專利名稱：牡蠣折光馬爾太蟲lamp檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及牡蠣折光馬爾太蟲檢測領域，尤其是一種牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒。
背景技術：
折光馬爾太蟲(Marteilia refringens)對牡蠣養(yǎng)殖的危害較大，可引起貝類消瘦、消化道變色、停止生長并死亡，大洋洲和歐洲等國家其感染現(xiàn)象普遍存在。折光馬爾太蟲的傳統(tǒng)檢測方法有電鏡觀察、組織細胞學檢查、原位雜交等，這些方法費時費力，缺乏專一性，在實際工作中具有一定的局限性。目前，雖已建立起折光馬爾太蟲PCR檢測方法和熒光定量PCR檢測方法，其檢測敏感性也比較高，但是常規(guī)PCR需要使用 PCR儀和進行凝膠電泳，熒光定量PCR則需要使用更加昂貴的熒光定量PCR儀和試劑等，，因而難以適應基層現(xiàn)場檢測需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種特異性強、敏感性高、儀器要求低、操作快速簡便且成本低的牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒，以滿足基層現(xiàn)場快速檢測牡蠣折光馬爾太蟲的需要。為解決上述技術問題本發(fā)明采用如下技術方案牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒，該試劑盒含有以下試劑反應液A 含有IOX等溫反應緩存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸鎂、20uM的內(nèi)引物l、20uM的內(nèi)引物2、20uM的外引物l、20uM的外引物2、20uM的環(huán)引物 1、20碰的環(huán)引物2、511甜菜堿、6251^鈣黃綠素和12. 5mM氯化錳；IOX等溫反應緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；內(nèi)引物 1 序列為 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA，內(nèi)引物 2 序列為 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT，外引物1 序列為 GTCCGAGTGATCTTGTCAGC，外引物2 序列為 CGAGTAAGTGCATGCACAAC，環(huán)引物1 序列為 TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG，環(huán)引物2 序列為 ACCCACAACTTCGATAGCCCC。反應液A每管M μ L，其組成為2. 5ul 10 X等溫反應緩存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物2，lul 5M甜菜堿、Iul 625μΜ鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和2. 5ul雙蒸水。本發(fā)明采用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術，并根據(jù)折光馬爾太蟲共有的基因保守區(qū)(見序列表SEQ. ID. No. 1)設計了兩個特異性內(nèi)引物、兩個特異性外引物和兩個特異性環(huán)引物，由此發(fā)明了用于快速檢測牡蠣折光馬爾太蟲的牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒。 應用本發(fā)明的LAMP檢測試劑盒建立牡蠣折光馬爾太蟲檢測方法，僅需通過對組織樣品進行DNA提取并進行環(huán)介導等溫擴增，即可檢測出牡蠣折光馬爾太蟲。該法無需昂貴的PCR 儀只需普通水浴鍋，卻比PCR檢測有更高的靈敏度，且不必通過凝膠電泳觀察結果，操作簡單而快速，特別適用于基層現(xiàn)場檢測。另外，常規(guī)的LAMP方法，需要在反應結束后開蓋加入STOR Green I或Gene Finder染料來顯色，容易造成假陽性一方面，反應產(chǎn)物易形成氣溶膠而污染周圍環(huán)境造成假陽性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料還會由于引物二聚體而引起假陽性。因此，本發(fā)明使用內(nèi)加鈣黃綠素+氯化錳替代了外加的STOR Green I和Gene Finder 染料，即在配置LAMP反應液時就加入反應液中而無需LAMP反應后再開蓋加入；而且，鈣黃綠素+氯化錳僅在發(fā)生LAMP反應時才出現(xiàn)綠色，避免了 STOR Green I和Gene Finder染料帶來的假陽性問題，所以具有更好的特異性。
圖1是應用本發(fā)明牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒的檢測方法特異性試驗結果圖。圖1中1折光馬爾太蟲，2單孢子蟲，3副溶血弧菌，4溶藻弧菌，5派琴蟲，6河弧菌，7貝類組織。圖2是應用本發(fā)明牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒的檢測方法敏感性試驗結果圖。圖2中1-8分別為以下不同濃度的牡蠣折光馬爾太蟲DNA 20ng/管，2ng/管， 200pg/ 管，20pg/ 管，2pg/ 管，200fg/ 管，20fg/ 管，2fg/ 管。圖3是PCR方法檢測牡蠣折光馬爾太蟲敏感性試驗結果圖。圖3中M為IOObp DNA ladder, 1-8分別為以下不同濃度的牡蠣折光馬爾太蟲 DNA20ng/ 管，2ng/ 管，200pg/ 管，20pg/ 管，2pg/ 管，200fg/ 管，20fg/ 管，2fg/ 管。
具體實施例方式一、牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒的配制反應液A 每管M μ L，其組成為2. 5ul 10 X等溫反應緩存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物2，lul 5M甜菜堿、Iul 625μΜ鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和2. 5ul雙蒸水。其中，IOX等溫反應緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1 %曲拉通X-100。內(nèi)引物 1 序列為 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA (見序列表 SEQ. ID. No. 2)，內(nèi)引物 2 序列為 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT (見序列表 SEQ. ID. No. 3)，外引物1 序列為 GTCCGAGTGATCTTGTCAGC(見序列表 SEQ. ID. No. 4)，
