MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞及其微囊化制備方法與應(yīng)用的制作方法

專利名稱：MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞及其微囊化制備方法與應(yīng)用的制作方法
MSCs,ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞及其微囊化制備方法與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及干細(xì)胞誘導(dǎo)5-HT神經(jīng)細(xì)胞與細(xì)胞隔離(微囊化) 技術(shù)和方法，具體的說(shuō)，是MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞及其微囊化制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
( 一 ) 5-HT神經(jīng)細(xì)胞對(duì)中樞聯(lián)系和調(diào)節(jié)廣泛
5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元主要位于腦干中縫核、黑質(zhì)致密部、藍(lán)斑尾部和下丘腦，其發(fā)出纖維幾乎投射至整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，上行至邊緣系統(tǒng)(海馬、隔核、下丘腦)和大腦新皮質(zhì)(額、頂、枕、顳、島葉)的廣泛區(qū)域；下行至脊髓的前角軀體運(yùn)動(dòng)和側(cè)角內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)(交感和副交感)神經(jīng)元。其生理功能顯示中縫核、孤束核、下丘腦、杏仁核、海馬等處的5-HT神經(jīng)元及纖維與睡眠調(diào)節(jié)有關(guān)，海馬、杏仁核和額葉等處的神經(jīng)元協(xié)調(diào)情緒和行為。我們利用動(dòng)物2. 5 %多聚甲醛足底注射通模型實(shí)驗(yàn)，經(jīng)背側(cè)海馬刺激鎮(zhèn)痛顯示中腦中央管周圍灰質(zhì)(PAG)和脊髓后角5-HT表達(dá)增多，表明5-HT及其神經(jīng)元參與鎮(zhèn)痛。有實(shí)驗(yàn)還顯示破壞中縫核頭端，非快速動(dòng)眼睡眠完全消失，用5-HT合成抑制劑可引起完全失眠，并誘發(fā)腦電波異常放電，側(cè)腦室注射5-HT酸可消除這一現(xiàn)象， 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)5-HT神經(jīng)元及其遞質(zhì)5-HT參與機(jī)體睡眠、情緒、行為和鎮(zhèn)痛等多功能調(diào)節(jié)，即5-HT神經(jīng)元對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。
( 二)長(zhǎng)期應(yīng)激導(dǎo)致5-HT神經(jīng)細(xì)胞功能失代償-表現(xiàn)抑郁
研究資料表明，中樞系統(tǒng)內(nèi)5-HT神經(jīng)元釋放5-HT參與應(yīng)激調(diào)節(jié)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng) 5-HT表達(dá)水平降低時(shí)，易發(fā)生心理應(yīng)激損傷。這種心理應(yīng)激損傷可以引起兩個(gè)后果①使抑郁癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)及患抑郁癥的嚴(yán)重程度增力口，其作用機(jī)制主要是中樞5-HT水平低下一腎上腺軸功能亢進(jìn)一當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷性事件刺激后一植物神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度興奮一通過(guò)一系列反應(yīng)使得去甲腎上腺素和腎上腺素水平升高，此時(shí)由于中樞5-HT神經(jīng)元釋放5-HT的水平低下而對(duì)這兩種激素釋放進(jìn)行的反饋性調(diào)節(jié)不能達(dá)到正常，導(dǎo)致持續(xù)性腎上腺軸機(jī)能亢進(jìn)；②中樞5-HT水平低下一對(duì)海馬的調(diào)節(jié)功能不足，由于海馬屬于中樞邊緣系統(tǒng)的重要部分，5-HT —海馬通路對(duì)不明原因?qū)е逻^(guò)早啟動(dòng)的傷害性應(yīng)激具有阻止效應(yīng)，因而5-HT水平降低所致的海馬失調(diào)節(jié)，可引起行為“脫抑制”(對(duì)環(huán)境刺激過(guò)度敏感)，易于發(fā)生應(yīng)激性機(jī)體傷害。許多研究資料也證明了，抑郁癥患者體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的異常主要表現(xiàn)為血和腦脊液內(nèi)5-HT濃度降低，尸檢也發(fā)現(xiàn)腦組織內(nèi)5-HT含量降低。另外，一些關(guān)于越戰(zhàn)抑郁癥患者的研究也提示了機(jī)體內(nèi)5-HT含量的降低，與戰(zhàn)時(shí)失去正常的自我控制能力甚至戰(zhàn)后罹患“戰(zhàn)后綜合癥”有著密切的關(guān)系。還有研究顯示，5-HT對(duì)NE神經(jīng)元興奮的高位腦區(qū)具有抑制作用；而NE神經(jīng)元高度興奮亦可抑制中縫核的5-HT神經(jīng)元活動(dòng)。當(dāng)5-HT減少時(shí)則導(dǎo)致NE 通路持續(xù)興奮，引起失眠、焦慮、抑郁等，進(jìn)而導(dǎo)致5-HT再度減少，更加重睡眠與情緒障礙， 兩者互為因果，由此形成惡性循環(huán)。因此，依據(jù)抑郁癥腦的5-HT減少，或者5-HT耗竭或原本其合成釋放水平低下易發(fā)病為病因，臨床上應(yīng)用5-HT再攝取抑制劑治療抑郁癥，部分患CN 102533653 A者取得了較好的效果。而部分患者無(wú)效，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，這極可能屬于難治型或重癥抑郁癥，源于其中樞5-HT水平過(guò)低。我們采用國(guó)際公認(rèn)的慢性應(yīng)激動(dòng)物模型，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔5-HT神經(jīng)元移植顯示可阻止動(dòng)物行為異常和多器官損傷的發(fā)生，表明5-HT細(xì)胞移植可預(yù)防和治療抑郁癥或者應(yīng)激對(duì)機(jī)體所致的傷害。
(三)中樞5-HT水平過(guò)低導(dǎo)致周圍器官病變-癌變易感
