專利名稱：一種dahp合酶的異源可溶性表達方法及其重組載體和基因工程菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種在大腸桿菌中異源表達可溶性的由珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma pretiosun) aroF基因編碼的DAHP合酶的方法及其重組載體和基因工程菌。
背景技術：
美登素(Maytansinoid)是1972年首先從衛(wèi)矛科植物美登木(Maytenus hookeri Loes)中分離得到的抗癌化合物。安莎霉素(Ansamitocin)是珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)來源的美登素衍生物，多達二十幾種，臨床藥理實驗表明該類化合物具有治療白血病和肺癌的作用。安莎霉素是在起始單位3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)和延伸單位2_甲氧基丙二酰ACP (2-methoxymalonyl-ACP)作用下通過一系列的鏈起始、延伸和終止合成碳骨架，再經(jīng)過一系列的后修飾合成安莎霉素。安莎類化合物的生理活性非常強，目前人們正在努力將它們開發(fā)為臨床上有用的抗癌藥物，例如將美登素或其衍生物與以腫瘤細胞為靶點的抗生素結合制成導彈藥物。莽草酸途徑是合成芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的重要途徑，它的起始物質為戊糖代謝的中間產(chǎn)物赤蘚糖-4-磷酸(erythosd-phosphate， E4P)和糖酵解過程的一個中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，二者在DAHP合酶的作用下縮合形成一個七碳酮糖開鏈磷酸化合物，稱為3-脫氧- α -阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，即DAHP，再經(jīng)脫磷酸環(huán)化，形成苯環(huán)后通過脫水、加氫形成莽草酸 (shikimate)。在可以產(chǎn)生利福平素B的菌株Amycolatopsis mediterranei S66中發(fā)現(xiàn)了另一種特殊的莽草酸途徑即氨基莽草酸途徑(aminoshikimate pattway)，它在其早期階段與莽草酸生物合成途徑平行，在合成代謝過程中有氨基摻入，并在氨基DAHP合酶的作用下形成AHBA。目前，在已經(jīng)公布的珍貴橙色束絲放線菌(A. pretiosum)的安莎合成基因簇的基因中尚未發(fā)現(xiàn)氨基DAHP合酶(amino-DAHP合酶)的基因，因此，莽草酸途徑和氨基莽草酸途徑的第一分歧DAHP合酶和氨基DAHP合酶的差異是否存在值得質疑。另外，一些有趣的問題例如DAHP合酶是否同時發(fā)揮著氨基DAHP合酶的作用以及amino-DAHP中的氨基基團是怎樣引入的等都值得我們進一步深入探討。DAHP合酶的進一步研究和應用有許多問題尚待解決。DAHP合酶的異源可溶性表達是解決這些問題的關鍵一環(huán)，但是目前還未能實現(xiàn) DAHP合酶的異源可溶性表達，不能大量獲得具有酶活性的DAHP合酶。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是針對目前某些外源基因如珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynenma pretiosun) aroF基因編碼的DAHP合酶無法實現(xiàn)異源可溶性表達的現(xiàn)狀， 提供一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達的方法及其所用的重組載體和表達菌株以及重組蛋白的純化和檢測方法。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下本發(fā)明的技術方案之一是一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達的方法，包括以下步驟，構建表達重組外源蛋白的表達載體，該重組表達載體與表達分子伴侶 GroEL/GroES的載體共同轉入大腸桿菌表達菌株中從而獲得可溶性表達外源蛋白的大腸桿菌基因表達工程菌，進行共表達。