專利名稱：一種制備轉基因豬精子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種制備轉基因豬精子的方法，特別涉及磁性納米顆粒介導的制備轉基因豬精子的方法。
背景技術：
轉基因技術開始于20世紀80年代，目前，轉基因技術主要有顯微原核注射法，逆轉錄病毒感染法，胚胎干細胞介導法，體細胞核移植技木，精子載體法，胞漿內(nèi)單精子注射法，卵母細胞載體法等。精子載體法是將精子作為外源基因的載體，在受精過程中將外源基因?qū)雱游锱咛?，并使外源DNA整合到染色體中，從而使外源基因進入子代的基因組中目前，應用精子為載體介導基因轉移獲得轉基因動物主要通過以下途徑來實現(xiàn)的體外精子轉染法和體內(nèi)精子轉染法體外精子轉染法又可以分為精子與外源DNA直接共孵育法，體外電穿孔導入法和脂質(zhì)體介導轉染法；體內(nèi)精子轉染法又可以分為輸精管注射轉染法、曲細精管注射轉染法、 睪丸注射轉染法等。1971年，Bracket等首次證實精子具有吸附結合外源DNA能力，并將外源DNA在受精時攜帶進入卵母細胞。1992年，Lavitrano等應用此法得到陽性轉基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)成熟精子頭部具有吸收外源DNA的能力，其吸收區(qū)域是具有特異性的，該區(qū)域位于精子頭部的頂體后區(qū)(post-acrosomal region)，即靠近精核的區(qū)域。沈新明等直接用人巨細胞病毒啟動子調(diào)控的增強型綠色熒光蛋白表達載體注射到小鼠的曲精細管內(nèi)，最后通過與雌鼠交配，成功獲得了表達綠色熒光蛋白的轉基因仔鼠。袁進等報道向通過向曲精細管內(nèi)注射外源DNA，然后再結合對曲精細管電擊或電穿孔處理，以使外源基因進入睪丸生精細胞然后將這些處理的雄鼠與母鼠交配，得到的小鼠中有一組的陽性檢測率達25%。Sien 等則將處理方法更為簡化，首先直接向雄兔睪丸內(nèi)注射攜帯綠色熒光表達的外源DNA及ニ 甲基亞楓的介質(zhì)，使DNA能夠進入睪丸細胞和生精細胞。一個月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產(chǎn)生后代的56%仔兔能高效地表達所導入的外源基因。這ー轉入外源基因的陽性率大大高于以往精子載體法或其他非定點轉基因方法的結果。李碧春等以重組的緑色熒光蛋白基因為標記，首次在家雞上通過采用公雞睪丸內(nèi)轉染精原干細胞(spermatogonial stem cells, SSCs)和體外轉染SSCs再移植的方法成功地生產(chǎn)出了轉基因雞，并且在家鴨和家雞上轉染功能基因進行驗證，結果均說明該方法無需特殊的儀器要求，即可完成轉染外源基因的過程，方法簡單，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生產(chǎn)轉基因雞群，該方法的建立在家禽上意義重大，突破了制約家禽轉基因生產(chǎn)的瓶頸，解決了家禽轉基因難的問題，特別是體外轉染移植的成功，不僅解決了家禽轉基因難的問題，而且為成體干細胞的應用開辟了更廣闊的應用前景。精子載體法中精子孵育前的預處理通常使精子的受精能力下降，于是許多學者嘗試借鑒醫(yī)學上的輔助生殖技術ICSI使處理精子受精，精子胞質(zhì)內(nèi)顯微受精技術是借助顯微操作儀將ー個精子或生精細胞直接注入卵母細胞質(zhì)內(nèi)，從而完成受精的過程。它降低了對精子各種指標的要求，使各種在體內(nèi)外不可能發(fā)生正常受精的卵子受精，同時可以避免多精子受精，也為研究異種間受精提供了有效的途徑1999年。美國科學家Perry等W4] 人首次將ICSI技術應用于動物轉基因領域，成功地獲得了轉基因小鼠隨即，研究者們分別在獼猴豬上也進行ICSI轉基因的嘗試，胚胎轉基因陽性率也很高，然而這些實驗最終并沒有得到出生的轉基因動物2006年，Kurom等把精子與攜帯有人白蛋白(hALB)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的DNA序列片斷共孵化，通過ICSI方法生產(chǎn)的胚胎移植后生產(chǎn)出ー頭含有hALB和GFP基因的轉基因小豬Garc' a-Va' zquez等將豬的精子經(jīng)不同方法處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凍融處理(frozen-thawing，F(xiàn)T)，不加冷凍保護劑速凍處理(quick freezing without cryoprotectant agents, QF)以及用iTriton X-IOO (TX-IOO)處理過的精子與新鮮的精子相比，它們結合外源DNA的能力明顯增強，但其發(fā)育能力降低QF和ΤΧ-100處理精子所造成精子細胞膜的損傷與FT造成的損傷更能促進精子與外源DNA地結合實驗還發(fā)現(xiàn)，用新鮮的精子與用FT和ΤΧ-100處理的精子經(jīng)ICSI發(fā)育的胚胎中，EGFP表達的胚胎陽性率相近(分別為 37. 