專利名稱：牡蠣單孢子蟲lamp檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牡蠣單孢子蟲檢測領(lǐng)域，尤其是一種牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
單孢子蟲(Haplospori dium sp)對牡蠣養(yǎng)殖的危害較大，主要感染牡蠣血細(xì)胞、 結(jié)蒂組織和消化道上皮，可引起牡蠣較高的死亡率，在美洲、大洋洲和亞洲等國家的感染普遍存在。單孢子蟲的傳統(tǒng)檢測方法有電鏡觀察、組織細(xì)胞學(xué)檢查、原位雜交等，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，缺乏專一性，在實(shí)際工作中具有一定的局限性。目前，雖已建立起單孢子蟲PCR和熒光定量PCR檢測方法，其檢測敏感性也比較高，但是常規(guī)PCR需要使用PCR儀和進(jìn)行凝膠電泳，熒光定量PCR則需要使用更加昂貴的熒光定量PCR儀和試劑等，，因而難以適應(yīng)基層現(xiàn)場檢測需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、儀器要求低、操作快速簡便且成本低的牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒，以滿足基層現(xiàn)場快速檢測牡蠣單孢子蟲的需要。為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒，該試劑盒含有以下試劑反應(yīng)液A 含有IOX等溫反應(yīng)緩存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸鎂、20uM的內(nèi)引物l、20uM的內(nèi)引物2、20uM的外引物l、20uM的外引物2、20uM的環(huán)引物
1、20碰的環(huán)引物2、511甜菜堿、6251^鈣黃綠素和12.5mM氯化錳；IOX等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；內(nèi)引物 1 序列為 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG，內(nèi)引物 2 序列為 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG，外引物1 序列為 GACGATCAGATACCGTCG，外引物2 序列為 TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA，環(huán)引物1 序列為 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG，環(huán)引物2 序列為 ACGGAAGGGCACCACCAGAT。反應(yīng)液A每管Mul，其組成為2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物
2、0.5ul5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和5. 5ul雙蒸水。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)牡蠣單孢子蟲共有的基因保守區(qū)(見序列表SEQ. ID. No. 1)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物和兩個(gè)特異性環(huán)引物，由此發(fā)明了用于快速檢測牡蠣單孢子蟲的牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的LAMP檢測試劑盒建立牡蠣單孢子蟲檢測方法，僅需通過對組織樣品進(jìn)行DNA提取并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，即可檢測出牡蠣單孢子蟲。該法無需昂貴的PCR儀只需普通水浴鍋，卻比PCR檢測有更高的靈敏度，且不必通過凝膠電泳觀察結(jié)果，操作簡單而快速，特別適用于基層現(xiàn)場檢測。另外，常規(guī)的LAMP方法，需要在反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入STOR Green I或Gene Finder染料來顯色，容易造成假陽性一方面，反應(yīng)產(chǎn)物易形成氣溶膠而污染周圍環(huán)境造成假陽性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料還會由于引物二聚體而引起假陽性。因此，本發(fā)明使用內(nèi)加鈣黃綠素+氯化錳替代了外加的STOR Green I和Gene Finder 染料，即在配置LAMP反應(yīng)液時(shí)就加入反應(yīng)液中而無需LAMP反應(yīng)后再開蓋加入；而且，鈣黃綠素+氯化錳僅在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才出現(xiàn)綠色，避免了 STOR Green I和Gene Finder染料帶來的假陽性問題，所以具有更好的特異性。
圖1是應(yīng)用本發(fā)明牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒的檢測方法特異性試驗(yàn)結(jié)果圖。圖1中1單孢子蟲，2折光馬爾太蟲，3副溶血弧菌，4派琴蟲，5溶藻弧菌，6河弧菌，7擬態(tài)弧菌，8牡蠣組織。圖2是應(yīng)用本發(fā)明牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒的檢測方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。圖2中1-8分別為以下不同濃度的牡蠣單孢子蟲DNA Ing/管，IOOpg/管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。圖3是PCR方法檢測牡蠣單孢子蟲敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。圖3中M為IOObp DNA ladder, 1-8分別為以下不同濃度的牡蠣單孢子蟲DNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。
具體實(shí)施例方式一、牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒的配制反應(yīng)液A 每管Mul，其組成為2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物 2、0.5ul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和5. 5ul雙蒸水。其中，IOX等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1 %曲拉通X-100。內(nèi)引物 1 序列為 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG (見序列表 SEQ. ID. No. 2)，內(nèi)引物 2 序列為 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG (見序列表 SEQ. ID. No. 3)，外引物1 序列為 GACGATCAGATACCGTCG(見序列表 SEQ. ID. No. 4)，外引物2 序列為 TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA(見序列表 SEQ. ID. No. 4)，環(huán)引物1 序列為 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG(見序列表 SEQ. ID. No. 6)，