本發(fā)明中，所述的外源蛋白是常規(guī)蛋白，優(yōu)選來自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶。所述的DAHP合酶優(yōu)選氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的外源蛋白的編碼基因可以是常規(guī)，優(yōu)選來自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)中編碼DAHP合酶的aroF基因。所述的aroF基因優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)是常規(guī)，優(yōu)選珍貴橙色束絲放線菌(A. pretiosum)ATCC 31565。本發(fā)明中，所述的表達分子伴侶GroEL/GroES的載體是常規(guī)，只要能夠在大腸桿菌中表達分子伴侶GroEL和GroES即可，優(yōu)選pGro7質粒。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌表達菌株是常規(guī)的大腸桿菌表達菌株，優(yōu)選E. COli BL21(DE3)。本發(fā)明中，所述的重組外源蛋白帶有His-tag標簽或者其他的純化標簽，也可以不帶純化標簽，本發(fā)明優(yōu)選帶有His-tag標簽，便于重組蛋白表達后的分離純化。本發(fā)明中，所述的表達重組外源蛋白的表達載體優(yōu)選在大腸桿菌中誘導表達的質粒，如IPTG誘導表達。較佳的，該表達重組外源蛋白的表達載體具有強啟動子。強啟動子可以使外源蛋白高效表達。更佳的，該表達重組外源蛋白的表達載體優(yōu)選質粒pET28a。質粒pET28a插入的外源蛋白基因具有強啟動子，可以進行高表達。質粒pET28a還使表達的外源蛋白具有His-tag標簽，便于后續(xù)的分離純化，并且是IPTG誘導的。本發(fā)明的技術方案之二是一種重組表達載體，其含有來自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)巾IS石馬 DAHP 白勺 aroF 。本發(fā)明中，所述的重組表達載體較佳的具有強啟動子。優(yōu)選的，所述的重組表達載體中具有使表達的外源蛋白具有His-tag標簽的序列。該表達載體骨架可以是常規(guī)表達載體，優(yōu)選質粒pEI^8a，從而形成重組表達載體pET28-aroF。質粒pET28a具有強啟動子和 His-tag標簽，從而可以使aroF基因高效表達和方便后續(xù)的分離純化。本發(fā)明中，所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶的aroF基因是常規(guī)，優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明中，所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶是常規(guī)，優(yōu)選氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。本發(fā)明中，所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)是常規(guī)，優(yōu)選珍貴橙色束絲放線菌(A. pretiosum) ATCC 31565。本發(fā)明的技術方案之三是一種大腸桿菌基因表達工程菌，其同時包含表達分子伴侶蛋白GroEL/GroES的載體和本發(fā)明所述的含有來自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)中編碼DAHP合酶的aroF基因的重組表達載體。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌基因表達工程菌的宿主細胞是常規(guī)的大腸桿菌表達菌株，優(yōu)選大腸桿菌E. coli BL21(DE3)。本發(fā)明中，所述的表達分子伴侶蛋白GroEL/GroES的載體是常規(guī)的能夠在大腸桿菌中共表達分子伴侶蛋白GroEL和GroES的載體，優(yōu)選pGro7質粒。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌基因表達工程菌最優(yōu)選大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/ pGro7/pET28-aroF。