專利名稱：一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)放線菌素中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)放線菌素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是一種非常古老的疾病，伴隨著整個人類發(fā)展的歷史，嚴重威脅著人類的健康與生命。放線菌素能夠通過影響核酸合成、誘導(dǎo)細胞分化、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制一些蛋白酶活性及影響細胞周期等方式發(fā)揮其抗腫瘤活性。放線菌素還可通過與DNA結(jié)合抑制RNA 合成而發(fā)揮抗菌、抗病毒的作用。放線菌素D已經(jīng)成為較為理想的抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療、 結(jié)合手術(shù)治療和放射治療，對腎母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤、霍奇金病、絨毛膜癌及睪丸腫瘤的治療有效，尤其是對兒童腎母細胞瘤有很好的治療效果，也常與其他藥物聯(lián)合用于腫瘤的治療與研究。放線菌素)(2除了更好的抗腫瘤作用外，對病毒性心肌炎最常見的病原體柯薩奇病毒(CVB3)有顯著地抑制作用。上世紀后期人們開始對放線菌素進行深入研究，主要集中于放線菌素的生物學(xué)功能和臨床藥理學(xué)研究，目前放線菌素已不僅是臨床上重要的抗腫瘤藥物，也越來越成為分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的工具。放線菌素的產(chǎn)生菌已見報道的有近30種，但基本上都是單一成分高產(chǎn)，且在這些產(chǎn)生菌中，放線菌素D的產(chǎn)量最高為野生菌株0. 21mg/ml、誘變菌株0. 85mg/ml，放線菌素\ 的最高產(chǎn)量為0. 15mg/ml。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)放線菌素中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )MS449，已于2011年11月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. M52。本發(fā)明還保護所述鏈霉菌MS449在生產(chǎn)放線菌素中的應(yīng)用。所述放線菌素可為放線菌素&、放線菌素D和放線菌素中的至少一種。本發(fā)明還保護一種種子培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將20-30g可溶性淀粉、0. 2-0. 6g L-天冬酰胺、0. 5-1. Og KNO3>0. 2-0. 6g K2HPO4 · H20,0. 2-0. 6gNaCl 和 0.2-1. Og MgSO4 ·7Η20用水定容至1L。所述種子培養(yǎng)基的ρΗ可為7. 0-7. 5。所述種子培養(yǎng)基具體可通過如下方法制備得到將25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KN03、0.4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 用水定容至 IL0本發(fā)明還保護一種發(fā)酵培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3-(N-嗎啉基)丙磺酸用水定容至1L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH可為7. 0-7. 5。所述發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基具體可通過如下方法制備得到將IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g 3-(N-嗎啉基)丙磺酸用水定容至1L。本發(fā)明還保護一種制備放線菌素的方法，是發(fā)酵所述鏈霉菌MS449，得到放線菌素。所述發(fā)酵的條件具體可為25-301、140-200印111、6-20天(如6-15天)。所述發(fā)酵的條件具體可為、180rpm、15天。所述方法具體可包括如下步驟將所述鏈霉菌MS449的種子液接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵并收獲發(fā)酵液。所述方法中，可將5ml所述種子液接種至IOOml所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述種子液具體可通過如下方法制備將所述鏈霉菌MS449接種于所述種子培養(yǎng)基中，25-30°C (如 280C )、140-200rpm(如180rpm)培養(yǎng)2-6天(如96小時)，得到種子液。所述方法還可包括如下步驟(1)將所述發(fā)酵液離心(離心參數(shù)具體可為4°C、8000轉(zhuǎn)/min、15min)，分別收集