04士3. 52%,43. 54士5. 41%和 29. 03士8. 29% )，而經(jīng) QF 處理過的精子，EGFP 胚胎的陽性率明顯提高(80. 43士5. 91%)。這表明精子的細胞膜在DNA相互作用中起著至關重要的作用，經(jīng)處理過的精子細胞膜更有利于外源DNA與精子染色體結合，但經(jīng)QF和ΤΧ-100 處理，可能嚴重損傷精子的細胞核，引起DNA破碎，或?qū)е氯旧w的破損，從而對胚胎將來的發(fā)育有害。目前，轉基因技術主要有DNA顯微注射法、胚胎干細胞介導法、逆轉錄病毒載體法、精子載體法等。用這些方法己能有效地將外源基因?qū)氚屑毎麅?nèi)，并獲得了相應的轉基因動物。這些技術的成功運用掲示了生產(chǎn)攜帶有外源DNA的動物是可能的，但是這些基因轉移方法也存在某些局限性。如顯微注射法操作程序復雜、對胚胎損傷大，對技術、設備要求高，特別是在牛羊豬等有開發(fā)應用價值的大型哺乳動物上的低效率(低于)，極大地制約了該技術的應用前景；逆轉錄病毒載體法雖然基因轉移的效率較高，但是基因插入是隨機的，且逆轉錄病毒載體的容量有限，僅能攜帶小于IOKb的外源DNA片段，而且逆轉錄病毒主要感染早期胚胎的活躍分離期細胞，因而獲得的多為嵌合體動物，對于轉基因動物的下游篩選、培育、建系帶來很大的人力、物力、財カ負擔；此外，逆轉錄病毒易將病原體基因序列引入宿主基因組，動物的生物安全性受都到質(zhì)疑。而精子載體法穩(wěn)定性較差，可重復率較低。普通的睪丸注射法由于直接注射載體質(zhì)粒，轉基因效率較低，且結果不穩(wěn)定。精子載體法是將精子作為外源基因的載體，在受精過程中將外源基因?qū)雱游锱咛?，并使外源DNA整合到染色體中，從而使外源基因進入子代的基因組中目前，應用精子為載體介導基因轉移獲得轉基因動物主要通過以下途徑來實現(xiàn)的體外精子轉染法和體內(nèi)精子轉染法體外精子轉染法又可以分為精子與外源DNA直接共孵育法，體外電穿孔導入法和脂質(zhì)體介導轉染法；體內(nèi)精子轉染法又可以分為輸精管注射轉染法、曲細精管注射轉染法、 睪丸注射轉染法等。1971年，Bracket等首次證實精子具有吸附結合外源DNA能力，并將外源DNA在受精時攜帶進入卵母細胞。1992年，Lavitrano等應用此法得到陽性轉基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)成熟精子頭部具有吸收外源DNA的能力，其吸收區(qū)域是具有特異性的，該區(qū)域位于精子頭部的頂體后區(qū)(post-acrosomal region)，即靠近精核的區(qū)域。沈新明等直接用人巨細胞病毒啟動子調(diào)控的增強型綠色熒光蛋白表達載體注射到小鼠的曲精細管內(nèi)，最后通過與雌鼠交配，成功獲得了表達綠色熒光蛋白的轉基因仔鼠。袁進等報道向通過向曲精細管內(nèi)注射外源DNA，然后再結合對曲精細管電擊或電穿孔處理，以使外源基因進入睪丸生精細胞然后將這些處理的雄鼠與母鼠交配，得到的小鼠中有一組的陽性檢測率達25%。Sien 等則將處理方法更為簡化，首先直接向雄兔睪丸內(nèi)注射攜帯綠色熒光表達的外源DNA及ニ 甲基亞楓的介質(zhì)，使DNA能夠進入睪丸細胞和生精細胞。一個月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產(chǎn)生后代的56%仔兔能高效地表達所導入的外源基因。這ー轉入外源基因的陽性率大大高于以往精子載體法或其他非定點轉基因方法的結果。李碧春等以重組的緑色熒光蛋白基因為標記，首次在家雞上通過采用公雞睪丸內(nèi)轉染精原干細胞(spermatogonial stem cells, SSCs)和體外轉染SSCs再移植的方法成功地生產(chǎn)出了轉基因雞，并且在家鴨和家雞上轉染功能基因進行驗證，結果均說明該方法無需特殊的儀器要求，即可完成轉染外源基因的過程，方法簡單，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生產(chǎn)轉基因雞群，該方法的建立在家禽上意義重大，突破了制約家禽轉基因生產(chǎn)的瓶頸，解決了家禽轉基因難的問題，特別是體外轉染移植的成功，不僅解決了家禽轉基因難的問題，而且為成體干細胞的應用開辟了更廣闊的應用前景。精子載體法中精子孵育前的預處理通常使精子的受精能力下降，于是許多學者嘗試借鑒醫(yī)學上的輔助生殖技術ICSI使處理精子受精，精子胞質(zhì)內(nèi)顯微受精技術是借助顯微操作儀將ー個精子或生精細胞直接注入卵母細胞質(zhì)內(nèi)，從而完成受精的過程。