專利名稱：先天性眼球震顫基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種先天性眼球震顫基因檢測試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
先天性眼球震顫(congenitalidiopathic nystagmus, CIN)是一種非自主的、有節(jié)律的眼球震顫，出生后早期被發(fā)現(xiàn)，發(fā)病率約為1/1000 1/1500。由于眼球震顫嚴(yán)重?fù)p害視功能，雙眼不停顫動或伴有代償頭位及頭部擺動而影響外觀，給患者的生活造成很大困擾。對于先天性眼球震顫的治療，目前國內(nèi)沒有治愈的方法。由于先天性眼球震顫絕大部分伴發(fā)其它眼病，嚴(yán)重影響視力，只能夠通過手術(shù)解決伴發(fā)眼病。目前對于先天性眼球震顫的檢測國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。由于不能早期檢測，最終導(dǎo)致患者失明，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，同時也給家人和社會帶來很大的負(fù)擔(dān)，也影響了全社會人口質(zhì)量。本發(fā)明的試劑盒能夠早期診斷出先天性眼球震顫(包括妊娠期)，并且指導(dǎo)醫(yī)生進(jìn)行正確及時的判斷并給予相應(yīng)的治療，可以根據(jù)檢測結(jié)果在知情同意的原則下對患病胎兒選擇性終止妊娠，同時也幫助CIN家系成員生育健康后代。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)對先天性眼球震顫快速檢測的試齊U盒。本發(fā)明克服了先天性特發(fā)性眼球震顫的臨床表現(xiàn)和遺傳的異質(zhì)性，利用c. 163-1G > T位點(diǎn)提供了一種可以迅速的檢測先天性眼球震顫疾病，為先天性眼球震顫的基因診斷工作帶來了顯著的便利。為預(yù)防下一代發(fā)病并提高全社會人口質(zhì)量作出巨大貢獻(xiàn)，對于社會發(fā)展有更深遠(yuǎn)的意義。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明結(jié)合本研究家系的單純性眼球水平震顫的臨床表型分析，公開了一個與先天性特發(fā)性眼球震顫密切相關(guān)的易感基因的全新位點(diǎn)，即一個剪切位置c. 163-1G > T的改變，攜帶T堿基的為先天特發(fā)性眼球震顫易感人群(圖5所示)。該致病位點(diǎn)為國際上首次報道，通過確定c. 163-1G > T位點(diǎn)的剪切突變導(dǎo)致家系中的眼球震顫患者發(fā)病，本發(fā)明利用該位點(diǎn)設(shè)計了可直接用于眼球震顫疾病檢測的試劑盒。本發(fā)明的一種先天性眼球震顫基因檢測試劑盒，該試劑盒包括10μΜ dNTPs, 10XPCR反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增引物對和雙蒸水，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增引物對由引物1和引物2組成，其中，引物1如SEQ ID NO :1所示，引物2如SEQ ID NO 2 所示。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)選如下反應(yīng)體系樣品模板150ng，10XPCR 反應(yīng)緩沖液 5 μ 1，10 μ M dNTPs 0. 5μ 1,5U/μ 1 DNA聚合酶0. 5 μ 1，IOpmol引物12 μ 1，IOpmol引物22 μ 1，用雙蒸餾水補(bǔ)至40 μ 1 ；PCR擴(kuò)增條件95°C變性5min，后進(jìn)入主循環(huán)94°C變性30s，60°C 30s，72°C延伸 30s，共30個循環(huán)，然后72°C延伸10min，4°C保存。優(yōu)選的，所述的DNA聚合酶為iTaq PlusI DNAase。本發(fā)明PCR檢測試劑盒中的各種組分都可從商業(yè)途徑購買得到，所用到的引物都可采用自動DNA合成儀合成得到。本發(fā)明一種先天性眼球震顫基因檢測試劑盒的應(yīng)用方法如下(1)按照常規(guī)方法提取待檢測樣品的DNA模板；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析；(4)將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，測序圖譜分析軟件聯(lián)合NCBI基因庫序列分析突變位置，測序峰圖與正常對照者測序峰圖(圖4所示)進(jìn)行比較并結(jié)合患者測序峰圖(圖2、圖3所示)做出是否為先天性眼球震顫患者的判定。本發(fā)明的c. 163-1G > T可以對CIN高風(fēng)險胎兒進(jìn)行準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷，利用該突變作為潛在的候選靶位，對先天性眼球震顫做出快速檢測。在知情同意的原則下對患病胎兒選擇性終止妊娠是幫助CIN家系成員生育健康后代的可行辦法。
圖1為該眼球震顫家系的遺傳家系圖譜；圖2為家族中女性患者測序峰圖；圖3為家族中男性患者測序峰圖；圖4為人群中正常對照者測序峰圖；圖5為突變前后由于剪切異常引起基因序列兩種不同的編碼改變。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、本發(fā)明一種先天性眼球震顫基因檢測試劑盒的制備和組裝一、引物對的設(shè)計及合成弓I物 1(FRMD7F) 5' cgtgctgcagtatcaggttag 3，(SEQ ID NO 1)弓丨物 2(FRMD7R) :5，ccctacatacctagctgcaaac 3，(SEQ ID NO 2)采用自動DNA合成儀合成，稀釋為10 μ mol/L。二、試劑盒的組裝10XPCR緩沖液，dNTPs, Taq PlusI DNAase購于寶生物工程(大連)有限公司。實(shí)施例2本發(fā)明的先天性眼球震顫基因檢測試劑盒的臨床應(yīng)用試驗(一 )、檢測標(biāo)本和實(shí)驗材料實(shí)驗材料STE、蛋白酶K購于天根生化科技(北京)有限公司。在爭得受試者知情同意后取受試者外周血5ml，受試者兩名，一男一女來自于同一家族譜系中，該眼球震顫家系的遺傳家系圖譜如圖1所示。