外引物2 序列為 CGAGTAAGTGCATGCACAAC(見序列表 SEQ. ID. No. 5)，環(huán)引物1 序列為 TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG(見序列表 SEQ. ID. No. 6)，環(huán)引物2 序列為 ACCCACAACTTCGATAGCCCC(見序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、應用本發(fā)明牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒檢測牡蠣折光馬爾太蟲的方法(以下簡稱LAMP檢測法)1、組織樣品中DNA的提取使用北京天跟生物工程公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(商品名海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，型號DP3M-0;3)提取組織DNA，濃度能達到20ng/ul。2、牡蠣折光馬爾太蟲LAMP反應以提取的牡蠣折光馬爾太蟲DNA為模板，在裝有MyL反應液A管中加入1 μ L待檢DNA構成25ul反應體系；LAMP反應程序如下61°C 60min，然后80°C 5min。直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有牡蠣折光馬爾太蟲；如果顏色為黃色， 說明待檢樣品不含有牡蠣折光馬爾太蟲。三、LAMP檢測法的特異性和敏感性試驗1.特異性試驗分別以折光馬爾太蟲、單孢子蟲、副溶血弧菌、派琴蟲、溶藻弧菌、河弧菌和貝類組織的核酸為模板，按照前述牡蠣折光馬爾太蟲LAMP反應體系和條件進行反應。結果見圖1，對牡蠣折光馬爾太蟲的檢測為陽性結果(顯示綠色)，而對單孢子蟲、 副溶血弧菌、派琴蟲、溶藻弧菌、河弧菌和貝類組織的檢測均為陰性(顯示黃色)。2.敏感性試驗將牡蠣折光馬爾太蟲DNA按10倍遞增稀釋成20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、 20fg、2fg。牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測方法檢出限與PCR對比牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測方法反應體系和條件按前述進行。牡蠣折光馬爾太蟲PCR反應組成如下在25ul的反應體系中含10XPCR Buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTP 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，牡蠣樣品模板 DNA 1 μ L, 25 μ mol/L 的上、下游引物(上游引物為 Marteilia 1 5-TACGACCGTAGCCTTTCCAC-3 ；下游引物為 Marteilia 2 5-CGCCTCTACTCTTCTCCCAA-3)各 0. 5 μ LddH2O 補足 25 μ L。擴增程序為94°C變性5分鐘，然后進入94°C變性1分鐘，57°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘的循環(huán)， 共進行35個循環(huán)，最后再經(jīng)72°C延伸10分鐘。牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測方法通過肉眼直接觀察結果，結果見圖2。將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后進行溴化乙錠染色，結果見圖3。牡蠣折光馬爾太蟲 LAMP檢測方法的檢測限為20fg，而常規(guī)PCR的檢測限為2pg，LAMP方法敏感性比常規(guī)PCR 高100倍。
權利要求
1.一種牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑 反應液A 含有IOX等溫反應緩存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸鎂、20uM的內(nèi)引物1、20uM的內(nèi)引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的環(huán)引物1、 20碰的環(huán)引物2、511甜菜堿、625 4 11鈣黃綠素和12. 5mM氯化錳；所述IOX等溫反應緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM 硫酸鎂和曲拉通X-100 ；所述內(nèi)引物 1 序列為 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA， 所述內(nèi)引物 2 序列為 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT， 所述外引物1序列為GTCCGAGTGATCTTGTCAGC， 所述外引物2序列為CGAGTAAGTGCATGCACAAC， 所述環(huán)引物1序列為TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG， 所述環(huán)引物2序列為ACCCACAACTTCGATAGCCCC。
2.根據(jù)權利要求1所述的牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述反應液 A每管M μ L，其組成為2. 5ul IOX等溫反應緩存液、l.Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM 的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM 的內(nèi)引物 2、2ul 20uM 的外引物l、2ul 2011] 的外引物2、1111 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物2，Iul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和2. 5ul雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牡蠣折光馬爾太蟲LAMP檢測試劑盒，它采用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術，并根據(jù)折光馬爾太蟲共有的基因保守區(qū)設計了兩個特異性內(nèi)引物、兩個特異性外引物和兩個特異性環(huán)引物。應用本發(fā)明的LAMP檢測試劑盒，僅需通過對組織樣品進行DNA提取并進行環(huán)介導等溫擴增，即可檢測出牡蠣折光馬爾太蟲，解決了現(xiàn)有技術檢測時間長、工作量大、交叉污染、操作復雜等缺陷，具有特異性強、敏感性高、快速且成本低、操作方法更簡單，特別適于基層現(xiàn)場快速檢測牡蠣折光馬爾太蟲的需要。
文檔編號C12Q1/68GK102559867SQ20111035651
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權日2011年11月11日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所