專(zhuān)利名稱(chēng)：小鼠短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及鑒定小鼠多個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系及其試劑盒，可以快速準(zhǔn)確進(jìn)行小鼠細(xì)胞STR分型進(jìn)而鑒定小鼠細(xì)胞系類(lèi)型。
背景技術(shù)：
2009年，Nature上的一篇社論指出在數(shù)以千計(jì)的使用細(xì)胞系的生物實(shí)驗(yàn)室中， 許多實(shí)驗(yàn)室并不知道介于1/5-1/3之間的常用細(xì)胞系可能已不是原先認(rèn)為的那樣了。過(guò)去的25年里，大量的研究，加上美國(guó)、英國(guó)、德國(guó)和日本細(xì)胞庫(kù)的經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)18-36%的培養(yǎng)物含有錯(cuò)誤鑒定的物種或其它細(xì)胞類(lèi)型。就連管理嚴(yán)格的美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的細(xì)胞庫(kù)都出現(xiàn)了細(xì)胞系遭污染的現(xiàn)象?，F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室研究人員唯一的辦法是給細(xì)胞驗(yàn)明正身，使用DNA 指紋圖譜(STR分型技術(shù))驗(yàn)證所使用的細(xì)胞是否與數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)一致以鑒定身份。Nature 雜志社希望這一身份鑒定工作能持續(xù)下去，將主要的無(wú)限制增殖的細(xì)胞系(癌細(xì)胞)鑒定完畢。Nature雜志將會(huì)要求投稿人為文章中的所有細(xì)胞系提供身份驗(yàn)證。2010 $ 5 月 ATCC SDO (Standards Development Organization)Nature review cancer雜志上發(fā)表了題為〈〈Cell line misidentification :the beginning of the end》前瞻性報(bào)道。報(bào)道指出細(xì)胞系作為正?；蚰[瘤組織的模式細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)，然而很大一部分的細(xì)胞系被錯(cuò)誤標(biāo)記或被其它個(gè)體、組織、種系來(lái)源的細(xì)胞所替代，由于科學(xué)界無(wú)法解決此類(lèi)問(wèn)題以致大量因使用錯(cuò)誤鑒定的細(xì)胞系而導(dǎo)致誤導(dǎo)或存在潛在錯(cuò)誤的學(xué)術(shù)論文發(fā)表。通過(guò)近年來(lái)的努力而開(kāi)發(fā)出的STR分型方法已成為對(duì)人源細(xì)胞進(jìn)行鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，STR分型的應(yīng)用成為根除細(xì)胞錯(cuò)誤鑒定這一問(wèn)題的重要一步。STR位點(diǎn)是由不同數(shù)目重復(fù)單元組成的重復(fù)DNA序列。STR分型的原理為在一單管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)多態(tài)性DNA片段。每一個(gè)STR位點(diǎn)均能被擴(kuò)增且擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記上不同顏色的熒光，使得擴(kuò)增產(chǎn)物很容易通過(guò)片段大小和顏色來(lái)區(qū)分。STR分型最先應(yīng)用于親緣鑒定、法醫(yī)鑒定、以及鑒定在20年之前的大災(zāi)難中遇難的受害者。隨后，STR分型用于細(xì)胞鑒定中。用STR分型來(lái)做細(xì)胞鑒定具有其它方法所不具備的優(yōu)勢(shì)1.高度豐富信息同時(shí)分析多個(gè)STR位點(diǎn)，可以建立每個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)分型圖譜，便于不同來(lái)源細(xì)胞進(jìn)行比對(duì)。2.靈敏度高，能夠檢測(cè)Ing或更低的DNA量，能夠檢測(cè)早期細(xì)胞污染。3.分型快速、且結(jié)果穩(wěn)定可靠，易于操作及自動(dòng)化。許多方法已被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞系交叉污染，包括同工酶分析、核型分析、人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)分型，免疫分型和DNA指紋識(shí)別。這些方法都可以鑒別出某一種細(xì)胞系，但是分辨能力各不一樣。然而，這些方法在不同實(shí)驗(yàn)室所得到的數(shù)據(jù)卻不盡相同，以致沒(méi)有任何一種方法可以用來(lái)建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)參考數(shù)據(jù)庫(kù)。由于STR分型具有快速、鑒定的細(xì)胞系結(jié)果明確等無(wú)以倫比的優(yōu)點(diǎn)，故STR分型的應(yīng)用價(jià)值最大。目前STR分型技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于人源細(xì)胞系的鑒定，并已建立起標(biāo)準(zhǔn)的 STRMarker組合，用于鑒定1000多種細(xì)胞。但對(duì)于小鼠細(xì)胞系的鑒定，由于沒(méi)有成型的多重STR擴(kuò)增體系和相關(guān)的產(chǎn)品，STR分型并未得到廣泛應(yīng)用。在過(guò)去一個(gè)世紀(jì)的研究中，小鼠已經(jīng)成為建立人類(lèi)遺傳性疾病的動(dòng)物模型的最佳實(shí)驗(yàn)材料，小鼠細(xì)胞系已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。如在疾病研究和疫苗生產(chǎn)方面常用的小鼠細(xì)胞系有A9、3T3、NS-1、J774A. 1、CTLL_2、SC_1等多種，是除了人類(lèi)細(xì)胞外被應(yīng)用數(shù)量最多的動(dòng)物細(xì)胞，數(shù)量有幾百種。