專利名稱：用于石斑魚成分鑒別的引物、試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物，包含本發(fā)明的寡核苷酸引物的PCR檢測(cè)試劑盒，以及用于石斑魚成分鑒別的檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的進(jìn)步，近些年名優(yōu)魚類的消費(fèi)發(fā)展極為迅猛， 由于不同品種魚類的價(jià)值差異巨大，錯(cuò)誤標(biāo)簽和以次充好等現(xiàn)象越來(lái)越多。為保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，需要確定產(chǎn)品所用魚類的真實(shí)性和種類，建立一種可靠而簡(jiǎn)便的魚類物種鑒定方法。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法適合整條魚的品種鑒定，依賴于魚的整體形態(tài)，一旦進(jìn)行了加工，如魚片、魚糜等，魚種的形態(tài)鑒定將變得很困難?；贒NA的檢測(cè)方法由于其特異性和高穩(wěn)定性，在魚類的物種鑒定中起到了越來(lái)越重要的作用。目前在物種鑒定領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的DNA的檢測(cè)方法包括DNA序列分析、物種特異性PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、RFLP等。石斑魚泛指鱸形目鯧科石斑魚亞科里的各屬魚類，中國(guó)主要為石斑魚屬，部分石斑魚亦可見于鰓棘鱸屬、駝背鱸屬等其他屬。石斑魚價(jià)格昂貴，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。制假售假、以次充好的現(xiàn)象頻頻發(fā)生。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)石斑魚物種鑒定的研究較少，Trotta等2005年發(fā)表了利用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行石斑魚鑒偽的方法(J Agric Food Chem, 2005, 53，2039-2045)。陳雙雅等2011年發(fā)表了應(yīng)用PCR-RFLP方法鑒定石斑魚不同品種的方法(色譜，2011，29， 677-680)ο本申請(qǐng)發(fā)明人設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物，通過(guò)PCR技術(shù)建立了石斑魚成分的檢測(cè)方法，PCR反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定實(shí)驗(yàn)樣品是否為石斑魚。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供了一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供了一種用于石斑魚成分鑒別的試劑盒。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供了一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測(cè)方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物，本發(fā)明通過(guò)分析已報(bào)道的石斑魚 16S核糖體核糖核酸(16S ribosomal RNA, 16S rRNA)基因序列設(shè)計(jì)，由正向引物Grof和反向引物Gror組成，所述正向引物的堿基序列SEQ ID No. 1和所述反向引物的堿基序列SEQ ID No. 2如下。使用本發(fā)明的引物對(duì)，能夠特異、靈敏地?cái)U(kuò)增出目的片段。SEQ ID No. 1 :5，- TgCCCTgTgACTATATgTT -3， SEQ ID No. 2 :5，- gTACATTCAgTCCTTgC -3，。一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測(cè)試劑盒，含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)根據(jù)上述引物的核苷酸序列信息合成引物Grof和Gror，將上述引物分別配制成濃度為10 Mfliol/L的溶液作為試劑盒，備用。(2)提取魚的肌肉組織的基因組DNA溶液備用。(3)以樣品基因組DNA為模板，利用所述的特異性寡核苷酸引物Grof和Gror進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴(kuò)增條帶判定結(jié)果。所述的PCR反應(yīng)體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入2. 5μ L IOXPCR 緩沖液 2. 5 μ L MgCl2 (25 mmol/L),2. 5 μ L dNTP (2.5 mmol/L),0. 2 μ L DNA 聚合酶(5 U/μ L), 1 μ L GrofClO ymol/L),l μ L GrorC 10 ymol/L),l μ L 基因組 DNA，14. 3 μ L 超純水。反應(yīng)條件為95 "C, 5 min ；94 "C 1 min，60 "C 30 s，72 "C 20 s，共 40 個(gè)循環(huán)； 72 "C 延伸 7 min。所述的判定結(jié)果是根據(jù)電泳出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴(kuò)增條帶作為檢出石斑魚成分的結(jié)論。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明根據(jù)石斑魚16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物，利用PCR方法鑒別石斑魚成分；本發(fā)明檢測(cè)方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有石斑魚成分，為食品安全提供了保證。本發(fā)明具有特異性好、檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、 靈敏度高的特點(diǎn)。