環(huán)引物 2 序列為 ACGGAAGGGCACCACCAGAT (見序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、應(yīng)用本發(fā)明牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒檢測牡蠣單孢子蟲的方法(以下簡稱LAMP檢測法)1、組織樣品中DNA的提取使用北京天跟生物工程公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(商品名海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，型號DP3M-0;3)提取組織DNA，濃度能達(dá)到20ng/ul。2、牡蠣單孢子蟲LAMP反應(yīng)以提取的牡蠣單孢子蟲DNA為模板，在裝有MyL反應(yīng)液A管中加入1 μ L待檢 DNA構(gòu)成25ul反應(yīng)體系；LAMP反應(yīng)程序如下62°C 60min，然后80°C 5min。直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有牡蠣單孢子蟲；如果顏色為桔紅色，說明待檢樣品不含有牡蠣單孢子蟲。三、LAMP檢測法的特異性和敏感性試驗(yàn)1.特異性試驗(yàn)分別以單孢子蟲、折光馬爾太蟲、副溶血弧菌、派琴蟲、溶藻弧菌、河弧菌、擬態(tài)弧菌和牡蠣組織的核酸為模板，按照前述牡蠣單孢子蟲LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果見圖1，對牡蠣單孢子蟲的檢測為陽性結(jié)果(顯示綠色)，而對折光馬爾太蟲、 副溶血弧菌、派琴蟲、溶藻弧菌、河弧菌、擬態(tài)弧菌和牡蠣組織的檢測均為陰性(顯示桔紅色)。2.敏感性試驗(yàn)將牡蠣單孢子蟲DNA按 10 倍遞增稀釋成 lng、lOOpg、IOp g、lpg、IOOfg、IOfg、lfg、 0. lfg。牡蠣單孢子蟲LAMP檢測方法檢出限與PCR對比牡蠣單孢子蟲LAMP檢測方法反應(yīng)體系和條件按前述進(jìn)行。牡蠣單孢子蟲PCR反應(yīng)組成如下在25ul的反應(yīng)體系中含10XPCR Buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTP 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，牡蠣樣品模板 DNA 1 μ L, 25 μ mol/L 的上、下游引物(上游引物為 MSX-A :5，-CGACTTTGGCATTAGGTTTCAGACC-3，；下游引物為 MSX-B :5，-ATGTGTTGGTGACGCTAACCG-3，，)各 0. 5 μ 1，dd H2O 補(bǔ)足 25 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性5分鐘，然后進(jìn)入94°C變性1分鐘，55°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘的循環(huán)， 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再經(jīng)72°C延伸10分鐘。牡蠣單孢子蟲LAMP檢測方法通過肉眼直接觀察結(jié)果，結(jié)果見圖2。將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行溴化乙錠染色，結(jié)果見圖3。牡蠣單孢子蟲LAMP檢測
方法的檢測限為lfg，而常規(guī)PCR的檢測限為100fg，LAMP方法敏感性比常規(guī)PCR高100倍。
權(quán)利要求
1.一種牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑 反應(yīng)液A 含有IOX等溫反應(yīng)緩存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸鎂、20uM的內(nèi)引物1、20uM的內(nèi)引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的環(huán)引物1、 20碰的環(huán)引物2、511甜菜堿、625 4 11鈣黃綠素和12. 5mM氯化錳；所述IOX等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM 硫酸鎂和曲拉通X-100 ；所述內(nèi)引物 1 序列為 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG， 所述內(nèi)引物 2 序列為 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG， 所述外引物1序列為GACGATCAGATACCGTCG， 所述外引物2序列為TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA， 所述環(huán)引物 1 序列為 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG， 所述環(huán)引物2序列為ACGGAAGGGCACCACCAGAT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)液A每管Mul，其組成為2.5ul IOX等溫反應(yīng)緩存液、l.Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物 2、0.5ul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和5. 5ul雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牡蠣單孢子蟲LAMP檢測試劑盒，它采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)牡蠣單孢子蟲共有的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物和兩個(gè)特異性環(huán)引物。應(yīng)用本發(fā)明的LAMP檢測試劑盒，僅需通過對組織樣品進(jìn)行DNA提取并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，即可檢測出牡蠣單孢子蟲，解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測時(shí)間長、工作量大、交叉污染、操作復(fù)雜等缺陷，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速且成本低、操作方法更簡單，特別適于基層現(xiàn)場快速檢測牡蠣單孢子蟲的需要。
文檔編號C12Q1/68GK102363810SQ20111035650
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所