它降低了對精子各種指標的要求，使各種在體內(nèi)外不可能發(fā)生正常受精的卵子受精，同時可以避免多精子受精，也為研究異種間受精提供了有效的途徑1999年。美國科學家Perry等W4] 人首次將ICSI技術應用于動物轉基因領域，成功地獲得了轉基因小鼠隨即，研究者們分別在獼猴豬上也進行ICSI轉基因的嘗試，胚胎轉基因陽性率也很高，然而這些實驗最終并沒有得到出生的轉基因動物2006年，Kurom等把精子與攜帯有人白蛋白(hALB)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的DNA序列片斷共孵化，通過ICSI方法生產(chǎn)的胚胎移植后生產(chǎn)出ー頭含有hALB和GFP基因的轉基因小豬Garc' a-Va' zquez等將豬的精子經(jīng)不同方法處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凍融處理(frozen-thawing，F(xiàn)T)，不加冷凍保護劑速凍處理(quick freezing without cryoprotectant agents, QF)以及用iTriton X-IOO (TX-IOO)處理過的精子與新鮮的精子相比，它們結合外源DNA的能力明顯增強，但其發(fā)育能力降低QF和ΤΧ-100處理精子所造成精子細胞膜的損傷與FT造成的損傷更能促進精子與外源DNA地結合實驗還發(fā)現(xiàn)，用新鮮的精子與用FT和ΤΧ-100處理的精子經(jīng)ICSI發(fā)育的胚胎中，EGFP表達的胚胎陽性率相近(分別為 37. 04士3. 52%,43. 54士5. 41%和 29. 03士8. 29% )，而經(jīng) QF 處理過的精子，EGFP 胚胎的陽性率明顯提高(80. 43士5. 91%)。這表明精子的細胞膜在DNA相互作用中起著至關重要的作用，經(jīng)處理過的精子細胞膜更有利于外源DNA與精子染色體結合，但經(jīng)QF和ΤΧ-100 處理，可能嚴重損傷精子的細胞核，引起DNA破碎，或?qū)е氯旧w的破損，從而對胚胎將來的發(fā)育有害。胞漿內(nèi)單精子注射仍需顯微操作，但與原核注射相比技術難度降低很多。另外，對于ー些卵透明度不好的物種(如牛、羊、豬)，ICSI更能體現(xiàn)出技術上的優(yōu)勢；再有，精子注射針的尖端截面積約為顯微注射針的100倍左右，對DNA沒有任何剪切，尤其適合基因組 DNA, BAC或YAC庫DNA大片段操作。同時ICSI法還具有受精率比較高，多精受精率低，排除透明帶和卵質(zhì)膜對精子入卵的阻礙作用、其受精率，不受精子濃度、形態(tài)和活力的影響等一系列優(yōu)點。但通過該方法生產(chǎn)轉基因動物，體外發(fā)育率低，仍許多問題有待解決。綜上所述，現(xiàn)有轉基因技術均存在成本高，投資大，技術要求高，操作復雜，轉基因效率較低等缺點。所以，尋找ー種省吋，省力且效率較高的轉基因方法迫在眉睫。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的在精子載體法基礎上建立起來的，通過對新鮮豬精子轉染外源基因，進而獲得攜帯目的基因的精子，然后通過人工授精，得到轉基因豬，根據(jù)本發(fā)明的技術方案， 選擇特定的孵育時間，特定的濃度配比，能夠大大提高轉基因的效率。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術方案本發(fā)明一方面涉及ー種制備轉基因豬精子的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將新鮮豬精液放置到16_18°C冰箱中平放保存，每7-9個小時輕輕翻轉精子， 防止精子沉淀；(2)每80mL精液里面加入500-700微升磁性納米液體材料和500-700微升的質(zhì)粒載體，輕輕混勻，然后室溫孵育，每15-25min輕輕翻轉1_10次，孵育SO-IOOmin得到轉基因豬斗B子。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，所述的質(zhì)粒載體是pEGFP-Nl-pGH載體，報告基因為EGFP基因-增強型綠色熒光蛋白基因，目的基因為pGH基因-豬生長激素基因。在本發(fā)明的另外ー個優(yōu)選實施方式中，所述的磁性納米顆粒是產(chǎn)品名稱 PolyMAG-1000, PEI修飾的氧化鐵磁性納米顆粒，貨號9003，廠家為Chemicell。本發(fā)明另外一方面還涉及上述轉基因豬精子在制備轉基因豬中的用途，其特征在于將轉基因豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術方式的，例如注射等。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，其特征在于所述的轉基因豬精子是新鮮制備的。本發(fā)明另外一方面還涉及制備轉基因豬的方法，其包括上述轉基因豬精子的制備步驟，其特征在于將攜帯外源基因的豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術方式的。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，上述制備轉基因豬的用途和方法都是非治療目的和/或非診斷目的的。本發(fā)明通過選擇特定的孵育時間和濃度配比，相比于其它時間和濃度配比，能夠顯著的提高轉基因的效率，達到45%左右。