有關(guān)腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究報(bào)道，中樞5-HT水平低下可能使某些器官細(xì)胞癌變易感或者癌細(xì)胞易于惡化(演進(jìn))，其機(jī)制可通過(guò)中樞一周圍(迷走等)神經(jīng)一器官細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能低下與神經(jīng)內(nèi)分泌腎上腺軸功能亢進(jìn)，通過(guò)糖皮質(zhì)激素、腎上腺素和去甲腎上腺素過(guò)量分泌，使器官細(xì)胞的能量代謝低下與毒性分子-興奮性氨基酸和氧自由基(誘導(dǎo)型一氧化氮iNO、丙二醛MDA)的堆積一器官細(xì)胞抗損傷或修復(fù)功能障礙所致，如食管squamous cell carcinoma(ESCC)，雖然病因?qū)W早已提示食管癌變與環(huán)境 (食物霉變、亞硝胺)、遺傳易感等因素有關(guān)，但近年來(lái)的研究表明，食管癌屬慢性疾病，心理應(yīng)激因素(精神創(chuàng)傷或抑郁)在食管癌變中占有重要地位，且神經(jīng)-膽堿能抗炎通路 (cholinergic antiinflammatory pathway, CAP), CAP通路中迷走神經(jīng)對(duì)應(yīng)激引起的內(nèi)臟損傷保護(hù)作用也需要通過(guò)腦干中縫核5-HT功能的激活。由于中樞5-HT參與應(yīng)激調(diào)節(jié)，慢性心理應(yīng)激或抑郁可導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT長(zhǎng)期處于低水平狀態(tài)，因而心理應(yīng)激一中樞5-HT水平低下對(duì)食管黏膜上皮細(xì)胞癌變具有密切關(guān)系。另有Toh S等經(jīng)對(duì)應(yīng)用抗抑郁藥5-HT再攝取抑制劑調(diào)查比較，發(fā)現(xiàn)用藥人群的肺癌發(fā)病率降低。Pyroia S經(jīng)肝切除+N-亞硝基二乙胺(NDEA)誘發(fā)肝腫瘤，發(fā)現(xiàn)腦干和大腦皮質(zhì)5-HT2C受體結(jié)合力在肝腫瘤形成過(guò)程中升高， 即提示5-HT水平過(guò)低。El-Salhy等將奧曲肽(胃腸道止血藥)、galanin(神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)肽-可調(diào)節(jié)食欲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等)和5-HT等三聯(lián)對(duì)胃腸癌細(xì)胞具有更好的抗癌作用。我們最近采用5-HT細(xì)胞蛛網(wǎng)膜下腔移植防治應(yīng)激+亞硝胺食管癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致食管癌變加速與惡化，而5-HT細(xì)胞移植可使鼠食管癌變減緩或發(fā)病率降低。
(四)中樞5-HT不足周圍器官病變機(jī)制之一神經(jīng)通路功能失常
有關(guān)中樞5-HT神經(jīng)元一迷走神經(jīng)膽堿能通路調(diào)節(jié)異常與內(nèi)臟傷害或其細(xì)胞癌變關(guān)系的研究顯示，由中樞5-HT神經(jīng)元一迷走神經(jīng)膽堿能一內(nèi)臟的通路已經(jīng)明確，經(jīng)迷走神經(jīng)及其節(jié)后纖維釋放ACh作用于細(xì)胞的AChR (鑲嵌在細(xì)胞膜內(nèi)的糖蛋白)，以調(diào)節(jié)內(nèi)臟器官或效應(yīng)細(xì)胞。Grozio等研究報(bào)道膽堿受體具有調(diào)控細(xì)胞功能、增殖、轉(zhuǎn)化和分化的作用，受體的亞型差異在細(xì)胞增殖-分化或腫瘤發(fā)生-惡性轉(zhuǎn)化中起著重要作用，分別采用 nAChR-a 7或mAChR-3拮抗劑可抑制肺癌細(xì)胞增生。有研究證實(shí)，癌細(xì)胞分化程度愈低， AChRs亞型減少愈顯著，結(jié)合位點(diǎn)丟失愈多。我們通過(guò)ACh對(duì)食管癌高、低分化細(xì)胞(高分化EC9706、低分化EC109)分別培養(yǎng)21天，發(fā)現(xiàn)ACh可使食管癌細(xì)胞AChR、基因損傷修復(fù)因子I^rxl、細(xì)胞分化鈣依賴調(diào)節(jié)蛋白Annexin2和細(xì)胞骨架蛋白Keratins表達(dá)上調(diào)，形態(tài)趨向分化。
我們近來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，切斷迷走神經(jīng)可加速亞硝胺對(duì)食管上皮誘發(fā)的癌變，此可能與消弱了 CAP通路的保護(hù)作用有關(guān)。結(jié)合TPH2基因多態(tài)為氧化還原，參與性易感和迷走神經(jīng)功能削弱可使應(yīng)激+亞硝胺誘發(fā)食管癌變加速，此可解釋近些年對(duì)食管癌高發(fā)區(qū)隨訪新發(fā)現(xiàn)食管癌變發(fā)展不穩(wěn)定的特點(diǎn)，即部分食管癌患者不治療而愈或多年存活病變程度維持不變，這提示人類癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化(可逆轉(zhuǎn))的能力，經(jīng)中樞-迷走神經(jīng)-器官功能的良性調(diào)節(jié)，可以起到抑制癌細(xì)胞，控制病情或達(dá)到治愈的目的，即經(jīng)改善中樞5-HT 系統(tǒng)一迷走神經(jīng)通路和節(jié)后神經(jīng)遞質(zhì)AChR功能對(duì)有關(guān)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與分化具有良性影響。由此表明，中樞5-HT和迷走神經(jīng)對(duì)抑制有關(guān)內(nèi)臟器官細(xì)胞癌變與抗癌具有重要作用。
(四)中樞5-HT神經(jīng)細(xì)胞失代償-源于獲得性與先天性因素
研究提示中樞5-HT水平低下的原因有獲得性和先天性兩個(gè)方面①獲得性不足的原因是由于腦干中縫核5-HT神經(jīng)元發(fā)出纖維至邊緣系統(tǒng)、大腦新皮質(zhì)和脊髓等軀體與內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)核(交感和副交感)極為廣泛的投射，屬5-HT的應(yīng)激調(diào)節(jié)通路的基礎(chǔ)。中樞內(nèi) 5-HT通路可調(diào)節(jié)NE和ACh兩個(gè)系統(tǒng)，NE可導(dǎo)致5-HT神經(jīng)元發(fā)生遞質(zhì)減少與耗竭。慢性應(yīng)激和抑郁癥患者血、腦脊液(CSF)、腦組織5-HT含量降低，海馬5-HT總受體含量減少，經(jīng)治療病情緩解后受體密度則可恢復(fù)，而阻斷5-HT2A/2C受體均可導(dǎo)致焦慮和失眠，加劇NE興奮導(dǎo)致的5-HT耗竭。由此可見(jiàn)，慢性應(yīng)激啟動(dòng)的NE系統(tǒng)持續(xù)高張狀態(tài)可導(dǎo)致中樞5-HT耗竭，而中樞5-HT耗竭可進(jìn)行性地加劇NE系統(tǒng)興奮與情緒障礙，兩者互為因果，以此形成惡性循環(huán)，由此導(dǎo)致中樞5-HT進(jìn)行性耗竭。②先天性5-HT水平低下的原因是部分患者先天性小海馬，此類先天性小海馬可能源于最新研究發(fā)現(xiàn)的中樞5-HT神經(jīng)元合成5-HT的限速酶一色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylase, TPH)基因多態(tài)性有關(guān)。TPHl主要在周圍系統(tǒng)發(fā)揮作用，TPH2則在中樞；小鼠C1473G突變導(dǎo)致447位的脯氨酸被精氨酸取代，其中樞5-HT的水平可下降30% 70%，并且出現(xiàn)與中樞5-HT系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)的行為改變。 當(dāng)攜帶G等位基因的TPH2在PC12細(xì)胞表達(dá)時(shí)，合成的5-HT僅為野生型A的45%。由此提示，中樞5-HT低水平其原發(fā)神經(jīng)元基因功能異常與誘發(fā)因素聯(lián)合所致，亦為部分人群易患抑郁癥或其器官細(xì)胞易發(fā)生癌變的重要基礎(chǔ)。
