專利名稱：兔波氏桿菌lamp檢測(cè)用引物組、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜細(xì)菌病的診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)的引物組、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
兔波氏桿菌病是由波氏桿菌(BordetellabornchispeticEiJb)引起的一種多發(fā)性呼吸道疾病，主要引起哺乳仔兔和斷乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支氣管炎和膿皰性肺炎等，部分兔場(chǎng)波氏桿菌感染率高達(dá)70%。近年來(lái)在我省乃至我國(guó)各養(yǎng)兔地區(qū)波氏桿菌發(fā)病日趨嚴(yán)重，是引起家兔呼吸系統(tǒng)疾病的最主要病原，該病病程長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)生，難治愈，易造成患兔生長(zhǎng)障礙，飼料利用率低，給養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，機(jī)體感染該菌后，往往容易繼發(fā)或并發(fā)感染其他細(xì)菌和病毒，導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道疾病，帶來(lái)更加嚴(yán)重的損失。并且也可感染人，尤其是免疫力低下的人群。國(guó)外對(duì)波氏桿菌的研究主要集中在豬， 特別是和多殺性巴氏桿菌混合感染所引起的豬萎縮性鼻炎，而國(guó)內(nèi)對(duì)兔的波氏桿菌病的研究多在于該病的普通細(xì)菌學(xué)方法的診斷和最基本的防治措施。目前，在病原體檢測(cè)方面主要檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)觀察、免疫學(xué)檢測(cè)和核酸檢測(cè)。兔波氏桿菌病的診斷主要還是依靠普通細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法，進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)的鑒定，動(dòng)物回歸試驗(yàn)等。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)診斷方法，繁瑣費(fèi)時(shí)，檢出率低，且檢測(cè)工作量大，效率不大。血清學(xué)診斷方法主要集中在乳膠凝集試驗(yàn)、微量凝集試驗(yàn)、Dot-ELISA和間接ELISA， ELISA檢測(cè)方法在敏感性和特異性上都有很大提高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但存在空窗期、交叉反應(yīng)等問(wèn)題。核酸檢測(cè)是一種較理想的病原學(xué)檢測(cè)方法，PCR及其衍生技術(shù)在敏感性及特異性上均表現(xiàn)良好，但這些技術(shù)存在儀器昂貴，對(duì)操作人員要求高的缺點(diǎn)，在基層和流行病調(diào)查前線難以應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)是 Notomi等2000年發(fā)明的一種新穎的擴(kuò)增技術(shù)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因上的6個(gè)特定區(qū)域的4 條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，具有高特異性、 快速靈敏、高效、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)兔巴氏桿菌LAMP檢測(cè)的引物組、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法相關(guān)研究報(bào)道，因此研制兔巴氏桿菌LAMP檢測(cè)的引物組、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法十分必要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)用弓I物組，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)一次簡(jiǎn)單的恒溫?cái)U(kuò)增，就可以達(dá)到快速檢測(cè)兔波氏桿菌的目的。采用該試劑盒和檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)用引物組，引物組包括 外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT
內(nèi)引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 內(nèi)引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含如下組分引物組、陽(yáng)性對(duì)照品、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和顯色液，所述引物組為 外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT
內(nèi)引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 內(nèi)引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。作為優(yōu)選，所述引物組中外引物組對(duì)和內(nèi)引物組對(duì)添加的摩爾比為1 :4 12 作為優(yōu)選，所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有兔波氏桿菌的基因組DNA。作為優(yōu)選，所述的反應(yīng)液中含有0.6 1.8 mmol/L dNTP，1.25 3 mmol/L Mg2+， 0. 2-1. 4mol/L Betaine, 2 X Thermopol Buffer (市售)。作為優(yōu)選，所述的Bst DNA聚合酶和顯色液為市售，顯色液優(yōu)選為STOR Green L為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)方法，該方法包括以下的步驟
1)提供待測(cè)樣品DNA;
2)在LAMP反應(yīng)體系中加入權(quán)利要求1所述的引物組、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶，混勻，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后滅活；
3)取滅活后部分產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果， 并同時(shí)對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照品的顯色結(jié)果，若顯色結(jié)果一致，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有兔波氏桿菌，若顯色結(jié)果不一致，則說(shuō)明待測(cè)樣品中不含有兔波氏桿菌。作為優(yōu)選，所述的恒溫反應(yīng)的溫度范圍為60_65°C，反應(yīng)時(shí)間為50-60min。最優(yōu)選，恒溫反應(yīng)的溫度范圍為61°C，反應(yīng)時(shí)間為50min。作為優(yōu)選，所述滅活的溫度為80°C，滅活時(shí)間為lOmin。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果
1、該兔波氏桿菌LAMP方法操作簡(jiǎn)單，具有良好的特異性，對(duì)同種細(xì)菌的不同菌株具有廣泛的適用性；
2、具有較高的靈敏度，可以檢出痕量級(jí)的模板兔波氏桿菌最低模板檢出量為10拷貝；
3、該快速反應(yīng)試劑盒反應(yīng)條件溫和，所需儀器簡(jiǎn)單，擴(kuò)增快速高效，不到Ih可完成，產(chǎn)率高，與PCR相比更快速、經(jīng)濟(jì)。
圖1為兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)結(jié)果圖，其中左-右1000DNA Marker、1 6 臨床樣品、7:陽(yáng)性對(duì)照、8 陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1
本實(shí)施例提供利用LAMP檢測(cè)兔波氏桿菌的引物組，該引物組由如下外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)組成
外引物組 1: GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT
