yǎng)基(蛋白胨1.0%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1.0%，121°C高壓滅菌18min)中培養(yǎng)7d，以分光光度計測定0D_值。各菌株的生長結(jié)果如圖4所示，圖4為BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS(pGEX4T-PVEPSPS)、BL21(DE3)/pGEX4T-l(pGEX4T-l)和大腸桿菌BL21(DE3) (BL21)在不同濃度草甘膦處理下生長曲線。BL21 (DE3) /pGEX4T_PVEPSPS (pGEX4T-PVEPSPS)在含有草甘膦 OmM、25mM、50mM、75mM、100mM 的 LB 中的 OD600 為 0.648,0.181,0.167,0.105,0.000 ；BL21 (DE3) /pGEX4T_l (pGEX4T)在含有草甘膦 0mM、25mM、50mM、75mM、IOOmM 的 LB 中的 OD600 為 0.636,0.223,0.090,0.000,0.000 ；BL21(DE3) (BL21)在含有草甘膦 OmM、25mM、50mM、75mM、IOOmM 的 LB 中的 0D6。。為0.648,0.178,0.194,0.000,0.000 ；從上述結(jié)果均可表明PVEPSPS基因在大腸桿菌中表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的耐草甘 膦能力。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與耐草甘膦相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(1)-(4)中任意一種的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)序列表中序列I的自5’末端的第207至1784位的核苷酸所示的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼與耐草甘膦相關(guān)蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與耐草甘膦相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入PGEX4T-1載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌為將權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，所述宿主菌具體為BL21 (DE3)。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對；所述引物對的一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列3，所述弓I物對中的另一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列4。
8.一種耐草甘膦產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4或6所述的重組菌。
9.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá) 盒、權(quán)利要求4或6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4所述的重組菌在制備耐草甘膦產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求4或6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4所述的重組菌在耐草甘膦中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求4或6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4所述的重組菌在培育耐草甘膦植物中的應(yīng)用。
10.一種培育耐草甘膦重組菌的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，所述重組菌的耐草甘膦性高于所述宿主菌，所述宿主菌具體為BL21(DE3)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與耐草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與耐草甘膦相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個新的蛋白，將其編碼基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，可提高轉(zhuǎn)基因菌株的耐草甘膦能力，得到耐草甘膦產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的基因可用于培育高耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物品種，具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/21GK103183730SQ20111044394
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者蔣凌雪, 金龍國, 陶波, 張慶賀, 邱麗娟 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)