專利名稱：一種克隆表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種克隆表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的方法，具體涉及一種在大腸桿菌BL21中表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的方法。
背景技術(shù)：
腈水合酶(Nitrilehydratase，簡稱 NHase，EC 4. 2. 1. 84)，是一種催化腈基化合物轉(zhuǎn)變?yōu)轷０坊衔锏慕饘倜?。用這種酶所生產(chǎn)的丙烯酰胺已近百萬噸，占整個(gè)丙烯酰胺產(chǎn)量的三分之一。生物技術(shù)相對于傳統(tǒng)的化學(xué)法有著成本低、能耗少、少污染的優(yōu)勢。目前，在美國、日本、法國等發(fā)達(dá)國家，這項(xiàng)生物技術(shù)正在取代傳統(tǒng)的化學(xué)法。在我國，腈水合酶合成丙烯酰胺的生物技術(shù)雖然起步較晚，但發(fā)展很快，2008年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國生物法生產(chǎn)的丙烯酰胺占整個(gè)丙烯酰胺產(chǎn)量的41%。丙烯酰胺是一種應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)化工原料，在石油開采、造紙、裝潢等方面發(fā)揮著重要的作用。隨著市場的不斷拓展，對丙烯酰胺的需求也在不斷增長。另外這種酶也被應(yīng)用在尼克酰胺的生產(chǎn)上。尼克酰胺是一種B組維生素，以輔酶I及輔酶II的形式參與機(jī)體代謝，在人體和動(dòng)物代謝方面起著十分重要的作用，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品添加劑及飼料生產(chǎn)上。腈水合酶的廣泛應(yīng)用促使科學(xué)工作者開始研究這種金屬酶的合成機(jī)制和催化機(jī)理。腈水合酶按所含金屬離子的不同分為含鐵和含鈷兩種，按基因結(jié)構(gòu)的不同又可以分為四類。雖然它們催化的是同一類化學(xué)反應(yīng)，這幾類酶的合成模式卻不同，這些不同突出表現(xiàn)在金屬離子攝取方式的不同。其中第一類和第二類腈水合酶中鈷離子的攝取機(jī)理已經(jīng)判明，而第三類還沒有報(bào)道，第四類腈水合酶(含鐵型)的相關(guān)結(jié)論也不明確。阻礙探明第三類鈷離子攝取機(jī)理的關(guān)鍵原因就是該類腈水合酶(以惡臭假單胞菌腈水合酶為代表)調(diào)控蛋白目前尚無成功克隆表達(dá)的方法。其原因在于目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調(diào)控基因序列的ORF部分報(bào)道有誤，而且即使正確識(shí)別該調(diào)控蛋白的0RF，該調(diào)控蛋白在SDS-PAGE上也很難檢測到。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種識(shí)別腈水合酶調(diào)控蛋白的開放閱讀框，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述開放閱讀框克隆表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的方法。為解決上述問題，提供技術(shù)方案如下1)從NCBI上下載GenBank號(hào)為U89363. 1的序列并且識(shí)別SEQ ID NO. 1 ；2)在調(diào)控蛋白基因序列前加SD序列(AAGGAG)和His-tag序列；3)將上一步驟中構(gòu)建的序列串聯(lián)在腈水合酶成熟酶下游克隆到pET_Ma(+)，導(dǎo)入大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)；4) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活。本發(fā)明所述腈水合酶基因是來源于惡臭假單胞菌(I^eudomonas put i da)NRRL-18668 ( "A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase，，發(fā)表在 1997 的 Biochemistry)。
本發(fā)明的詳細(xì)的步驟為
(1)獲得正確的調(diào)控蛋白基因序列并識(shí)別正確的ORF
通過查閱惡臭假單胞菌中腈水合酶基因序列設(shè)計(jì)引物分別正確擴(kuò)增成熟酶基因序列和調(diào)控蛋白基因序列。由于目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調(diào)控基因序列的ORF部分報(bào)道有誤(該調(diào)控蛋白基因序列有3種可能的0RF)，而且該調(diào)控蛋白在SDS-PAGE很難檢測到，所以給正確識(shí)別調(diào)控蛋白的ORF增大了難度。通過嘗試各種ORF并且在該調(diào)控蛋白N端加His-tag保護(hù)，對成功表達(dá)出有活性調(diào)控蛋白的0RF，最終確定為正確的調(diào)控蛋白ORF ；
(2)調(diào)控蛋白基因序列N端加His-tag
大腸桿菌BL21中表達(dá)惡臭假單胞菌中天然的腈水合酶全序列，國際上已多有報(bào)道其調(diào)控蛋白不能成功表達(dá)，通過在調(diào)控蛋白基因序列N端加His-tag，可成功表達(dá)調(diào)控蛋白；
(3)重疊PCR串聯(lián)腈水合酶成熟酶與調(diào)控蛋白基因序列
通過重疊PCR將腈水合酶N端加有His-tag的調(diào)控蛋白基因序列串聯(lián)在成熟酶基因序列下游；
(4)克隆到pET_Ma(+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21中表達(dá)
將上一步驟中構(gòu)建的腈水合酶全序列克隆到pET_Ma(+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)；
(5) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活
腈水合酶HPLC檢測條件流動(dòng)相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱采用 C18 柱；
(6)腈水合酶調(diào)控蛋白N端測序