內(nèi)引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 內(nèi)引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。實(shí)施例2
本實(shí)施例的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，包括，9個(gè)凍存管和說(shuō)明書(shū)。9個(gè)凍存管分別為代號(hào)凍存管A (4個(gè))裝有2XLAMP核心試劑預(yù)混物(dNTP、Mg2+、Betaine、 2 X Thermopol Buffer )，凍存管B裝有50ul兔波氏桿菌DNA溶液，凍存管C裝有LAMP檢測(cè)體系所用引物混合物，凍存管D裝有Bst DNA聚合酶，凍存管F裝有顯色液優(yōu)選為STOR Green I，凍存管G裝有去離子水。本實(shí)施例試劑盒的檢測(cè)方法，按常規(guī)方法提取待測(cè)樣品基因組DNA，取 μ ，在 LAMP反應(yīng)體系中加入上述引物組4 ul、LAMP反應(yīng)液12. 5 Pl、Bst DNA聚合酶1. 5μ1、混勻， 去離子水調(diào)至25μ1，6 進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，80°C滅活時(shí)間為IOmin后，取3μ1滅活產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余液體產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果，并同時(shí)對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照品的顯色結(jié)果，若顯色結(jié)果一致，而與不加模板陰性樣品不一致，則說(shuō)明待測(cè)樣品中含有兔波氏桿菌；若顯色結(jié)果與陽(yáng)性樣品不一致，與陰性樣品一致，則說(shuō)明待測(cè)樣品中不含有兔波氏桿菌；若待測(cè)樣品、陽(yáng)性樣品、陰性樣品顯色結(jié)果一致，則需重新檢測(cè)。試驗(yàn)例
將兔波氏桿菌參考菌株、分離株單克隆接種于2ml增菌肉湯培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，按常規(guī)方法提取DNA，然后進(jìn)行以下試驗(yàn)
25μ1 兔波氏桿菌 Lamp 反應(yīng)體系FIP μ (1. 8Mmol/L)、BIP μ (1. 8Mmol/L ) F3 μ (0. 3Mmol/L)、B3 μ (0. 3Mmol/L)、Betaine 5μ1 (0. 4mol/L)、MgS04 1. 5μ1 (2.5mmol/L)、Bst DNA 聚合酶 1· 5μ1 (8υ/μ1)、dNTPl. 5μ1 (1. 2mmol/L) Thermopol Buffer :2. 5μ1,模板 μ , ddH20 補(bǔ)至 25μ1。61°C進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，80°C滅活時(shí)間為IOmin后，取3ul滅活產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余液體產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果，結(jié)果顯示二者結(jié)果一致，對(duì)波氏桿菌分離株、陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而沒(méi)加DNA模板的對(duì)照檢測(cè)結(jié)果為陰性。
權(quán)利要求
1.兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)用引物組，其特征在于引物組包括外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT內(nèi)引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG內(nèi)引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。
2.兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，特征在于該試劑盒包含如下組分引物組、陽(yáng)性對(duì)照品、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和顯色液，所述引物組為外引物組 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG外引物組 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT內(nèi)引物組 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG內(nèi)引物組 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，特征在于所述引物組中外引物組對(duì)和內(nèi)引物組對(duì)添加的摩爾比為1 :4 12。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有兔波氏桿菌的基因組DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，特征在于所述的LAMP反應(yīng)液中含有 0.6 1.8 mmol/L dNTP，1. 25 3 mmol/L Mg2+，0. 2 1. 4mol/L Betaine, 2XThermopol Buffer。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，特征在于所述的BstDNA聚合酶和顯色液為市售，顯色液優(yōu)選為S Y B R G r e e nL
7.兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)提供待測(cè)樣品DNA;2)在LAMP反應(yīng)體系中加入權(quán)利要求1所述的引物組、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶，混勻，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后滅活；3)取滅活后部分產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果， 并同時(shí)對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照品的顯色結(jié)果，若顯色結(jié)果一致，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有兔波氏桿菌，若顯色結(jié)果不一致，則說(shuō)明待測(cè)樣品中不含有兔波氏桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述的恒溫反應(yīng)的溫度范圍為60 65 °C，反應(yīng)時(shí)間為50 60min。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述的恒溫反應(yīng)的溫度范圍為61°C，反應(yīng)時(shí)間為50min。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述滅活的溫度為80°C，滅活時(shí)間為IOmin0
全文摘要
本發(fā)明涉及家畜細(xì)菌病的診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)的引物組、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)的引物組，外引物組1如SEQNO1所示，外引物組2如SEQNO2所示，內(nèi)引物組1如SEQNO3所示，內(nèi)引物組2如SEQNO4所示。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了采用上述的引物組的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明所建立的兔波氏桿菌LAMP檢測(cè)方法特異、靈敏、簡(jiǎn)便快捷，約1h內(nèi)可完成，能用于基層臨床樣品的快速檢測(cè)及波氏桿菌的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102399890SQ20111039778
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者劉燕, 季權(quán)安, 李科, 肖琛聞, 韋強(qiáng), 鮑國(guó)連 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院