建立小鼠細(xì)胞系的STR分型方法，對(duì)于每一位使用小鼠細(xì)胞系的研究者來(lái)說(shuō)無(wú)疑是一個(gè)福音，也必將極大地促進(jìn)人類(lèi)健康事業(yè)的發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述領(lǐng)域中的不足和需求，本發(fā)明提供一種鑒定小鼠細(xì)胞系的復(fù)合擴(kuò)增體系，其擴(kuò)增的位點(diǎn)是一些可以用來(lái)鑒定小鼠細(xì)胞系的STR位點(diǎn)，在鑒定小鼠細(xì)胞系時(shí)，其分型快速、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、便于大規(guī)模推廣，這種方法隨著試劑盒開(kāi)發(fā)成功可以批量生產(chǎn)，使用條件可以模式化，全部過(guò)程都有自動(dòng)化設(shè)備，不再依賴于人的操作經(jīng)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，所需時(shí)間短，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間需要6小時(shí)左右。小鼠短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中同時(shí)擴(kuò)增STR位點(diǎn) D2Mit395. l、D4Mitl70. l、D5Mit201. 1、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6 和 D17Mit51. 1。所述擴(kuò)增體系中還包括性別決定位點(diǎn)Jaridl。所述擴(kuò)增體系中的被擴(kuò)增位點(diǎn)，分別由三種不同顏色的熒光素標(biāo)記，三組組合分別為第一組D15Mitl6、DllMit4、D2Mit395. 1 ；第二組D4Mitl70. 1、D7Mit40、 D5Mit201. 1 ；第三組D17Mit51. 1、Jaridl。所述三組中可以分別標(biāo)記為FAM或熒光素、HEX或JOE、TMR或VIC。所述第一組的標(biāo)記為FAM或熒光素；所述第二組標(biāo)記為HEX或JOE ；所述第三組標(biāo)記為T(mén)MR或VIC。所述STR位點(diǎn)由一對(duì)引物擴(kuò)增，其中一條引物的5’末端帶有標(biāo)記。所述引物分別為D2Mit395. 1 引物:引物 1 GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA，
引物 2 TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT ；D4Mitl70. 1 引物引物 1 TTCCATCGAGTGACTTGATC，引物 2 CAGAGTGGCTGTCATCTGG ；D5Mit201. 1 引物:引物 1 TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT，引物 2 :ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT ；D7Mit40 引物引物 1 :GTCAACAGTCAGGAAAGCTG，引物 2 CAGATGCTTGTATTTGCAAAG ；DllMit4 引物引物 1 CAGTGGGTCATCAGTACAGC，引物 2 :AAGCCAGCCCAGTCTTCATA ；
D15Mitl6 引物:引物 1 :AGACTCAGAGGGCAAAAT，引物 2 TCGGCTTTTGTCTGTCTG ；D17Mit51. 1 引物引物 1 TCTGCCCTGTAACAGGAG，引物 2 CTTCTGGAATCAGAGGAT ；Jaridl 引物: 引物 1 :GCTGACTACTTCAACATGC，引物 2 CCGCTGCCAAATTCTTTGG ；一種試劑盒，包括一擴(kuò)增體系，其特征在于包括STR位點(diǎn)D2MU395. 1、 D4Mitl70. 1、D5Mit201. 1、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、D17Mit51. 1 的特異性引物對(duì)的混合物。用于擴(kuò)增D2Mit395. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID NOl中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID NOl中400 450位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D4Mitl70. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID N02中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N02中170 220位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D5Mit201. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID N03中90 140位18 27個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N03中370 420位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D7Mit40的引物對(duì)是由位于SEQ ID N04中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N04中270 320位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增DllMit4的引物對(duì)是由位于SEQ ID N05中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N05中320 370位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D15Mitl6的引物對(duì)是由位于SEQ ID N06中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N06中200 250位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D17Mit51. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID N07中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N07中220 270位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增Jaridl的引物對(duì)是由位于SEQ ID N08中70 120位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N08中290 340位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。優(yōu)選引物對(duì)分別為上述8對(duì)引物。所述擴(kuò)增體系的總體積為20μ1，其中IOX緩沖液2μ1，2.5πιΜ each dNTP 1. 6μ 1，引物對(duì)混合物4. 0μ 1，2. 5U Taq酶0. 4 μ 1，去離子水10 μ 1，加入模板DNA為2 μ 1。