(五)中樞5-HT細(xì)胞移植改善中樞5-HT失代償-應(yīng)用前景廣闊
目前為止，臨床用于抗抑郁癥、抗癌的藥物帶來(lái)較大的毒副作用。綜上可知，如果對(duì)處于長(zhǎng)期慢性應(yīng)激狀態(tài)、抑郁癥和有關(guān)癌癥患者施予5-HT細(xì)胞中樞移植，經(jīng)其釋放的 5-HT補(bǔ)償作用，進(jìn)而可起到調(diào)節(jié)中樞或抗癌的效果。并且可以通過(guò)此法預(yù)防某些特發(fā)事件或者特殊情況如特大地震、戰(zhàn)爭(zhēng)等，由于心理刺激或壓力導(dǎo)致的自我失控狀態(tài)或情感異常綜合癥也可起到防治效果。目前國(guó)外對(duì)抑郁癥或癌癥的防治也正是愈來(lái)愈重視聯(lián)合神經(jīng)系統(tǒng)-遞質(zhì)調(diào)節(jié)包括其激動(dòng)劑與拮抗劑在內(nèi)的綜合性治療實(shí)驗(yàn)，已呈現(xiàn)出良好的前景。
(六)臨床應(yīng)用5-HT神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源-干細(xì)胞誘導(dǎo)功能細(xì)胞與微囊化
可用于治療移植的成體5-HT神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源極為匱乏，且異體移植存在排斥反應(yīng)， 難以作為臨床移植推廣應(yīng)用。目前，干細(xì)胞已成為細(xì)胞或者器官替代治療的理想方案，應(yīng)用自體干細(xì)胞或者同種異體組織相容性好的干細(xì)胞誘導(dǎo)的方法獲得可用于人體移植的5-HT 神經(jīng)細(xì)胞則成為必然趨勢(shì)。已有研究表明，人體骨髓和脂肪均為豐富的干細(xì)胞庫(kù)，易取安全，且其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs和ASCs可向多功能分化。然而，驅(qū)使干細(xì)胞朝著需要的功能細(xì)胞分化必須有相應(yīng)的方法和條件，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)促進(jìn)干細(xì)胞向5-HT神經(jīng)細(xì)胞分化的成熟技術(shù)和方法報(bào)道。由于自體干細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的成熟細(xì)胞移植有時(shí)亦可發(fā)生輕度的排斥反應(yīng)，而避免排斥反應(yīng)的有效方法是將移植的細(xì)胞與免疫系統(tǒng)隔離一微囊化。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5_HT神經(jīng)細(xì)胞。
本發(fā)明的目的在于，提供一種MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5_HT神經(jīng)細(xì)胞的微囊化制備方法。
本發(fā)明的目的在于，提供一種微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域即微囊化自身MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5_HT神經(jīng)細(xì)胞及其制備方法。
由此，發(fā)明人設(shè)計(jì)首先采用培養(yǎng)液，分離培養(yǎng)MSCs或ASCs，隨將其誘導(dǎo)分化成 5-HT神經(jīng)細(xì)胞，而后再經(jīng)微囊化以隔離消除抗原，保護(hù)/營(yíng)養(yǎng)/支持其長(zhǎng)期存活和分泌的作用。應(yīng)用該方法誘導(dǎo)分化的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)微囊化可適應(yīng)于抑郁癥，特別是難治型或者重癥抑郁癥、應(yīng)激傷害性疾病以及有關(guān)癌癥的治療。這類微囊化自身干細(xì)胞誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞可根據(jù)細(xì)胞釋放5-HT量子單位給予相對(duì)個(gè)體的細(xì)胞微囊數(shù)量進(jìn)行移植，對(duì)患者可起到生理調(diào)節(jié)和康復(fù)作用，無(wú)毒副作用，較其他抗抑郁癥藥物具有明顯的優(yōu)越性。發(fā)明人設(shè)計(jì)和創(chuàng)立的這一方法，對(duì)制備用于臨床的5-HT細(xì)胞成熟，可提供可靠的新技術(shù)和方法。
本發(fā)明包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, MSCs)或脂肪基質(zhì)細(xì)胞(adipose stromal stem cells,ASCs)誘導(dǎo)5-HT神經(jīng)細(xì)胞的方法和誘導(dǎo)型5-HT 細(xì)胞微囊化技術(shù)。
①將分離獲得的MSCs或ASCs經(jīng)系列條件誘導(dǎo)成為5_HT神經(jīng)細(xì)胞；
②再采用海藻酸鈉+納米-聚賴氨酸-海藻酸鈉+納米(alginate-Nano—Poly lysine—alginate-Nano, ANano-P-ANano)使之微囊化。
本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問(wèn)題，可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
作為本發(fā)明的第一方面，MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5_HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，采用培養(yǎng)液將MSCs或ASSCs經(jīng)分步培養(yǎng)誘導(dǎo)成為5-HT神經(jīng)細(xì)胞包括以下步驟
(I)MSCs 或 ASSCs 培養(yǎng)與傳代
①原代培養(yǎng)；
②消化傳代；
(2)前體誘導(dǎo)采用前體誘導(dǎo)液培養(yǎng)與誘導(dǎo)，該前體誘導(dǎo)液，將3代培養(yǎng)2天的細(xì)胞加入所述前體誘導(dǎo)液，隔日換液，培養(yǎng)4天；
將MSCs誘導(dǎo)成突起變細(xì)、胞體和胞核趨于變圓的前體細(xì)胞，細(xì)胞鑒定Nestin陽(yáng)性；