將表達(dá)出來的蛋白過鎳柱純化后N端測序，測序結(jié)果(見附圖幻為His-tag對應(yīng)序列，而這個(gè)His-tag是我們?nèi)藶樘砑拥?，這就說明該蛋白就是腈水合酶調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步解析腈水合酶金屬離子攝取機(jī)理和改進(jìn)腈水合酶的工業(yè)化生產(chǎn)工藝打下良好的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種克隆表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的方法，該方法能在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白。
圖1.腈水合酶全基因PCR
1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、腈水合酶全基因PCR(調(diào)控蛋白基因N端加His-tag)。
圖2.腈水合酶表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖
1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、(含pET_Ma(+)和腈水合酶基因全序列其中調(diào)控蛋白N端加His-tag)全細(xì)胞。
圖3.腈水合酶調(diào)控蛋白純化后N端測序圖
具體實(shí)施例方式
材料和檢測方法
菌種為惡臭假單胞菌(I^seudomonasputic^NRRL-lSeeS，相關(guān)文獻(xiàn)"A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase，，發(fā)表在 1997 的 Biochemistry上。腈水合酶HPLC檢測條件流動(dòng)相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18柱。實(shí)施例11)獲得正確的調(diào)控蛋白基因序列并識(shí)別正確的ORF通過查閱惡臭假單胞菌中腈水合酶基因序列設(shè)計(jì)引物分別正確擴(kuò)增成熟酶基因序列和調(diào)控蛋白基因序列。由于目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調(diào)控基因序列的ORF部分報(bào)道有誤(該調(diào)控蛋白基因序列有3種可能的0RF)，而且該調(diào)控蛋白在SDS-PAGE很難檢測到，所以給正確識(shí)別調(diào)控蛋白的ORF增大了難度。通過嘗試各種ORF并且在該調(diào)控蛋白N端加His-tag保護(hù)，對成功表達(dá)出有活性調(diào)控蛋白的0RF，最終確定為正確的調(diào)控蛋白ORF ；2)調(diào)控蛋白基因序列N端加His-tag大腸桿菌BL21中表達(dá)惡臭假單胞菌中天然的腈水合酶全序列，國際上已多有報(bào)道調(diào)控蛋白不能成功表達(dá)，通過在調(diào)控蛋白基因序列N端加His-tag，可成功表達(dá)調(diào)控蛋白；3)重疊PCR串聯(lián)腈水合酶成熟酶與調(diào)控蛋白基因序列通過重疊PCR將腈水合酶N端加有His-tag的調(diào)控蛋白基因序列串聯(lián)在成熟酶基因序列下游；4)克隆到pET_Ma(+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21中表達(dá)將上一步驟中的腈水合酶全序列克隆到pET_Ma(+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)；5) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活腈水合酶HPLC檢測條件流動(dòng)相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱采用 C18 柱；6)腈水合酶調(diào)控蛋白N端測序?qū)⒈磉_(dá)出來的蛋白過鎳柱純化后N端測序，測序結(jié)果(見附圖3)為His-tag對應(yīng)序列，而這個(gè)His-tag是我們?nèi)藶樘砑拥模@就說明該蛋白就是腈水合酶調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步解析腈水合酶金屬離子攝取機(jī)理和改進(jìn)腈水合酶的工業(yè)化生產(chǎn)工藝打下良好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種識(shí)別腈水合酶調(diào)控蛋白的開放閱讀框，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
2.一種克隆表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的方法，是在權(quán)利要求1所述開放閱讀框前端加SD 序列和His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯(lián)，在大腸桿菌BL21中共表達(dá)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述腈水合酶基因序列來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，構(gòu)建pUC19-AB(his-tag)P克隆載體和 pET-24a(+) -AB (his-tag)P 表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)宿主菌為大腸桿菌BL21。
6.如權(quán)利要求2-5所述的任一方法，其特征在于，所述表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基為1.2%胰蛋白胨，2.4(%酵母提取物，0.4(%甘油，1711111^2 04， 72mMK2HP04。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克隆表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白的方法，是采用在腈水合酶調(diào)控蛋白基因序列N端加His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯(lián)，在大腸桿菌BL21中共表達(dá)，屬于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法操作簡單，具有較高的效率和成功率。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102492697SQ201110384089
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者劉義, 周哲敏, 崔文璟 申請人:江南大學(xué)