上清液和沉淀；(2)將步驟(1)獲得的沉淀用丙酮浸提(可室溫靜置10小時)，離心(離心參數(shù)具體可為4°C、8000轉(zhuǎn)/min、15min)并收集上清液；(3)將步驟(1)的上清液和步驟( 的上清液合并，即為放線菌素粗提液(菌株粗提液)；(4)將所述放線菌素粗提液上樣于HP-20大孔吸附樹脂，依次用體積百分比為 40%、60%和80%的丙酮水溶液洗脫(各一升)，依次收集用60%和80%丙酮水溶液洗脫得到的過柱后洗脫液，依次命名為洗脫液乙和洗脫液丙；(5)將所述洗脫液乙蒸干并用丙酮重新溶解，過濾后進行反相HPLC ；反相HPLC參數(shù)采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5 μ m，9· 4X250讓)；流動相為體積百分比為 60%的甲醇水溶液，流速為2. Oml/min ；收集保留時間為29. 2-29. 9min的洗脫液，蒸干后得到放線菌素；將所述洗脫液丙蒸干用丙酮重新溶解，過濾后進行反相HPLC ；反相HPLC參數(shù)采用 Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；流動相為體積百分比為 70% 的甲醇水溶液，流速為2. Oml/min ；收集保留時間為38. 1-39. 6min的洗脫液，蒸干后得到放線菌素X2 ；收集保留時間為39. 9-40. 7min的洗脫液，蒸干后得到放線菌素D。本發(fā)明提供的鏈霉菌MS449在沒有經(jīng)過任何培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的前提下，其放線菌素&，放線菌素D和放線菌素的產(chǎn)量分別可達1. 92、1. 77和0. 15mg/ml，均高于目前已見報道的放線菌素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)放線菌素的方法是發(fā)酵鏈霉菌MS449，發(fā)酵穩(wěn)定、化合物分離工藝簡便、產(chǎn)率高。本發(fā)明提供的菌株具有很好的工業(yè)化潛力和前景。
圖1為鏈霉菌MS449在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)28天的照片。圖2為鏈霉菌MS449在掃描電鏡(Quanta 200) 10000X下觀察的照片。圖3為放線菌素粗提液的HPLC分析圖。圖4為活性組份甲㈧、活性組份乙⑶和活性組份丙(C)的質(zhì)譜圖。圖5為活性組份甲㈧、活性組份乙⑶和活性組份丙(C)的紫外光譜圖。
圖6為活性組份甲、活性組份乙和活性組份丙的碳信號歸屬。圖7為每毫升發(fā)酵液中活性組份甲、活性組分乙和活性組分丙的產(chǎn)量。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值?？扇苄缘矸圪徸员本┗S，產(chǎn)品目錄號為K0800034。葡萄糖購自北京現(xiàn)代東方精細化學(xué)品有限公司(HG)。稷粉購自農(nóng)貿(mào)市場。棉籽蛋白粉(藥媒)購自北京中棉紫光生物科技有限公司。MOPS即3-(N-嗎啉基)丙磺酸，購自北京江晨生物。HP-20大孔吸附樹脂 (三菱)購自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZorbaxXDB C_8 column 購自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZORBAX XDB C-18 column 購自北京慧德易科技有限公司。實施例1、鏈霉菌MS449的分離和鑒定一、鏈霉菌MS449的分離菌株分離培養(yǎng)基的組成如下(以下均為質(zhì)量百分比)淀粉2%、L-天冬素 0. 05%,KNO3 0.1%,K2HPO4 · H2O 0. 05%,NaCl 0. 05%,MgSO4 · 7H20 0. 05%,CaCO3 0.1%, Agarl. 8%和 H2O ；pH 值為 7. 5。取1. Og 土樣(采自中國南海海底泥的泥土樣品)，放入裝有9. Oml無菌水的50ml 離心管中，180rpm搖2h，于20KHz、100W功率超聲^iiin ；取1. Oml懸濁液，放入裝有9. Oml無菌水的50ml離心管中，混勻；取1. Oml懸濁液，放入裝有9. Oml無菌水的50ml離心管中，混勻；系列稀釋10_3和10_4 ；蓋緊管蓋，于100°C保溫lh，取0. 2ml涂板。獲得了一株菌，將其命名為菌株MS449。菌株MS449的保藏方法于25%甘油凍存管_80°C保藏。二、鏈霉菌MS449的鑒定菌株MS449在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀天的照片見圖1。菌株MS449在掃描電鏡 (Quanta 200) 10000X下觀察的照片見圖2。在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀天產(chǎn)生圓柱形孢子， 表面光滑，大小均勻(0. 5-0. 7 μ mX 1.5-2. Oym)。氣生菌絲呈黃白色，表面帶刺，基內(nèi)菌絲
呈黃色，有黃色色素產(chǎn)生。根據(jù)菌落形態(tài)特征，將菌株MS449鑒定為鏈霉菌。鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )MS449已于2011年11月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. M52。實施例2、應(yīng)用鏈霉菌MS449生產(chǎn)放線菌素斜面培養(yǎng)基的制備方法如下(pH7. 0)將2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl,0. 6g MgSO4 · 7H20 和 18g 瓊脂用水溶解并用水定容至 1L。種子培養(yǎng)基的制備方法如下(pH7. 5)將2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 用水溶解并用水定容至 IL0發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下(pH7. 0)將IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和