(3)功能誘導(dǎo)采用功能誘導(dǎo)液培養(yǎng)與誘導(dǎo)，該功能誘導(dǎo)液，加隔離層成熟5-HT神經(jīng)細(xì)胞，隔日換液，培養(yǎng)6天，將前體細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)成突起多、胞體和胞核變圓或多邊形的 5-HT神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞鑒定MAP2 (微管相關(guān)蛋白2)、NeuN (特異性神經(jīng)元核蛋白)、5_HT、TPH 陽(yáng)性、培養(yǎng)液放免測(cè)定其釋放5-HT濃度> 15ng/ml ；
(4)性能穩(wěn)定培養(yǎng)采用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)1天，細(xì)胞鑒定性能能穩(wěn)定，且釋放 5-HT的功能旺盛，即成為MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞。
其中，步驟(1)中，所述原代培養(yǎng)取骨髓5 IOml或脂肪組織3 5g，骨髓直接細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1.5X 106/ml的細(xì)胞密度；脂肪組織先經(jīng)微量消化，再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以 1.5 XlOVml的細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于50ml塑料培養(yǎng)瓶中，加以含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，置于飽和濕度、37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
以全骨髓，或全脂肪細(xì)胞貼壁法分離與純化MSCs或ASSCs 原代細(xì)胞培養(yǎng)4 換液，細(xì)心棄去未貼壁細(xì)胞；
此后隔日換液，倒置顯微鏡下觀察，至7天細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶側(cè)壁底。
其中，步驟(1)中，所述消化傳代MSCs或ASCs培養(yǎng)至長(zhǎng)滿瓶底，達(dá)接觸抑制，吸出培養(yǎng)液，加入CMF-PBS沖洗；加入0. 25%胰酶，置于37°C消化lmin，加入含10%血清的培養(yǎng)液以中止消化，吸管吹打使細(xì)胞從瓶壁脫落；
每瓶加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液IOml的培養(yǎng)液，按1 3瓶傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液。
至5天長(zhǎng)滿瓶底，再次消化傳代至第3代；
此方法培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形、桿狀、或多突形，鑒定⑶44、⑶133陽(yáng)性。
其中，步驟(2)中，所述前體誘導(dǎo)液主要成分按照重量份數(shù)計(jì)高糖DMEM 1000ml、 丙酮酸鈉80 120mg、亞硒酸鈉5 30 μ g、L-谷氨酰胺250 :350mg、2-巰基乙醇3 5 μ UNaHCO3 3 5g、HEPES5 7g、輔助誘導(dǎo)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) 100 200ng/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 100 200ng/全反式視黃酸(ATRA) 5 10mg，/組織液與細(xì)胞因子1 3份。
其中，步驟(3)中，所述功能誘導(dǎo)液主要成分(按照重量份數(shù)計(jì))高糖DMEM 1000ml、丙酮酸鈉80 120mg、亞硒酸鈉5 30 μ g、L-谷氨酰胺250 :350mg、2-巰基乙醇 3 5 μ 1、NaHCO3 3 5g、HEPES5 7g、B27 5 10ml、色氨酸1 5mg、輔助誘導(dǎo)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) 100 200ng/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 100 200ng/ ATRA5 IOmg/組織液與細(xì)胞因子1 3份。
其中，步驟(4)中，所述神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分(按照重量份數(shù)計(jì))-Neuronal Medium 1000ml、B2710 20ml、色氨酸5 10mg、輔助誘導(dǎo)因子為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (BDNF)100 200ng。
其中，所述步驟(2)和步驟(3)中，所述組織液為胰島素4 8μ、轉(zhuǎn)鐵蛋白1 5 mg、孕酮10 50ng、皮質(zhì)酮1 5mg、皮質(zhì)醇1 5mg、3碘原氨酸1 5mg、生物素1 5mg、人血清白蛋白lg、腐胺1 3mg等。
作為本發(fā)明的第二方面，MSCs, ASCs誘導(dǎo)的5_HT神經(jīng)細(xì)胞的微囊化制備方法，其特征在于，包括以下步驟
采用ANano-P-ANano (海藻酸鈉+納米微粒-聚氨酸-海藻酸鈉+納米微粒)法， 經(jīng)靜電微囊發(fā)生器使MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞微囊化微囊化；
每微囊含20個(gè)或30個(gè)5-HT神經(jīng)細(xì)胞組(圖4)，使微囊內(nèi)的細(xì)胞充分接觸微囊壁，易于附著與營(yíng)養(yǎng)交換，即制成微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞。
作為本發(fā)明的第三方面，一種微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于， 用于制備治療抑郁癥的藥物。
作為本發(fā)明的第四方面，一種微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于， 用于制備抗癌藥物。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的微囊化誘導(dǎo)型5-HT細(xì)胞，該微囊化人5-HT神經(jīng)細(xì)胞中樞移植療法，將為臨床治療抑郁癥及抗癌治療提供新的途徑，并為其他相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)工具細(xì)胞等，有著廣闊的應(yīng)用前景，從而可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。此方法制備的微囊化誘導(dǎo)型5-HT細(xì)胞特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)如下