具體實施例方式材料磁性納米顆粒購于Chemicell、產(chǎn)品名稱PolyMAG-1000，PEI修飾的氧化鐵磁性納米顆粒，貨號9003 ；攜帶外源基因的載體質(zhì)粒pEGFP-Nl-pGH載體，報告基因為EGFP 基因-增強型綠色熒光蛋白基因，目的基因為PGH基因-豬生長激素基因。步驟(1)購買新鮮豬精液兩瓶，每瓶80毫升，有效精子數(shù)為30億，每毫升為3. 75千萬精子，然后將精子放置到17°C冰箱中平放保存，每8個小時輕輕翻轉精子，防止精子沉淀；(2)每瓶精液里面加入600微升磁性納米液體材料和600微升的質(zhì)粒載體，輕輕混勻，然后放置在室溫(25°C )孵育，每20min輕輕翻轉幾次。90min后人工授精至發(fā)情的母豬；(3) 114天妊娠后產(chǎn)仔，檢測，轉基因豬出生，待產(chǎn)仔后經(jīng)檢測其基因的表達情況， 檢測綠色熒光蛋白基因的表達，其中在100頭仔豬中有45頭仔豬為陽性轉基因豬，即帶有外源綠色熒光蛋白基因的仔豬占所有仔豬的比例為45%左右。當理解的是，上述具體實施方式
僅僅是舉例性說明，對本領域普通技術人員來說， 可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.ー種制備轉基因豬精子的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將新鮮豬精液放置到16-18°C冰箱中平放保存，每7-9個小時輕輕翻轉精子，防止精子沉淀；(2)每80mL精液里面加入500-700微升聚乙烯亞胺(PEI)包裹的氧化鐵磁性磁性納米顆粒液體材料和500-700微升的濃度為500-800 μ g/ml質(zhì)粒載體，輕輕混勻，然后室溫孵育，每15-25min輕輕翻轉1_10次，孵育SO-IOOmin得到轉基因豬精子。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備轉基因豬精子的方法，所述的質(zhì)粒載體是pEGFP-Nl-pGH 載體。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的制備轉基因豬精子的方法，所述的磁性納米顆粒是 Chemicell 公司生產(chǎn)的 PolyMAG-1000。
4.權利要求1-3任意一項所述的方法制備的轉基因豬精子在制備轉基因豬中的用途， 其特征在于將轉基因豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術方式的。
5.根據(jù)權利要求4所述的用途，其特征在于人工授精是通過注射來實現(xiàn)的。
6.根據(jù)權利要求4所述的用途，其特征在于所述的轉基因豬精子是新鮮制備的。
7.根據(jù)權利要求4-6任意一項所述的用途，制備轉基因豬的用途是非治療目的和/或非診斷目的的。
8.ー種制備轉基因豬的方法，其包括權利要求1-3任意ー項所述的轉基因豬精子的制備方法，其特征在于將轉基因豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術方式的。
9.根據(jù)權利要求8所述的制備轉基因豬的方法，其特征在于人工授精是通過注射來實現(xiàn)的。
10.根據(jù)權利要求8所述的制備轉基因豬的方法，其特征在于所述的轉基因豬精子是新鮮制備的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備轉基因豬精子的方法，通過對新鮮豬精子轉染外源基因，進而獲得攜帶目的基因的轉基因精子，然后通過人工授精，得到轉基因豬。相比于其它方法，通過本發(fā)明的方法，選擇特定的孵育時間和濃度比例，能夠顯著的提高轉基因的效率。
文檔編號C12N15/85GK102559751SQ20111038556
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權日2011年11月29日
發(fā)明者吳明明, 孫金海, 崔海信, 李奎 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學