本發(fā)明的技術方案之四是一種制備重組珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶的方法， 包括以下步驟，培養(yǎng)所述的大腸桿菌基因表達工程菌，從培養(yǎng)物中獲得重組珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌基因表達工程菌的培養(yǎng)方法是常規(guī)方法，在常規(guī)的大腸桿菌培養(yǎng)基中，在常規(guī)的溫度、PH值條件下進行培養(yǎng)。較佳的，所述的培養(yǎng)方法包括將大腸桿菌基因表達工程菌培養(yǎng)至0D600達0. 4-0. 6時，加入IPTG誘導表達。更佳的，將所述的大腸桿菌基因表達工程菌(優(yōu)選E. coliBL21 (DE3) /pGro7/pET28-aroF)加入含有IOOmg/ L卡那霉素和100mg/L氯霉素并添加了 2g/L L-阿拉伯糖的液體LB培養(yǎng)基中，在220rpm、 37°C條件下培養(yǎng)至0D600達0. 4-0. 6。誘導表達的條件較佳的是IPTG終濃度為ImM，溫度為30°C，轉速為160rpm，誘導表達11小時。本發(fā)明的技術方案之五是一種所述的大腸桿菌基因表達工程菌表達的重組 DAHP合酶的純化方法，包括如下步驟1)將所述的大腸桿菌基因表達工程菌菌體用PBS緩沖液洗滌，加入結合緩沖液， 超聲破碎，破碎條件為每15ml超聲99次，超k，停9s，功率為200W ；2)將步驟1)所得超聲破碎后的菌體在12000rpm，4°C條件下離心25min，取其上清加入終濃度為IOmM的咪唑；3)將步驟2)所得混合液上樣，先用含20mM咪唑的洗滌緩沖液洗滌，最終用含 200mM咪唑的洗脫緩沖液收集洗脫的目的蛋白，收集的洗脫液用超濾離心管進行超濾離心濃縮。本發(fā)明的技術方案之六是一種DAHP合酶酶活性的檢測方法，包括如下步驟1)準備75 μ 1的反應體系，其包括7. 5μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和 1. 5 μ 1 1. 5mM的4-磷酸赤蘚糖(E4P)，DAHP合酶酶液，并加入終濃度為IOOmM的MnSO4,余為 Tris-HCKpH 7. 5)補齊；2)將步驟1)所準備的反應體系置于30°C條件下反應lOmin，加入100 μ 1的40% (wt/vol)三氯乙酸終止酶反應，之后加入25μ 1的IOOmM高碘酸鉀到混合液中，在37°C下反應30min ；3)向步驟2)所得混合液中加入25 μ 1 8% (wt/vol)的Na2SO3以消除多余的氧化劑并加入175 μ 1 2. 16% (wt/vol)的硫代巴比妥酸后，金屬浴100°C條件下煮沸IOmin ；4)將步驟幻所得混合液加入管子冷卻至室溫，離心后取上清200 μ 1置于微量比色皿，在UV-1800分光光度計中讀取在549nm處的光吸收值。本發(fā)明中，所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25 °C。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。本發(fā)明實現(xiàn)了 DAHP合酶的異源可溶性表達表達，具有重要意義。可以為下述實驗的開展奠定基礎
(1)實現(xiàn)體外添加外源氮源來確定是否會形成amino-DAHP ；(2)進一步進行DAHP合酶的酶學性質的研究；(3)為最終實現(xiàn)AHBA的異源表達提供了可能性。這對于合成生物學和產(chǎn)生以AHBA為前體的抗體類的基因工程菌的構建起到了促進作用，最終將促進臨床抗癌藥物的研發(fā)，從而造福人類健康。
以下結合