(1)微囊化誘導(dǎo)型5-HT細(xì)胞移植屬生理調(diào)節(jié)作用。
(2)該誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞無(wú)外源基因影響。
(3)該干細(xì)胞誘導(dǎo)法高效簡(jiǎn)便采用此法可使MSCs和MSCs、ASCs誘導(dǎo)成為5-HT神經(jīng)細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)95%以上，5-HT釋放功能強(qiáng)。此法僅采用細(xì)胞換液培養(yǎng)法，易于把握與操作。
(4)制備的微囊具有良好的物理性能，可起支持/營(yíng)養(yǎng)/保護(hù)作用。
(5)制備的微囊具有良好的生物穩(wěn)定性。
(6)制備的微囊具有適宜的微滲透性。
(7)無(wú)免疫源性。
(8)良好的組織相容性5-HT神經(jīng)細(xì)胞的微囊。
(9)無(wú)毒副作用。


圖1為3代MSCs培養(yǎng)5天
圖2為MSCs前體誘導(dǎo)培養(yǎng)4天
圖3A為MSCs誘導(dǎo)5_HT培養(yǎng)6天(甲苯胺藍(lán)染色)
圖;3B為MSCs誘導(dǎo)5_HT培養(yǎng)6天(5_HT免疫組化染色)
圖 4 為 ANano-P-Anano 微囊圖5為微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞作用原理示意圖具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或廠商提供的條件進(jìn)行。
本發(fā)明包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, MSCs)或脂肪基質(zhì)細(xì)胞(adipose stromal stem cells,ASCs)誘導(dǎo)5-HT神經(jīng)細(xì)胞的方法和誘導(dǎo)型5-HT 細(xì)胞微囊化技術(shù)。
①將分離獲得的MSCs或ASCs經(jīng)系列條件誘導(dǎo)成為5_HT神經(jīng)細(xì)胞；
②再采用海藻酸鈉+納米-聚賴氨酸-海藻酸鈉+納米(alginate-Nano—Poly lysine—alginate-Nano, ANano-P-ANano)使之微囊化。
骨髓，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,MSCs)來(lái)源于中國(guó)上海市上海第二軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)組織工程研究中心，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可自體或者同種異體。
脂肪組織，S卩脂肪基質(zhì)細(xì)胞(adipose stromal stem cells, ASCs)來(lái)源于中國(guó)上海市上海第二軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)組織工程研究中心，脂肪基質(zhì)細(xì)胞可自體或者同種異體。
微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞為制成即用。
實(shí)施例1
一、MSCs或ASSCs兩步法誘導(dǎo)5-HT神經(jīng)細(xì)胞
采用設(shè)計(jì)和配制的系列條件培養(yǎng)液，將MSCs或ASSCs經(jīng)分步培養(yǎng)誘導(dǎo)成為5_HT 神經(jīng)細(xì)胞。
(I)MSCs 或 ASSCs 培養(yǎng)與傳代
①原代培養(yǎng)根據(jù)患者的病情和體重，取其自身骨髓5 IOml或脂肪組織3 5g g，骨髓直接細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1. 5 XlOVml的細(xì)胞密度；脂肪組織先經(jīng)微量消化，再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1.5 X IO7 1.5 X 109/ml的細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于5 10個(gè)IOOml塑料培養(yǎng)瓶中， 加以含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，置于飽和濕度、37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
以全骨髓，或全脂肪細(xì)胞貼壁法分離與純化MSCs或ASSCs 原代細(xì)胞培養(yǎng)4 換液，細(xì)心棄去未貼壁細(xì)胞。
此后隔日換液，倒置顯微鏡下觀察，至7天細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶側(cè)壁底。
②消化傳代MSCs或ASCs培養(yǎng)至長(zhǎng)滿瓶底，達(dá)接觸抑制，吸出培養(yǎng)液，加入 CMF-PBS沖洗；加入0. 25%胰酶，置于37°C消化lmin，加入含10%血清的培養(yǎng)液以中止消化，吸管吹打使細(xì)胞從瓶壁脫落。
每瓶加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，按1 3瓶傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液。
至5天長(zhǎng)滿瓶底，再次消化傳代至第3代。
此方法培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形、桿狀、或多突形(圖1)，鑒定⑶44、⑶133陽(yáng)性。
(2)前體誘導(dǎo)采用前體誘導(dǎo)液培養(yǎng)與誘導(dǎo)，該前體誘導(dǎo)液主要成分高糖DMEM 1000ml、丙酮酸鈉80 120mg、亞硒酸鈉5 30 μ g、L-谷氨酰胺250 ;350mg、2-巰基乙醇3 5μ 1、NaHCO3 3 5g、HEPES5 7g、輔助誘導(dǎo)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF) 100 200ng/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 100 200ng/全反式視黃酸(ATRA) 5 IOmg, /組織液(所述組織液為胰島素4 8 μ、轉(zhuǎn)鐵蛋白1 5 mg、孕酮10 50ng、皮質(zhì)酮1 5mg、皮質(zhì)醇1 5mg、3碘原氨酸1 5mg、生物素1 5mg、人血清白蛋白lg、腐胺1 3mg等)與細(xì)胞因子1 3份，將3代培養(yǎng)2天的細(xì)胞加入前體誘導(dǎo)液，隔日換液， 培養(yǎng)4天。
將MSCs誘導(dǎo)成突起變細(xì)、胞體和胞核趨于變圓的前體細(xì)胞(圖2)，細(xì)胞鑒定 Nestin 陽(yáng)性。