所述引物對(duì)混合物中的引物對(duì)濃度分別為0. 3 μ M的D15MU16引物對(duì)、0. 2 μ M的 DllMit4 引物對(duì)、1. ΟμΜ 的 D2Mit395. 1 引物對(duì)、1. ΟμΜ 的 D4Mitl70. 1 引物對(duì)、0. 7μΜ 的 D7Mit40 引物對(duì)、0. 5μΜ 的 D5Mit201. 1 引物對(duì)、0. 7 μ M 的 D17Mit51. 1 引物對(duì)和 0. 3 μ M 的 Jaridl引物對(duì)。所述擴(kuò)增體系的擴(kuò)增條件為94 0C變性，5-10min ；59-61 °C退火，30_60sec ； 70-72°C延伸，30-60sec ；60°C最后延伸，30_60min。經(jīng)過(guò)多年的不斷努力，我們目前已篩選出一些可以用來(lái)鑒定小鼠細(xì)胞系的STR位點(diǎn)，如 DlMitl59. 1、D2Mit395. 1、D4Mitl70. 1、D5Mit201. 1、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、 D17MU51. 1等。本發(fā)明選取其中7個(gè)具有高度靈敏性及特異性的STR位點(diǎn)(D2MU395. 1、 D4Mitl70. l、D5Mit201. l、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、D17Mit51. 1)對(duì)小鼠細(xì)胞系進(jìn)行分型檢測(cè)。同時(shí)，我們加入1個(gè)性別決定位點(diǎn)(Jaridl)，建立8個(gè)位點(diǎn)的多重復(fù)合擴(kuò)增體系。 本發(fā)明的整個(gè)方法過(guò)程1、引物組合的設(shè)計(jì)首先，我們選擇了具有高度靈敏性及擴(kuò)增特異性的STR位點(diǎn)，選擇的位點(diǎn)包括 D2Mit395. l、D4Mitl70. l、D5Mit201. l、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、D17Mit51. 1，以及性別決定位點(diǎn)Jaridl。我們從小鼠的基因組數(shù)據(jù)中篩選了這些STR位點(diǎn)，具有高度多態(tài)性，和很強(qiáng)的種屬特異性，跟人、豚鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等物種均沒(méi)有高度同源序列。根據(jù)候選的位點(diǎn)所在基因的GeneBank序列號(hào)從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因序列，各位點(diǎn)所在基因的部分序列見(jiàn)序列表。用于擴(kuò)增D2Mit395. 1的引物對(duì)是由位于序列1中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列1中400 450位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物
的組合。用于擴(kuò)增D4Mitl70. 1的引物對(duì)是由位于序列2中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列2中170 220位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物
的組合。用于擴(kuò)增D5Mit2011的引物對(duì)是由位于序列3中90 140位18 27個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列3中370 420位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增D7MU40位點(diǎn)的引物對(duì)是由位于序列4中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列4中270 320位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增D11MU4的引物對(duì)是由位于序列5中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列5中320 370位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增D15MU16的引物對(duì)是由位于序列6中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列6中200 250位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增D17Mit51. 1的引物對(duì)是由位于序列7中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列7中220 270位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增Jaridl的引物對(duì)是由位于序列8中70 120位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列8中290 340位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組
口 O以上引物由Primer3、Primer Premier 5和NCBIBlast等軟件設(shè)計(jì)而成。設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量確保各引物的Tm值在(60士2) °C的范圍內(nèi)，擴(kuò)增效率類(lèi)似并確保各對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小相差I(lǐng)OObp以上。設(shè)計(jì)完成后，用AutoDimer等軟件分析引物二聚體和不同引物之間的相互作用，如果有相互作用可產(chǎn)生非特異產(chǎn)物或者二聚體的需要重新設(shè)計(jì)，直至得到符合要求的引物序列。選用任一小鼠DNA模板，分別用8對(duì)引物進(jìn)行單重?cái)U(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于1. 5 2. 