本發(fā)明的特征和有益效果。應理解，下列附圖僅用于說明本發(fā)明的具體實施方案而不用于限定本發(fā)明的范圍。圖1為構建表達載體pET28-aroF的過程示意圖。圖2為所構建的可溶性表達DAHP合酶的共表達系統(tǒng)圖。圖3為DAHP合酶酶活性檢測流程圖。圖4(a)為提取得到的A.pretiosum基因組DNA的電泳圖，圖4 (b)為通過PCR得到的 A. pretiosum 的 aroF 基因片段電泳圖。其中，M =DNAMaker III ；1 :A. pretiosum 的基因組 DNA ；2 =PCR 擴增的 A. pretiosum 的 aroF 基因。圖5為重組子pGEM-aroF的雙酶切驗證圖。其中，M :DNA maker III ；1 :pGEM/Nde I，EcoR I；2 :pGEM-aroF/Nde I，EcoR I。圖6為重組子pET28_aroF的雙酶切驗證圖。其中，M =DNA maker III ；1 :pET28a/ Nde I，EcoR I ；2 :pET28_aroF/Nde I，EcoR I。圖7為DAHP合酶在大腸桿菌中的異源表達以及分離純化的蛋白電泳圖。其中， DAHPS 的大小為 50. 2kDa。M =Protein marker SM1881 ；1 未誘導的 BL21 (DE3) /pGro7/ pET28a細胞裂解液；2 加入IPTG誘導培養(yǎng)的BL21 (DE3) /pGro7/pET28-aroF細胞裂解液； 3 通過histrap柱子純化的DAHP合成酶。
具體實施例方式大腸桿菌表達系統(tǒng)是異源表達的首選表達系統(tǒng)，但是由于蛋白的可溶性以及蛋白在合成過程中的折疊不正確等因素極易形成包涵體。雖然包涵體便于分離純化，但是其必須經(jīng)過體外變性、復性才能獲得生物活性。該過程極其復雜且效率低下。為了異源表達珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma pretiosun)aroF基因，得到可溶表達的由其編碼的DAHP 合酶，本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和反復的試驗，發(fā)現(xiàn)將該aroF基因和分子伴侶共表達時， 可以獲得可溶表達的有活性的DAHP合酶。在大腸桿菌中，轉入分別單獨表達DAHP合酶和分子伴侶GroEL/GroES的載體，進行誘導表達，實現(xiàn)了 DAHP合酶的可溶性表達，具有優(yōu)良的效果。同時，為了得到純化的酶，本發(fā)明人構建的重組DAHP合酶含有his-tag標簽，對其用簡單親和吸附柱分離的方法進行純化，從而得到純度較高的適應于酶學性質研究的DAHP 合酶的純酶。大腸桿菌表達系統(tǒng)盡管大腸桿菌有眾多的優(yōu)點，但并非每一種基因都能在其中有效表達。這歸因于每種基因都有其獨特的結構、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、蛋白質折疊的難易程度、宿主細胞蛋白酶對蛋白質的降解、外源基因和E. coli在密碼子利用上的主要差別以及蛋白質對宿主的潛在毒性等等。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌并不能簡單表達來自珍貴橙色束絲放線菌aroF基因，得到具有活性的DAHP合酶。而利用和分子伴侶的共表達則可以達到表達有活性的DAHP合酶的目的。表達DAHP合酶的基因在植物和微生物中，赤蘚糖-4-磷酸(erythose-4-phosphate)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在DAHP合酶作用下縮合形成DAHP，DAHP在氨基DAHP合酶的作用下形成AHBA。以 AHBA為起始單位，最終合成安莎霉素。為了實現(xiàn)DAHP合酶的大腸桿菌表達，本發(fā)明選擇來自珍貴橙色束絲放線菌的編碼DAHP合酶的aroF基因為外源基因，該基因的體外表達對研究珍貴橙色束絲放線菌合成AHBA的途徑具有重要意義。aroF 基因珍貴橙色束絲放線菌中編碼DAHP合酶的基因是aroF基因。本發(fā)明中的aroF基因優(yōu)選來源于珍貴橙色束絲放線菌ATCC 31565。將上述基因從珍貴橙色束絲放線菌中分離出來以后插入可以轉化大腸桿菌的表達載體中，即得到了本發(fā)明的目的載體。本發(fā)明的一具體實例根據(jù)已報導的A. pretiosum的aroF基因(GenBank AF056968. 1)信息設計引物，通過pCR擴增A. pretiosum基因組中的aroF基因片段，然后通過T-A克隆連接到pGEM表達載體上進行片段富集后進行雙酶切，膠回收目標片段后連接到 pET28a載體上。分子伴侶有效的蛋白質翻譯后折疊、多肽裝配成寡聚體結構以及蛋白質的轉位都是由一種被稱為分子伴侶的專職蛋白來介導的，這個觀點在目前已經(jīng)達成共識。分子伴侶是一類促進蛋白折疊的蛋白。利用分子伴侶在E. coli中進行基因高效表達成為近來研究的熱點。但是，利用分子伴侶所得到的實驗結果并不一致，而且迄今為止，伴侶分子的共表達對基因表達的影響似乎都具有蛋白質特異性。