(3)功能誘導(dǎo)采用功能誘導(dǎo)液培養(yǎng)與誘導(dǎo)，該功能誘導(dǎo)液主要成分(按照重量份數(shù)計(jì))高糖DMEM、丙酮酸、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、NaHCO3^ HEPES, B27、色氨酸、輔助誘導(dǎo)因子bFGF/BDNF/ATRA/組織液(所述組織液為胰島素4 8 μ、轉(zhuǎn)鐵蛋白1 5 mg、孕酮10 50ng、皮質(zhì)酮1 5mg、皮質(zhì)醇1 5mg、3碘原氨酸1 5mg、生物素1 5mg、人血清白蛋白lg、腐胺1 3mg等)與細(xì)胞因子等，加隔離層成熟5-HT神經(jīng)細(xì)胞，隔日換液，培養(yǎng)6天，將前體細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)成突起多、胞體和胞核變圓或多邊形的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞鑒定微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、特異性神經(jīng)元核蛋白(NeuN)、5-HT、TPH陽(yáng)性、培養(yǎng)液放免測(cè)定其釋放 5-HT 濃度 > 15ng/ml。
(4)性能穩(wěn)定培養(yǎng)采用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，該神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分，按照重量份數(shù)計(jì)Neuronal Medium 1000ml、B2710 20ml、色氨酸5 10mg、輔助誘導(dǎo)因子 BDNF100 200ng，培養(yǎng)1天，細(xì)胞鑒定性能能穩(wěn)定，且釋放5-HT的功能旺盛(圖3A和圖 3B)。
二、誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞微囊化
1、采用ANano-P-ANano (海藻酸鈉+納米微粒-聚氨酸-海藻酸鈉+納米微粒) 法，經(jīng)靜電微囊發(fā)生器使MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞微囊化微囊化；
每微囊含20個(gè)或30個(gè)5-HT神經(jīng)細(xì)胞組(圖4)，使微囊內(nèi)的細(xì)胞充分接觸微囊壁，易于附著與營(yíng)養(yǎng)交換，即制成微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞。
2、微囊材料性能與鑒定
實(shí)驗(yàn)觀測(cè)①微囊細(xì)胞經(jīng)采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)2、4、6天，倒置顯微鏡觀察微囊壁周緣形態(tài)維持好(無(wú)變形、凹陷或皺縮)，表明微囊物理性能良好，生物性能穩(wěn)定；②培養(yǎng)2、4、6 天，檢測(cè)培養(yǎng)上清液5-HT含量可達(dá)8 12ng/ml，反映細(xì)胞存活和功能良好，表明微滲透性適宜；③動(dòng)物(大鼠)蛛網(wǎng)膜下腔移植后無(wú)體溫升高，表明此微囊組織相容性強(qiáng)，且隔離作用良好，無(wú)引起發(fā)熱反應(yīng)的致熱源；④脊髓組織學(xué)檢驗(yàn)無(wú)白細(xì)胞浸潤(rùn)；腦脊液離心無(wú)白細(xì)胞增高，表明此類微囊對(duì)局部無(wú)毒副作用等。
①物理性能良好；②生物性穩(wěn)定；③微滲透性適宜；④組織相容性強(qiáng)，且隔離作用良好；⑤無(wú)毒副作用。
3、微囊化的5-HT神經(jīng)細(xì)胞功能鑒定
表明明確微囊化的神經(jīng)細(xì)胞存活良好、5-HT的合成與釋放旺盛，確定微囊個(gè)體量子釋放滴度與患者個(gè)體化微囊細(xì)胞移植數(shù)量。
微囊化的神經(jīng)細(xì)胞組功能檢測(cè)，每50ml培養(yǎng)瓶接種1 X IO3 5 X IO3個(gè)微囊細(xì)胞組，隔日取上請(qǐng)液檢測(cè)5-HT含量為5 18ng。依據(jù)中樞調(diào)節(jié)、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡和補(bǔ)償功能需要，個(gè)體移植量為3 X IO4 10 X IO4微囊。
三、微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞作用原理
(1)微囊維持囊內(nèi)細(xì)胞存活和功能，且免除免疫反應(yīng)
①細(xì)胞微囊的材料海藻酸鈉+納米微粒-聚氨酸-海藻酸鈉+納米微粒3層微膜，可為微囊內(nèi)的細(xì)胞提供適宜的附著和營(yíng)養(yǎng)攝取，維持其穩(wěn)定性，提高其5-HT合成和釋放功能，可為微囊外慢液流區(qū)脊髓軟膜對(duì)微囊適應(yīng)與親和，更易為其營(yíng)造存活的環(huán)境；
②該微囊為誘導(dǎo)的5-HT細(xì)胞提供隔離屏障，使其免于與免疫細(xì)胞接觸，避免由其引起的免疫反應(yīng)或免疫傷害，維護(hù)其良好存活；
③該微囊具有適宜的滲透性，即可使囊外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于滲入囊內(nèi)以足夠細(xì)胞所用，維持囊內(nèi)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，又可保證其釋放的5-HT易于滲出。
(2)微囊內(nèi)5-HT細(xì)胞釋放的5-HT補(bǔ)償腦脊液降低的5-HT和腦細(xì)胞的5-HT耗竭， 恢復(fù)或改善中樞的抗應(yīng)激損傷或者耐受能力。
抑郁癥、或與應(yīng)激有關(guān)的患者或部分癌癥患者中樞5-HT耗竭或者水平過(guò)低，而中樞5-HT耗竭可源于應(yīng)激所致的5-HT細(xì)胞功能衰竭(獲得性減弱)，或與生俱來(lái)的5-HT細(xì)胞TPH多態(tài)性而對(duì)應(yīng)激性傷害高易感(先天性不足)，致使其自身的5-HT細(xì)胞逐步發(fā)展為應(yīng)激耐受無(wú)能，而呈現(xiàn)失代償?shù)牟±憩F(xiàn)象，表現(xiàn)為憂慮、易怒、...等，由此引起中樞5-HT調(diào)節(jié)的神經(jīng)元功能異常而導(dǎo)致其下行傳導(dǎo)通路所所支配的器官細(xì)胞疾患易感，或病理惡性發(fā)展。
如圖5所示，微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞移植于蛛網(wǎng)膜下腔1，囊內(nèi)5-HT細(xì)胞釋放的5-HT經(jīng)滲透作用至蛛網(wǎng)膜下腔，移植的5-HT神經(jīng)細(xì)胞釋放5-HT滲出微囊入腦脊液2，隨腦脊液循環(huán)擴(kuò)散至相應(yīng)的神經(jīng)元而發(fā)揮其遞質(zhì)作用，腦脊液內(nèi)5-HT擴(kuò)散至海馬、下丘腦、迷走神經(jīng)背核細(xì)胞3。作用后的5-HT經(jīng)神經(jīng)元再攝取而失活或起營(yíng)養(yǎng)作用，海馬、下丘腦、迷走神經(jīng)背核經(jīng)生理調(diào)節(jié)改善功能失常4。