0 %的瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)電泳結(jié)果來(lái)調(diào)整PCR體系及擴(kuò)增條件以得到8對(duì)引物共同的擴(kuò)增條件。最終要達(dá)成的效果是在相同體系及擴(kuò)增條件下，所有的引物對(duì)均能出現(xiàn)明亮且較單一的目的條帶。如果有引物滿足不了上述條件，則重新設(shè)計(jì)引物。然后，將滿足要求的8對(duì)引物，分為三組進(jìn)行熒光標(biāo)記。每組采用一種熒光素，分別可以是FAM或熒光素、HEX或JOE、TMR或VIC。獲得熒光標(biāo)記引物后，用與之相配對(duì)的非熒光引物組合后分別進(jìn)行單重?cái)U(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于3130x1遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)毛細(xì)管電泳檢測(cè)的結(jié)果來(lái)評(píng)估每對(duì)引物的擴(kuò)增效率。其后，將同一熒光素標(biāo)記的2對(duì)或3對(duì)引物混合置于同一管中擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于3130x1遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)毛細(xì)管電泳檢測(cè)的結(jié)果來(lái)確定每對(duì)引物的擴(kuò)增效率以及此2對(duì)或3對(duì)引物的混合擴(kuò)增是否引起非特異擴(kuò)增。最后，根據(jù)單重?cái)U(kuò)增及組合擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳結(jié)果來(lái)初步確定各引物對(duì)的加入量，將8對(duì)引物混合置于同一管中擴(kuò)增，再根據(jù)復(fù)合擴(kuò)增的電泳結(jié)果來(lái)調(diào)整各自的濃度，使各引物對(duì)的擴(kuò)增效率(反應(yīng)在電泳結(jié)果的峰高上)基本一致為準(zhǔn)。最終確定的8對(duì)引物序列分別見(jiàn)序列表。2.擴(kuò)增體系及條件的建立2. ITaq酶的選擇Taq酶是擴(kuò)增體系的重要組分，多種Taq酶都滿足本發(fā)明的需要，如Takara公司的 rTaq 酶和 HS Taq 酶、KAPA Biosystems 公司的 Taq 酶、Roche 公司的 AmpliTaq Gold 酶等均能得到較好的擴(kuò)增效率和特異性，采用熱啟動(dòng)Taq酶比非熱啟動(dòng)酶的擴(kuò)增特異性要好。2. 2Mg2+濃度的選擇我們摸索了在不同Mg2+濃度梯度下復(fù)合擴(kuò)增，其中在1. 0-2. OmM的濃度范圍內(nèi)均能得到較好的擴(kuò)增。2. 3反應(yīng)體積的選擇我們分別采用了 50 μ 1、20 μ 1和10 μ 1體系進(jìn)行了復(fù)合擴(kuò)增，結(jié)果顯示20 μ 1與 50 μ 1的體系效果基本相當(dāng)。2. 4反應(yīng)程序的優(yōu)化退火及延伸溫度我們摸索了退火溫度從55°C到62°C之間各溫度下的擴(kuò)增情況， 結(jié)果顯示在59-61°C范圍內(nèi)均能得到較好結(jié)果。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在觀-32個(gè)有較好的效果。我們摸索了在以下變性、退火及延伸溫度下各時(shí)間范圍內(nèi)(見(jiàn)表1)的擴(kuò)增可以得到較好的結(jié)果
權(quán)利要求
1.小鼠短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中同時(shí)擴(kuò)增小鼠STR位點(diǎn) D2Mit395. l、D4Mitl70. l、D5Mit201. 1、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6 和 D17Mit51. 1。
2.根括權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中還擴(kuò)增小鼠性別決定位點(diǎn) Jaridl0
3.根括權(quán)利要求2所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中的被擴(kuò)增位點(diǎn)分別由三種不同顏色的熒光素標(biāo)記，三組組合分別為第一組D15Mitl6、DllMit4、D2Mit395. 1 ；第二組 D4Mitl70. l、D7Mit40、D5Mit201. 1 ；第三組D17Mit51. UJaridl0
4.根括權(quán)利要求3所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，所述三組中可以分別標(biāo)記為FAM或熒光素、 HEX或J0E、TMR或VIC。所述第一組的標(biāo)記為FAM或熒光素；所述第二組標(biāo)記為HEX或JOE ； 所述第三組標(biāo)記為T(mén)MR或VIC。
5.根括權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，所述引物分別為 D2Mit395. 1 引物:引物 1 :GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA， 引物 2 TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT ； D4Mitl70. 1 引物 引物 1 :TTCCATCGAGTGACTTGATC， 引物 2 CAGAGTGGCTGTCATCTGG ； D5Mit201. 1 引物 引物 1 :TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT， 引物 2 :ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT ； D7Mit40 引物引物 1 :GTCAACAGTCAGGAAAGCTG， 引物 2 CAGATGCTTGTATTTGCAAAG ； DllMit4 引物引物 1 :CAGTGGGTCATCAGTACAGC， 引物 2 :AAGCCAGCCCAGTCTTCATA ； D15Mitl6 引物 引物 1 :AGACTCAGAGGGCAAAAT， 引物 2 :TCGGCTTTTGTCTGTCTG ； D17Mit51. 1 引物 引物 1 :TCTGCCCTGTAACAGGAG， 引物 2 :CTTCTGGAATCAGAGGAT ； Jaridl 引物引物 1 :GCTGACTACTTCAACATGC， 引物 2 :CCGCTGCCAAATTCTTTGG。