大腸桿菌細胞內(nèi)蛋白的折疊主要由兩個分子伴侶系統(tǒng)負責系統(tǒng)I主要含有3個分子伴侶蛋白DnaK、DnaJ和GrpE，DnaK與新合成的蛋白質結合， DnaJ和GrpE是輔助分子伴侶。系統(tǒng)II包括GroEL和GroES，GroEL是分子伴侶，而GroES 是輔助分子伴侶。分子伴侶能增加一些外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達量。本發(fā)明優(yōu)選分子伴侶蛋白GroEL和GroES。本發(fā)明優(yōu)選表達分子伴侶蛋白GroEL 和GroES的載體和表達本發(fā)明目的蛋白的載體共轉化大腸桿菌。本發(fā)明中所述的表達分子伴侶GroEL/GroES的載體是指該載體可以表達GroEL和GroES兩種蛋白。表達分子伴侶蛋白GroEL和GroES的載體可以將GroEL和GroES的表達盒插入載體中制備而得，也可以采用現(xiàn)有技術，如Takara公司生產(chǎn)的表達分子伴侶蛋白GroEL/GroES的pGro7質粒。本發(fā)明將表達目的蛋白的重組載體轉化進已含有可以表達分子伴侶蛋白GroEL/ GroES的pGro7質粒的大腸桿菌DE3(BL21)中培養(yǎng)至0D600達到0. 4-0. 6時加入IPTG在 30°C下進行誘導表達，表達Ilh后可得到可溶性的具有酶活性的DAHP合成酶。重組表達產(chǎn)物的分離純化本發(fā)明可以采用現(xiàn)有的任何大腸桿菌中外源蛋白的分離純化方法，較佳的采用親和層析法。本發(fā)明在表達的重組外源DAHP合酶上連接his-Tag標簽。用his-Tag標簽分離純化，純化速度快，純化產(chǎn)物酶活性高。本發(fā)明收集誘導表達的菌體，加入裂解緩沖液進行超聲裂解，離心取上清，過histrap(GE health)進行分離純化，收集洗脫液，并對洗脫液進行超濾離心濃縮以收集其中的蛋白。酶活檢測本發(fā)明對重組表達的DAHP合酶的酶活檢測可以采用現(xiàn)有技術。較佳的，本發(fā)明選用本發(fā)明優(yōu)化的檢測方法。本發(fā)明優(yōu)化的DAHP合酶催化反應中，反應體系包括適量的DAHP酶液，7. 5μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1. 5 μ 1 1. 5mM的4-磷酸赤蘚糖(E4P)，并加入終濃度為 IOOmM 的 MnSO4,其余部分用 Tris-HCl (pH7. 5)補齊。該催化反應的產(chǎn)物是DAHP。DAHP被高碘酸鉀氧化后的產(chǎn)物可以與硫代巴比妥酸反應產(chǎn)生粉紅色吸收團，該粉紅色吸收團在M9nm處有特異性吸收值。因此，通過檢測該反應在549nm處的光吸收值可以確定DAHP的產(chǎn)生量，從而確定酶活性。本發(fā)明在不改變測量精度的情況下縮小了每一步所用溶液體積，從而減少昂貴底物PEP和E4P的使用量。以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》中所述的條件進行。實施例1可溶共表達表達系統(tǒng)的構建1. 1重組質粒載體pET28_aroF的構建重組載體pET28-ar0F的構建流程如圖1所示提取珍貴橙色束絲放線菌 (A. pretiosum)ATCC 31565的全基因組DNA(見圖4(a))，以其為模版，設計引物，利用該引物進行PCR擴增aroF基因片段(見圖4 (b))。根據(jù)已報導的A. pretiosum的aroF基因(GenBank :AF056968. 1)信息設計引物， 所設引物如下5 ‘ -TCACATATGAACTGGACCGTGGACGT-3 ‘(正向引物，引入 Nde I 限制性酶切位占),
/、、、 / 75' -TATGAATTCTCAGGAGCGGAGCATCTCCGCCACC-3'(反向引物，引入EcoR I 限制性酶切位點)?；厥誔CR產(chǎn)物，如圖1所示用T4連接酶連接到載體PGEM(Takara)從而得到重組質粒pGEM-aroF。用Nde I，EcoR I雙酶切重組質粒pGEM_aroF，膠回收其中約為1. 41Λ的 DNA片段與已經(jīng)用同樣的酶雙酶切的載體pET28a進行連接過夜后從而得到重組的表達載體pET28-aroF。在此過程中構建的pGEM-aroF和pET28_aroF都經(jīng)過雙酶切驗證，見圖5和圖6，經(jīng)測序驗證與GenBank :AF056968. 