本發(fā)明的微囊化誘導(dǎo)型5-HT細(xì)胞，該微囊化人5-HT神經(jīng)細(xì)胞中樞移植療法，將為臨床治療抑郁癥及抗癌治療提供新的途徑，并為其他相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)工具細(xì)胞等，有著廣闊的應(yīng)用前景，從而可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。此方法制備的微囊化誘導(dǎo)型5-HT細(xì)胞特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)如下
(1)微囊化誘導(dǎo)型5-HT細(xì)胞移植屬生理調(diào)節(jié)作用該制備法獲得的微囊化誘導(dǎo)型細(xì)胞中樞移植，經(jīng)釋放補(bǔ)償耗竭的5-HT屬于正常神經(jīng)遞質(zhì)。此類微囊化誘導(dǎo)的5-HT細(xì)胞與現(xiàn)有抗抑郁癥、應(yīng)激損傷或抗癌藥相比，具有更良好的生理調(diào)節(jié)療效，而不會(huì)帶來(lái)不良作用。
(2)該誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞無(wú)外源基因影響該誘導(dǎo)法屬于化學(xué)誘導(dǎo)，沒(méi)有外源性載體(病毒或脂質(zhì)體等)和基因的導(dǎo)入，因而所得到的細(xì)胞移植至體內(nèi)，不會(huì)給機(jī)體帶來(lái)因病毒感染或異體基因整合發(fā)生基因組異常改變致使移植細(xì)胞或體內(nèi)其他細(xì)胞發(fā)生病理變化。
(3)該干細(xì)胞誘導(dǎo)法高效簡(jiǎn)便采用此法可使MSCs和MSCs、ASCs誘導(dǎo)成為5-HT神經(jīng)細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)95%以上，且具有旺盛的5-HT釋放功能強(qiáng)。此法僅采用細(xì)胞換液培養(yǎng)法， 無(wú)需載體構(gòu)建和基因轉(zhuǎn)染或基因?qū)氲葟?fù)雜的技術(shù)，因而易于把握與操作。
(4)制備的微囊具有良好的物理性能對(duì)囊內(nèi)細(xì)胞提供存活的適宜空間，可起支持 /營(yíng)養(yǎng)/保護(hù)作用，經(jīng)移植入人體，囊腔和囊壁的間隙無(wú)縮窄或膨脹變化。
(5)制備的微囊具有良好的生物穩(wěn)定性體內(nèi)移植后，經(jīng)腦脊液循環(huán)帶動(dòng)或軟膜附著均保持其穩(wěn)定的形態(tài)。
(6)制備的微囊具有適宜的微滲透性微囊壁富有適宜的孔隙率和親水性，可允許適宜的腦脊液營(yíng)養(yǎng)成分或者附著后軟脊膜毛細(xì)血管內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分向囊內(nèi)滲入和5-HT神經(jīng)細(xì)胞釋放的5-HT向囊外滲出，即易于微囊內(nèi)外的物質(zhì)交換。同時(shí)，對(duì)囊內(nèi)細(xì)胞與體內(nèi)免疫系統(tǒng)具有良好的隔離作用，避免移植細(xì)胞引發(fā)任何排斥反應(yīng)。
(7)無(wú)免疫源性微囊化誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞是來(lái)源于自體細(xì)胞，因而囊內(nèi)的 5-HT細(xì)胞本身是同體細(xì)胞，從理論講由此誘導(dǎo)的細(xì)胞不具有免疫原性或者僅極微弱的免疫原性，即不會(huì)引起機(jī)體移植排斥反應(yīng)，即體內(nèi)移植后，不引起蛛網(wǎng)膜下腔和全身炎癥反應(yīng)， 不發(fā)生腦脊液或血白細(xì)胞升高等現(xiàn)象。
(8)良好的組織相容性5-HT神經(jīng)細(xì)胞的微囊，采用ANano-P-ANano的海藻酸鈉組織相容性好，納米微粒組織豐富，進(jìn)一步增強(qiáng)組織相容性，使移植的細(xì)胞微囊與接觸的組織相互適宜，免除了現(xiàn)用藥物附帶的異物反應(yīng)。
(9)無(wú)毒副作用使用微囊化的5-HT神經(jīng)細(xì)胞是通過(guò)其釋放的5-HT發(fā)揮作用， 5-HT是中樞功能維持和調(diào)節(jié)必需的神經(jīng)遞質(zhì)，亦可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)發(fā)育，為中樞增加或補(bǔ)充所需要量的5-HT，可起到良好的生理作用，而無(wú)任何毒副作用，即無(wú)移植后發(fā)熱、肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等毒性反應(yīng)。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物界定。
權(quán)利要求
1.MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，采用培養(yǎng)液將MSCs或ASSCs經(jīng)分步培養(yǎng)誘導(dǎo)成為5-HT神經(jīng)細(xì)胞包括以下步驟(1)MSCs或ASSCs培養(yǎng)與傳代①原代培養(yǎng)；②消化傳代；(2)前體誘導(dǎo)采用前體誘導(dǎo)液培養(yǎng)與誘導(dǎo)，該前體誘導(dǎo)液，將3代培養(yǎng)2天的細(xì)胞加入所述前體誘導(dǎo)液，隔日換液，培養(yǎng)4天；將MSCs誘導(dǎo)成突起變細(xì)、胞體和胞核趨于變圓的前體細(xì)胞，細(xì)胞鑒定Nestin陽(yáng)性；(3)功能誘導(dǎo)采用功能誘導(dǎo)液培養(yǎng)與誘導(dǎo)，該功能誘導(dǎo)液，加隔離層成熟5-HT神經(jīng)細(xì)胞，隔日換液，培養(yǎng)6天，將前體細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)成突起多、胞體和胞核變圓或多邊形的5-HT 神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞鑒定MAP2 (微管相關(guān)蛋白2)、NeuN(特異性神經(jīng)元核蛋白)、5_HT、TPH陽(yáng)性、 培養(yǎng)液放免測(cè)定其釋放5-HT濃度> 15ng/ml ；(4)性能穩(wěn)定培養(yǎng)采用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)1天，細(xì)胞鑒定性能能穩(wěn)定，且釋放5-HT 的功能旺盛，即成為MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，步驟(1)中， 所述原代培養(yǎng)取骨髓5 IOml或脂肪組織3 5g，骨髓直接細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1. 5 X 106/ml的細(xì)胞密度；脂肪組織先經(jīng)微量消化，再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1. 5 X IO7 1. 