520g MOPS用水溶解并用水定容至1L。一、菌株發(fā)酵1、種子培養(yǎng)(1)將鏈霉菌MS449的孢子接種于斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)8天(到氣生菌絲豐滿)， 即得到斜面菌種。(2)在500ml玻璃瓶中裝入IOOml種子培養(yǎng)基。(3)從步驟(1)的斜面挖塊接種至步驟O)的培養(yǎng)基，280C、ISOrpm培養(yǎng)96小時， 得到種子液。2、發(fā)酵培養(yǎng)(1)在500ml的三角瓶中加入IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基。(2)在步驟(1)的培養(yǎng)基中接種5ml步驟1得到的種子液，、ISOrpm培養(yǎng)15 天，收獲發(fā)酵液(發(fā)酵液為容器內(nèi)的所有物質(zhì))。二、有效成分的分離純化1、將1升步驟一得到的發(fā)酵液4°C條件下離心15min(8000轉(zhuǎn)/min)，分別收集上清液和沉淀(菌體)。2、將步驟1獲得的菌體用350mL丙酮室溫條件下浸泡過夜(約10小時)，4°C條件下離心15min (8000轉(zhuǎn)/min)，收集上清液。3、將步驟1的上清液和步驟2的上清液合并，即為放線菌素粗提液(菌株粗提液)。4、將50ml放線菌素粗提液上樣于HP-20大孔吸附樹脂柱，用100%丙酮洗脫，濃縮洗脫液，并進行HPLC分析。HPLC 參數(shù)Agilent Zorbax XDB C_8column(5 μ m，4. 6X 150mm)；體積百分比為 70%的甲醇水溶液為流動相，流速為1. Oml/min ；檢測波長為2Mnm。HPLC圖譜見圖3。粗提液中存在三種成分，保留時間分別為8. 6min、14. 7min和 16.9min。5、將步驟3得到的菌株粗提液(約1300ml)上樣于300ml HP-20大孔吸附樹脂， 先用800ml水洗脫，然后依次用體積百分比為40%、60%和80%的丙酮水溶液(各1升) 洗脫，依次收集用60%和80%丙酮水溶液洗脫得到的過柱后洗脫液，依次命名為洗脫液乙 (約1升)和洗脫液丙(約1升)。6、將洗脫液乙通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去丙酮并蒸干，用3mL丙酮重新溶解，過濾后進行反相HPLC。反相HPLC參數(shù)Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；體積百分比為60%的甲醇水溶液為流動相，流速為2. Oml/min ；檢測波長為2Mnm。收集保留時間為四.2-29. 9min的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到活性組分甲 (每毫升步驟一得到的發(fā)酵液中含有0. 15mg活性組分甲)。7、將洗脫液丙通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去丙酮并蒸干，用6mL丙酮重新溶解，過濾后進行反相HPLC。反相HPLC參數(shù)Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9· 4X 250讓)；體積百分比為70%的甲醇水溶液為流動相，流速為2. Oml/min ；檢測波長為2Mnm。
收集保留時間為38. 1-39. 6min的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到活性組分乙 (每毫升步驟一得到的發(fā)酵液中含有1. 92mg活性組分乙)。收集保留時間為39.9_40.6min的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到活性組分丙 (每毫升步驟一得到的發(fā)酵液中含有1. 77mg活性組分丙)。三、有效成分的鑒定1、外觀活性組份甲、活性組分乙和活性組分丙均為無定形桔紅色粉末。2、溶解性活性組份甲、活性組分乙和活性組分丙均易溶于甲醇、丙酮、氯仿，不溶于水。3、質(zhì)譜活性組份甲的質(zhì)譜圖見圖4A。ESI-MS質(zhì)譜檢測其[M+H]+為1271. 3，與文獻報道放線菌素\0的分子離子峰一致?；钚越M分乙的質(zhì)譜圖見圖4B。ESI-MS質(zhì)譜檢測其[M+H]+為U69. 1，[M+Na]+為 1291.1。與文獻報道放線菌素X2的分子離子峰一致?；钚越M分丙的質(zhì)譜圖見圖4C。ESI-MS質(zhì)譜檢測其[M+H]+為1255. 1，[M+Na]+為 1277.1。與文獻報道放線菌素D的分子離子峰一致。4、紫外光譜紫外光譜測試儀器為Mariner System 5304instrument?；钚越M份甲的紫外光譜圖見圖5A，在238和444. Onm處有最大吸收峰?；钚越M份乙的紫外光譜圖見圖5B，在239和445. Onm處有最大吸收峰?；钚越M份丙的紫外光譜圖見圖5C，在240和444. Onm處有最大吸收峰。5、核磁信號歸屬核磁圖譜測試儀器為Varian Inova 600MHz，所用溶劑為氘代丙酮(aCet0ne-d6)。 活性組份甲、活性組份乙和活性組份丙的碳信號歸屬如表1和圖6所示。與文獻報道一致。表1活性組份甲、活性組份乙和活性組份丙的碳信號歸屬