1中aroF基因序列相同。1. 2將重組質粒pET28-aroF導入表達菌株并與分子伴侶質粒pGro7實現(xiàn)共表達。共表達系統(tǒng)如圖2所示，把構建的重組子和分子伴侶質粒pGro7共同轉化到 E. coli BL2KDE3)中進行共表達。其過程是先把購自Takara公司的表達分子伴侶蛋白 GroES/GroEL的pGro7質粒(購于Takara公司)轉入感受態(tài)E. coli BL21 (DE3)(購買自 novagen公司)中，培養(yǎng)制備成感受態(tài)細胞，再將已經(jīng)構建好的重組質粒pET28-aroF轉入該感受態(tài)細胞中，從而構建成共表達系統(tǒng)E. coli BL21 (DE3)/pGro7/pEI^8-aroF。1. 3DAHP合酶的表達及純化
①表達將上述構建好的共表達體系E. coli BL21 (DE3) /pGro7/pET28-aroF菌體加入含有100mg/L卡那霉素和100mg/L氯霉素并添加了 2g/L L-阿拉伯糖的液體LB培養(yǎng)基中，在220rpm、37°C條件下培養(yǎng)至0D600達0. 4-0. 6時加入終濃度為ImM的IPTG誘導表達llh，并將溫度下調為30°C，轉速調為160rpm。②純化為了保持DAHP合酶的活性，所有純化操作盡量在冰上進行。收集上述誘導表達Ilh的菌體，用PBS緩沖液洗滌3次菌體后加入結合緩沖液(參照histrapFF crude GE health的說明書)，超聲破碎，破碎條件為每15ml超聲99次，超k，停9s，功率為200W。 將破碎后的菌體在12000rpm，4°C下離心25min，取其上清(即粗裂解液)加入終濃度為 IOmM的咪唑。參照histrapFF crude GE health說明書的步驟進行上樣，收集穿出液，先用含20mM咪唑的洗滌緩沖液洗滌，然后用含200mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫并收集最終洗下的蛋白。收集的洗脫液用超濾離心管(購于millipore)進行超濾離心和濃縮，同時把緩沖液更換為Tris-HCl (pH7. 5)，以便于進行之后的酶活性檢測。 實施例2DAHP合酶酶活性的檢測DAHP合酶的活性檢測采用的是檢測產(chǎn)物DAHP的產(chǎn)生量法。利用生成的產(chǎn)物 DAHP被高碘酸鉀氧化后的產(chǎn)物可以與硫代巴比妥酸反應產(chǎn)生粉紅色吸收團的原理對生成產(chǎn)物進行檢測，該粉紅色吸收團在M9nm處有特異性吸收值，其中光吸收系數(shù)為ε =4. 5 X IO4M-1CiT1tj IU定義為在30°C下，每分鐘產(chǎn)生Ιμπιο DAHP所消耗的酶量。這禾中方法在文獻中已有 艮導(Liu, Y, et al. , Corynebacterium glutamicum contains 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthases that display novel biochemical features. Applied and environmental microbiology,2008.74(17) p. M97-550;3)，本發(fā)明對其進行了改良，從而更方便于檢測和節(jié)省昂貴底物(見圖幻。其中75 μ 1的反應體系為7. 5 μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1. 5 μ 1 1. 5mM的赤蘚糖-4-磷酸(E4P)，適量的DAHP酶液，并加入終濃度為IOOmM MnSO4,其余部分用Tris-HCl pH 7. 5補齊。蛋白質檢測采用Bradford法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白(BSA)作為標準對照。DAHP合酶在整個純化過程中的粗裂解液、穿出液及最終得到的純化酶的蛋白含量、酶活、比酶活以及純化效率的檢測結果如下表所示
權利要求