5X109ml的細(xì)胞密度， 將細(xì)胞接種于IOOml塑料培養(yǎng)瓶中，加以含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，置于飽和濕度、37°C、 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；以全骨髓，或全脂肪細(xì)胞貼壁法分離與純化MSCs或ASSCs 原代細(xì)胞培養(yǎng)4 換液，細(xì)心棄去未貼壁細(xì)胞；此后隔日換液，倒置顯微鏡下觀察，至7天細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶側(cè)壁底。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，步驟(1)中， 所述消化傳代MSCs或ASCs培養(yǎng)至長(zhǎng)滿瓶底，達(dá)接觸抑制，吸出培養(yǎng)液，加入CMF-PBS沖洗； 加入0. 25%胰酶，置于37°C消化lmin，加入含10%血清的培養(yǎng)液以中止消化，吸管吹打使細(xì)胞從瓶壁脫落；每瓶加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，按1 3瓶分瓶傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液；至5天長(zhǎng)滿瓶底，再次消化傳代至第3代；此方法培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形、桿狀、或多突形，鑒定⑶44、⑶133陽(yáng)性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，步驟(2)中， 所述前體誘導(dǎo)液主要成分按照重量份數(shù)計(jì)高糖DMEM 1000ml、丙酮酸鈉80 120mg、亞硒酸鈉5 30 μ g、L-谷氨酰胺250 350mg、2-巰基乙醇3 5 μ UNaHCO3 3 5g、HEPES5 7g、輔助誘導(dǎo)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) 100 200ng/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (BDNF) 100 200ng/全反式視黃酸(ATRA) 5 10mg，/組織液與細(xì)胞因子1 3份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，步驟(3)中， 所述功能誘導(dǎo)液主要成分(按照重量份數(shù)計(jì))高糖DMEM 1000ml、丙酮酸鈉80 120mg、 亞硒酸鈉5 30 μ g、L-谷氨酰胺250 350mg、2-巰基乙醇3 5 μ 1、NaHCO3 3 5g、 HEPES5 7g、B27 5 10ml、色氨酸1 5mg、輔助誘導(dǎo)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF) 100 200ng/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 100 200ng/ATRA5 IOmg/組織液與細(xì)胞因子1 3份。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，步驟(4)中， 所述神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分(按照重量份數(shù)計(jì))=Neuronal Medium 1000ml、B2710 20ml、色氨酸5 10mg、輔助誘導(dǎo)因子為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 100 200ng。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于，所述步驟(2) 和步驟(3)中，所述組織液為胰島素4 8μ、轉(zhuǎn)鐵蛋白1 5 mg、孕酮10 50ng、皮質(zhì)酮1 5mg、皮質(zhì)醇1 5mg、3碘原氨酸1 5mg、生物素1 5mg、人血清白蛋白lg、腐胺 1 3mg。
8.一種如權(quán)利要求1所述的MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞的微囊化制備方法，其特征在于，包括以下步驟采用ANano-P-ANano (海藻酸鈉+納米微粒-聚氨酸-海藻酸鈉+納米微粒)法，經(jīng)靜電微囊發(fā)生器使MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞微囊化微囊化；每微囊含20個(gè)或30個(gè)5-HT神經(jīng)細(xì)胞組，使微囊內(nèi)的細(xì)胞充分接觸微囊壁，易于附著與營(yíng)養(yǎng)交換，即制成微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞。
9.一種如權(quán)利要求8所述的微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，用于制備治療抑郁癥的藥物。
10.一種如權(quán)利要求8所述的微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，用于制備抗癌藥物。
全文摘要
MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞，包括以下步驟(1)MSCs或ASSCs培養(yǎng)與傳代①原代培養(yǎng)；②消化傳代；(2)前體誘導(dǎo)；(3)功能誘導(dǎo)；(4)性能穩(wěn)定培養(yǎng)。MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞的微囊化制備方法，采用ANano-P-ANano(海藻酸鈉+納米微粒-聚氨酸-海藻酸鈉+納米微粒)法，經(jīng)靜電微囊發(fā)生器使MSCs、ASCs誘導(dǎo)的5-HT神經(jīng)細(xì)胞微囊化微囊化；每微囊含20個(gè)或30個(gè)5-HT神經(jīng)細(xì)胞組，使微囊內(nèi)的細(xì)胞充分接觸微囊壁，易于附著與營(yíng)養(yǎng)交換，即制成微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞。微囊化誘導(dǎo)型5-HT神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用，用于制備治療抑郁癥的藥物或抗癌藥物。本發(fā)明的微囊化誘導(dǎo)型5-HT細(xì)胞，該微囊化人5-HT神經(jīng)細(xì)胞中樞移植療法，將為臨床治療抑郁癥及抗癌治療提供新的途徑。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102533653SQ201110421109
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者何星, 傅強(qiáng), 吳帥, 吳愛(ài)群, 常驍, 張喜, 張子騰, 李振強(qiáng), 王常勇, 王曉涵, 繆震元, 高永俊一 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)