(二)、檢測方法1、提取 DNA:1. 1向500 μ 1抗凝血中加入Iml細(xì)胞裂解液，混勻，3000rpm離心5min ；1. 2重復(fù)上面步驟至紅細(xì)胞全部破碎；取細(xì)胞沉淀備用。1. 3向沉淀中分別加入STE 300ul,20% SDS 20ul，混勻，振蕩后，加入蛋白酶K 15ul (10mg/rrd)，置 50°C水浴過夜 12—16 小時；1. 4從水浴中取出樣品，加入IOOul飽和NaCl (6mol/L)，振蕩，可見白色沉淀析出， 5000rpm 離心 5min ；1. 5將上清移至另一干凈的離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇的混合液 (酚、氯仿、異戊醇體積比=25 24 1)后，振蕩，5000rpm離心8min;取上清后加入3倍體積冷無水乙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)晃動；1. 6將離心管8000rpm離心lOmin，倒出冷乙醇，將離心管倒置于濾紙上，利用離心濃縮儀去除水分；1. 7加入200ul超純水，4°C儲存；如果短期不用，將DNA分裝，于20°C凍存；1. 8取提取的基因組，經(jīng)紫外分光光度計測定含量。(另外取已溶解的基因組，上樣于1. O%的瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳)2、PCR 擴(kuò)增用引物1 (SEQ ID NO 1所示)和引物2 (SEQ ID NO 2所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增FRMD7
基因的編碼區(qū)。PCR反應(yīng)體系如下所示
模板150ng
10 χ PCR緩沖液5ul
dNTP 混合物(IOumol / Leach)0.5ul
引物 1 / 引物 2(10umol / L)各 2ul
Taq PlusI DNAase(5U / ul)0.5ul
ddH20樸足至40ul依次加入以上各反應(yīng)物，混勻后輕微離心，于基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR。PCR條件為 95°C變性5min，后進(jìn)入主循環(huán)94°C 30s, 6030s, 72°C 30s，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin。將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，測序圖譜分析軟件聯(lián)合NCBI基因庫序列分析查突變位置。(三)、檢測結(jié)果利用本發(fā)明的先天性眼球震顫基因檢測試劑盒的檢測結(jié)果。試驗結(jié)果見圖2和圖3所示，人群中正常對照者測序峰圖如圖4所示。從測序峰圖的對比來看，兩位受試者在 c. 163-1G > T位點(diǎn)均發(fā)生了突變，因此可確認(rèn)為先天性眼球震顫患者。以上說明對發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在不脫離權(quán)利要求所限定的精神和范圍的情況下，可作出許多修改、變化或等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表<110>哈爾濱醫(yī)科大學(xué)<120>先天性眼球震顫基因檢測試劑盒<130>KLPI110931<170>PatentIn 3.5<210>1
<211>21bp<212>DNA<213>primer 1<400>SEQ ID NO 1cgtgctgcagtatcaggttag<210>2<211>22bp<212>DNA<213>primer 2<400>SEQ ID NO 2ccctacatacctagctgcaaac
權(quán)利要求
1.一種先天性眼球震顫基因檢測試劑盒，該試劑盒包括10 μ M dNTPs，10XPCR反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增引物對和雙蒸水，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增引物對由引物 1和引物2組成，其中，引物1如SEQ ID NO :1所示，引物2如SEQ ID NO :2所示。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系樣品模板150ng，10XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，10 μ M dNTPs 0. 5μ l,5U/y 1 DNA聚合酶0. 5 μ 1，IOpmol引物12 μ 1，IOpmol引物22 μ 1，用雙蒸餾水補(bǔ)至40 μ 1 ；PCR擴(kuò)增條件PCR擴(kuò)增條件95°C變性5min，后進(jìn)入主循環(huán)94°C變性30s，6(TC 30s, 72°C延伸30s，共30個循環(huán)，然后72°C延伸10min，4°C保存。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA聚合酶為TaqPlusI DNAase0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種先天性眼球震顫基因檢測試劑盒。該試劑盒PCR擴(kuò)增引物對由引物1和引物2組成，其中，引物1如SEQ ID NO1所示，引物2如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明克服了先天性特發(fā)性眼球震顫的臨床表現(xiàn)和遺傳的異質(zhì)性，利用c.163-1G＞T位點(diǎn)提供了一種可以迅速的檢測先天性眼球震顫疾病的試劑盒，為先天性眼球震顫的基因診斷工作帶來了顯著的便利。為預(yù)防下一代發(fā)病并提高全社會人口質(zhì)量作出巨大貢獻(xiàn)，對于社會發(fā)展有更深遠(yuǎn)的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102409095SQ201110366028
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者原慧萍, 胡瑩 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)