1.一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達的方法，其特征在于，其包括以下步驟， 構建表達重組外源蛋白的表達載體，該重組表達載體與表達分子伴侶GroEL/GroES的載體共同轉入大腸桿菌表達菌株中從而獲得可溶性表達外源蛋白的大腸桿菌基因表達工程菌， 進行共表達。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白是來自珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)的 DAHP 合酶。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表達分子伴侶GroEL/GroES的載體為 pGro7質粒。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表達重組外源蛋白的表達載體是質粒 pED8a。
5.一種重組表達載體，其特征在于，其含有來自珍貴橙色束絲放線菌中編碼DAHP合酶的aroF基因。
6.一種大腸桿菌基因表達工程菌，其特征在于，其同時包含表達分子伴侶蛋白GroEL/ GroES的載體和如權利要求5所述的重組表達載體。
7.一種制備重組珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶的方法，其特征在于，其包括以下步驟培養(yǎng)權利要求6所述的大腸桿菌基因表達工程菌，從培養(yǎng)物中獲得重組珍貴橙色束絲放線菌的DAHP合酶。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)方法包括將權利要求6所述的大腸桿菌基因表達工程菌培養(yǎng)至0D600達0. 4-0. 6，加入IPTG誘導表達。
9.一種如權利要求6所述的大腸桿菌基因表達工程菌表達的重組DAHP合酶的純化方法，其特征在于，其包括如下步驟1)將如權利要求6所述的大腸桿菌基因表達工程菌菌體，用PBS緩沖液洗滌，加入結合緩沖液，超聲破碎，破碎條件為每15ml超聲99次，超k，停9s，功率為200W ；2)步驟1)所得超聲破碎后的菌體在12000rpm，4°C條件下離心25min，取其上清加入終濃度為IOmM的咪唑；3)將步驟2)所得混合液上樣，先用含20mM咪唑的洗滌緩沖液洗滌，最終用含200mM咪唑的洗脫緩沖液收集洗脫的目的蛋白，收集的洗脫液用超濾離心管進行超濾離心濃縮。
10.一種DAHP合酶酶活性的檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟1)準備75μ 1的反應體系，其包括7. 5 μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1. 5 μ 1 1. 5mM的4-磷酸赤蘚糖(E4P)，DAHP合酶酶液，并加入終濃度為IOOmM的MnSO4,其余為 Tris-HCKpH 7. 5)補齊；2)將步驟1)所準備的反應體系置于30°C條件下反應lOmin，加入100μ 1的40% (wt/ vol)三氯乙酸終止酶反應，之后加入25μ 1的IOOmM高碘酸鉀到混合液中，在37°C下反應 30min ；3)向步驟2)所得混合液中加入25μ 1 8% (wt/vol)的Na2SO3以消除多余的氧化劑并加入175 μ 1 2. 16% (wt/vol)的硫代巴比妥酸后，金屬浴100°C條件下煮沸IOmin ；4)將步驟幻所得混合液加入管子冷卻至室溫，離心后取上清200μ 1置于微量比色皿， 在UV-1800分光光度計中讀取在549nm處的光吸收值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma pretiosun)aroF基因編碼的DAHP合酶的異源可溶性表達方法及所用的重組載體和基因表達工程菌。該方法通過將aroF基因連接到表達載體上形成重組表達載體，并將之轉化到已含有編碼分子伴侶蛋白GroEL/GroES的質粒pGro7的大腸桿菌中，誘導表達后可得到可溶性的具有酶活性的DAHP合酶，之后進行分離純化和酶活檢測。本發(fā)明首次實現(xiàn)了珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶的異源可溶性表達并得到純化的DAHP合酶；分離純化和酶活檢測的方法較之前有了較大改進。本發(fā)明對于研究珍貴橙色束絲放線菌(A.pretiosum)的莽草酸合成途徑和氨基莽草酸途徑有著重要意義。
文檔編號C12R1/19GK102505023SQ20111036896
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權日2011年11月18日
發(fā)明者劉念念, 周燕, 張婕, 李婷蘭, 花強, 范宇翔, 韋柳靜, 馬娜 申請人:華東理工大學