圖1是本發(fā)明PCR檢測(cè)10種石斑魚的試驗(yàn)結(jié)果；1 一 10依次為斑鰓棘 ψ (.Plectropomus maculatus)、豹紋魚思棘 ψ (.Plectropomus leopardus),馬它背售盧 {Cromileptes altivelis )、寬客頁(yè)售盧{Promicrops lanceolatus)、JftJl石斑魚{Epinephelus quoyanus )、赤點(diǎn)石斑魚{Epinephelus akaara )、云紋石斑魚{Epinephelus moara )、掠點(diǎn) ￠3 !!. {Epinephelus fuscogut ta tus ) > ^ ^ " !!. {Epinephelus coioides )禾口青石斑魚 {Epinephelus awoara )的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，均產(chǎn)生323 bp條帶；
圖2是本發(fā)明石斑魚成分PCR檢測(cè)方法的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。1 一 7依次為石斑魚含量分別為10 %、5 %、1 %、0·5 %、0· 1 %、0.05 %和0. 01%的魚肉樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式1.首先進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)
本實(shí)施例的用于鑒別石斑魚成分PCR檢測(cè)方法的引物，根據(jù)石斑魚16S基因序列(Genebank 序列號(hào) JF750749、JF750750、JF750751、JF750752、JF750753、JF750756、 JF750755、JF750757)，采用引物設(shè)計(jì)軟件I^rimer 5. 0設(shè)計(jì)而成。引物由正向引物Grof和反向引物Gror組成，其中正向引物Grof的序列SEQ ID No. 1和反向引物Gror的序列SEQ ID No. 2 如下
SEQ ID No. 1 :5，- TgCCCTgTgACTATATgTT -3， SEQ ID No. 2 :5，- gTACATTCAgTCCTTgC -3，。2.其次是引物的合成
根據(jù)上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物Grof和Gror。將上述引物分別配制成濃度為10 Mfflol/L的溶液作為試劑盒，備用。3.再是基因組DNA的提取(現(xiàn)有技術(shù))
1)取魚的肌肉組織剪碎后，用液氮充分研磨混勻。從中取約25 mg置于滅菌的1.5 mL 離心管中，按照QIAGEN DNeasy血液和組織DNA提取試劑盒制備樣品的基因組DNA溶液。2)加入180 μ ATL緩沖液和20 PL蛋白酶K，漩渦混勻，56 °C水浴約1 h，并不斷搖動(dòng)，至組織完全消化。3)加入200 μ AL緩沖液，漩渦混勻。加入200 μ 無(wú)水乙醇，再次混勻。4)將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至置于2 mL收集管中的DNeasy Mini spin column柱中，12 000 rpm離心1 min，棄收集管和管中的離心液體。5)將spin column柱套在新的2 mL收集管中，加入500 μ Affl緩沖液，12 000 rpm離心1 min，棄收集管和管中的離心液體。6)將spin column柱套在新的2 mL收集管中，加入500 μ AW2緩沖液，12 000 rpm離心3 min，棄收集管和管中的離心液體。7)將spin column柱置于新的1. 5 mL離心管中，加入100 μ 65 °C預(yù)熱的AE緩沖液溶解DNA，室溫靜置2 min。8)12 000 rpm離心2 min。離心管中的液體即為提取的DNA模板。檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量(DNA濃度不低于0.05 mg/L), - 20 °C保存?zhèn)溆谩?.再是PCR擴(kuò)增 DPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件
以上述提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入2. 5μ L 10XPCR緩沖液，2. 5 μ L MgCl2 (25 mmol/L),2. 5 μ L dNTP (2.5 mmol/L),0. 2 μ L DNA 聚合酶(5 U/ μ L), 1 μ L Grof (10 ymol/L),l μ L Gror (10 ymol/L),l μ L 基因組 DNA, 14. 3 μ L 超純水