位置13C NMR 位移(ppm)a—ringb-ring活性組份甲活性組份乙活性組份丙活性組份甲活性組份乙活性組份丙
權(quán)利要求
1.鏈霉菌(Sti^ptomycessp. )MS449，它的保藏編號為 CGMCC No. 5452。
2.權(quán)利要求1所述鏈霉菌MS449在生產(chǎn)放線菌素中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述放線菌素為放線菌素&、放線菌素D和放線菌素\0中的至少一種。
4.用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述鏈霉菌MS449的培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將 20-30g 可溶性淀粉、0. 2-0. 6g L-天冬酰胺、0. 5-1. Og ΚΝ03、0· 2-0. 6gK2HP04 · H2O, 0. 2-0. 6g NaCl 和 0. 2-1. Og MgSO4 · 7H20 用水定容至 1L。
5.用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述鏈霉菌MS449的培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基將5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3_(N_嗎啉基)丙磺酸用水定容至1L。
6.一種制備放線菌素的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1所述鏈霉菌MS449，得到放線菌素。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的條件為25-30°C、140-200rpm、 6-20 天。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟將權(quán)利要求1 所述鏈霉菌MS449的種子液接種至權(quán)利要求5所述培養(yǎng)基中發(fā)酵并收獲發(fā)酵液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述種子液的制備方法如下將權(quán)利要求1 所述鏈霉菌MS449接種于權(quán)利要求4所述培養(yǎng)基中，25-300C、140-200rpm培養(yǎng)2_6天，得到種子液。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟(1)將所述發(fā)酵液離心，分別收集上清液和沉淀；(2)將步驟(1)獲得的沉淀用丙酮浸提，離心并收集上清液；(3)將步驟(1)的上清液和步驟O)的上清液合并，即為放線菌素粗提液；(4)將所述放線菌素粗提液上樣于HP-20大孔吸附樹脂，依次用體積百分比為40%、 60%和80%的丙酮水溶液洗脫，依次收集用60%和80%丙酮水溶液洗脫得到的過柱后洗脫液，依次命名為洗脫液乙和洗脫液丙；(5)將所述洗脫液乙蒸干并用丙酮重新溶解，過濾后進行反相HPLC；反相HPLC參數(shù) 采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column ；流動相為體積百分比為60%的甲醇水溶液，流速為2. Oml/min ；收集保留時間為29. 2-29. 9min的過柱后洗脫液，得到放線菌素Xoe ；將所述洗脫液丙蒸干用丙酮重新溶解，過濾后進行反相HPLC ；反相HPLC參數(shù)采用 Agilent ZORBAX XDB C-18 column ；流動相為體積百分比為70 %的甲醇水溶液，流速為 2. Oml/min ；收集保留時間為38. 1-39. 6min的過柱后洗脫液，得到放線菌素X2 ；收集保留時間為39. 9-40. 7min的過柱后洗脫液，得到放線菌素D。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株鏈霉菌及其在生產(chǎn)放線菌素中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為鏈霉菌MS449，它的保藏編號為CGMCC No.5452。本發(fā)明提供的鏈霉菌MS449在沒有經(jīng)過任何培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的前提下，其放線菌素X2，放線菌素D和放線菌素X0β的產(chǎn)量分別可達1.92、1.77和0.15mg/ml，均高于目前已見報道的放線菌素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)放線菌素的方法是發(fā)酵鏈霉菌MS449，發(fā)酵穩(wěn)定、化合物分離工藝簡便、產(chǎn)率高。本發(fā)明提供的菌株具有很好的工業(yè)化潛力和前景。
文檔編號C12P21/02GK102391967SQ20111036603
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者代煥琴, 余珂, 傅成章, 劉雪婷, 宋福行, 張立新, 楊娜, 王倩, 謝峰, 郭徽, 陳彩霞 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所