6.一種試劑盒，包括一擴(kuò)增體系，其特征在于擴(kuò)增體系中包括STR位點(diǎn)D2MU395. 1、 D4Mitl70. l、D5Mit201. l、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6 和 D17Mit51. 1 的特異性引物對(duì)的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，所述引物的混合物中還包括性別決定位點(diǎn)Jaridl的引物對(duì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述特異性引物對(duì)分別為用于擴(kuò)增D2Mit395. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID NOl中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID NOl中400 450位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D4Mitl70. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID N02中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N02中170 220位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D5Mit201. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID N03中90 140位18 27個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N03中370 420位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D7Mit40的引物對(duì)是由位于SEQ ID N04中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N04中270 320位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增DllMit4的引物對(duì)是由位于SEQ ID N05中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N05中320 370位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D15Mitl6的引物對(duì)是由位于SEQ ID N06中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N06中200 250位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增D17Mit51. 1的引物對(duì)是由位于SEQ ID N07中90 140位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N07中220 270位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合，用于擴(kuò)增Jaridl的引物對(duì)是由位于SEQ ID N08中70 120位18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與SEQ ID N08中290 340位的互補(bǔ)序列的18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述特異性引物對(duì)分別為 D2Mit395. 1 引物:引物 1 :GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA， 引物 2 TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT ； D4Mitl70. 1 引物 引物 1 :TTCCATCGAGTGACTTGATC， 引物 2 CAGAGTGGCTGTCATCTGG ； D5Mit201. 1 引物 引物 1 :TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT， 引物 2 :ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT ； D7Mit40 引物引物 1 :GTCAACAGTCAGGAAAGCTG， 引物 2 CAGATGCTTGTATTTGCAAAG ；DllMit4 引物引物 1 :CAGTGGGTCATCAGTACAGC， 引物 2 :AAGCCAGCCCAGTCTTCATA ； D15Mitl6 引物 引物 1 :AGACTCAGAGGGCAAAAT， 引物 2 :TCGGCTTTTGTCTGTCTG ； D17Mit51. 1 引物 引物 1 :TCTGCCCTGTAACAGGAG， 引物 2 :CTTCTGGAATCAGAGGAT ； Jaridl 引物引物 1 :GCTGACTACTTCAACATGC， 引物 2 :CCGCTGCCAAATTCTTTGG。
全文摘要
本發(fā)明涉及小鼠短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系及檢測(cè)試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及在一個(gè)PCR體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)小鼠的短串聯(lián)重復(fù)序列(D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1)及1個(gè)性別決定位點(diǎn)(Jarid1)，對(duì)小鼠DNA進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增、毛細(xì)管電泳檢測(cè)。該體系可以用于小鼠細(xì)胞的基因分型，由于各個(gè)位點(diǎn)采用熒光標(biāo)記的引物，得到的產(chǎn)物帶有熒光標(biāo)記，可以在遺傳分析儀等儀器上進(jìn)行檢測(cè)，得到的片段長(zhǎng)度更精確，可重復(fù)性更高。本體系操作簡(jiǎn)單、便于大規(guī)模推廣，全部過(guò)程都有自動(dòng)化設(shè)備，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間只需6小時(shí)左右。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559878SQ20111043362
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者呂悅心, 周仲春, 陳初光 申請(qǐng)人:北京閱微基因技術(shù)有限公司