將樣品管放入PTC-200 PCR儀(美國(guó)Bio-feid公司)，設(shè)置反應(yīng)條件為95 °C，5 min ；94 "C 1 min, 60 "C 30 s，72 "C 20 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72 "C 延伸 7 min。2 ) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
用IXTAE電泳緩沖液制備廣1.5 %的瓊脂糖凝膠。取10 UL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μ L 10Χ上樣緩沖液混合后，在凝膠板上的孔中點(diǎn)樣。用100 bp的DNA Marker做分子量標(biāo)記。 設(shè)置電壓(3V/cnT5V/cm)，電泳時(shí)間為50 min 60 min。用凝膠成像儀(Alpha Imager EP) 拍照記錄。采用上述正向引物Grof和反向引物Gror特異性PCR擴(kuò)增的石斑魚16S基因片段長(zhǎng)度為323 bp，根據(jù)樣品是否產(chǎn)生323 bp的PCR擴(kuò)增條帶判定樣品中是否含有石斑魚成分。3)用于石斑魚成分鑒別的PCR方法的特異性確定
取不同品種石斑魚10份，其他常見魚類30份，按上述方法分別提取基因組DNA，并進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示10個(gè)石斑魚品種均特異性產(chǎn)生323 bp的擴(kuò)增條帶，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。其他30種魚中均未產(chǎn)生323 bp的擴(kuò)增條帶。表明建立的PCR 方法具有良好的特異性，可用于石斑魚成分的檢測(cè)。
5
4)用于石斑魚成分鑒別的PCR方法的靈敏度確定
將青石斑魚組織與花鱸組織混合，配制成青石斑魚相對(duì)百分含量(W/V)為10 %、5 %、1 %、0. 5 %、0. 1 %、0.05 %、0.01 %的魚類組織樣品，按實(shí)施例2方法分別提取基因組DNA，再按實(shí)施例3的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。表明建立的 PCR方法可從石斑魚含量為0.05 %的樣品中成功檢測(cè)出石斑魚。具有較高的靈敏度，符合檢測(cè)的要求。
權(quán)利要求
1.一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物，由正向引物Grof和反向引物 Gror組成，所述正向引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述反向引物的堿基序列為SEQ ID No. 2。
2.一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。
3.一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測(cè)方法，其特征在于以樣品基因組DNA為模板， 利用權(quán)利要求1所述的特異性寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴(kuò)增條帶判定結(jié)果。
4.如權(quán)利要求3所述的一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入2. 5μ L IOXPCR緩沖液，2. 5 μ L MgCl2 (25 mmol/L),2. 5 μ L dNTP (2.5 mmol/L),0. 2 μ L DNA 聚合酶(5 U/μ L), 1 μ L Grof (10 ymol/L),l μ L Gror (10 ymol/L),l μ L 基因組 DNA，14. 3 μ L 超純水； 反應(yīng)條件為95 "C, 5 min ；94 "C 1 min，60 "C 30 s，72 "C 20 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72 "C 延伸 7 min。
5.如權(quán)利要求3所述的一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述的判定結(jié)果是根據(jù)電泳出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴(kuò)增條帶作為檢出石斑魚成分的結(jié)論。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物、PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，所述引物對(duì)由正向引物Grof和反向引物Gror組成，其核苷酸序列見SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。本發(fā)明具有引物特異性好，檢測(cè)方法快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為進(jìn)出口魚類食品安全提供了保證。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102373283SQ201110356939
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者周昱, 徐敦明, 王嘉鶴, 陳偉玲, 陳雙雅 申請(qǐng)人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心