植物氣孔特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：植物氣孔特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物氣孔特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子(Promoter)是基因組基因的一個(gè)重要組成部分，它像“開關(guān)” 一樣，在轉(zhuǎn)錄水平上基本決定其控制下的編碼基因是否表達(dá)、何時(shí)表達(dá)、何處表達(dá)和表達(dá)強(qiáng)度。一般根據(jù)啟動(dòng)子作用方式和功能將其大體可以分為三大類組成型啟動(dòng)子、特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[王關(guān)林，方宏筠，2002，植物基因工程原理與技術(shù)(第二版)，北京，科學(xué)技術(shù)出版社]。但這種分類不是絕對(duì)的，在某些情況下，一種類型的啟動(dòng)子往往兼有其它類型啟動(dòng)子的特性，例如，誘導(dǎo)增強(qiáng)性組成型啟動(dòng)子(肖興國(guó)等，發(fā)明專利號(hào)200710177962. 4)。組成型啟動(dòng)子(Constitutive promoter)是指能夠驅(qū)使其控制下的編碼基因在不同器官和/或組織大體恒定表達(dá)的一類啟動(dòng)子。它的特點(diǎn)是受其控制的編碼基因的表達(dá)具有持續(xù)性，但不具有時(shí)空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)恒定，不受外界因素的誘導(dǎo)。 例如花椰菜花葉病毒 35S 啟動(dòng)子 CaMV35S (Odell et al.，Nature, 1985,313 :810-812)、 玉米 Ubiquitin 啟動(dòng)子(Holtorf et al.，Plant Mol. Biol.，1995，29 :637-646)和水稻的 Actinl 啟動(dòng)子(McElroy et al，1990，Plant Cell，2 :163-171)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子anducible promoter)是指能夠響應(yīng)某些特定的物理、化學(xué)和生物信號(hào)(統(tǒng)稱為“誘導(dǎo)子”或“誘導(dǎo)因子”)而驅(qū)動(dòng)其控制的編碼基因大幅度地增加轉(zhuǎn)錄水平的一類啟動(dòng)子。它的特征為，在沒有誘導(dǎo)因子存在的條件下，它控制的編碼基因不表達(dá)或者只有非常低的表達(dá)(也稱為“本底表達(dá)”)，但一旦受到誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)，基因的表達(dá)量迅速并且大幅度增加。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子常常根據(jù)其誘導(dǎo)信號(hào)來(lái)分類和命名，例如真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子、共生細(xì)菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子、金屬離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子和創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。器官和/或組織特異性啟動(dòng)子(0rgan-and/or Tissue-specific promoter)，能夠驅(qū)使其控制下的編碼基因僅僅在生物體的某一或某些特定的器官和/或組織，或者僅僅在生長(zhǎng)發(fā)育的某一或某些特定階段表達(dá)的一類基因。它的特征為，受其控制或調(diào)節(jié)的基因表達(dá)具有明顯的時(shí)空性，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。例如，植物上的根特異性啟動(dòng)子、葉片特異性啟動(dòng)子、花特異性啟動(dòng)子、氣孔特異性啟動(dòng)子、氣孔絨氈層特異性啟動(dòng)子、花粉特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、種子特異性啟動(dòng)子、胚乳特異性啟動(dòng)子、棉花纖維特異性啟動(dòng)子和韌皮部特異性啟動(dòng)子等等。氣孔(Stomatal pore)是植物與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換的門戶，也是水分蒸騰的通道。植物進(jìn)行光合作用所必需的(X)2依靠氣孔進(jìn)入體內(nèi)，而呼吸作用所產(chǎn)生的A則依靠氣孔排除到體外。此外，植物的水分蒸騰也依靠氣孔作為主要通道。因此，氣孔的開關(guān)控制著植物的蒸騰作用、光合作用和呼吸作用等重要生理過(guò)程。一般植物的氣孔由一對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞組成，有些植物中還有副衛(wèi)細(xì)胞(Subsidiary cells)圍繞著這一對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞，組成氣孔復(fù)合體(Stomatal complex)或稱氣孔器(Stomaltal apparatus) 0氣孔分布在植物的地上部分，主要集中在葉片。組成氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，在大多數(shù)雙子植物和一些單子葉植物、裸子植物、蕨類和蘚類上呈腎形，而在禾本科植物和幾種苔草上則呈啞鈴形。保衛(wèi)細(xì)胞的體積比葉表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞的體積小得多。它的細(xì)胞壁按其和相鄰細(xì)胞的相對(duì)位置而命名背壁(Dorsal wall)，指和表皮細(xì)胞相鄰的壁；腹壁(Ventral wall)，與背壁相對(duì)、近孔處的壁；外側(cè)壁 (Outer lateral wall)，靠葉片外表面的壁；內(nèi)側(cè)壁(Inner lateral wall)，靠氣孔下腔的壁。保衛(wèi)細(xì)胞的壁各處厚薄不均，一般背壁薄而腹壁特別加厚。這樣，在細(xì)胞膨壓大時(shí)， 保衛(wèi)細(xì)胞呈彎月形，氣孔開放；在細(xì)胞膨壓小時(shí)，保衛(wèi)細(xì)胞呈直腎形或圓柱形，氣孔關(guān)閉 (Wilmer and Fricker，1996，Stomata，Ed Chapman and Hall，London，1-375)。保衛(wèi)細(xì)胞正是通過(guò)自身的膨壓大小的改變而改變自身體積的大小和形狀來(lái)調(diào)控氣孔的開、關(guān)和張開程度以應(yīng)對(duì)其感受的外界環(huán)境中的生物和非生物刺激(例如々8々、0)2和干旱等)以及由自身植物根傳來(lái)的信號(hào)(Bergmann and Sack FD, 2007, Annu Rev Plant Biol，58 :163-81)。 引起這種自身的膨壓大小的改變及由此導(dǎo)致的自身體積大小和形狀的改變的機(jī)理，一般認(rèn)為，主要是通過(guò)細(xì)胞膜和液泡膜的一些通道蛋白進(jìn)行的跨膜離子和水的運(yùn)輸(Pandey et al.,2007, FEBS Lett,581 :2325-36 ；Schroeder et al.，2001，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，52 :627-58)。在C3和C4植物上，能夠引起氣孔開放的主要環(huán)境因子有 藍(lán)光、紅光、高濕和低 CO2 (Marten et al，2007，Plant J, 2007. 50 :129-139 ；Shimazaki et al,2007, Annu Rev Plant Biol，58 :219-47)；能夠引起氣孔關(guān)閉的主要環(huán)境因子有黑暗、干旱、高 CO2 和高臭氧濃度(Sirichandra et al，2009，J Exp Bot，60 :1439-63)。此外，內(nèi)源激素 ABA 能夠引起氣孔關(guān)閉(Wilkinson and Davies，2002，Plant Cell Env,25 195-210 ；Israelsson M et al，2006，Curr Opin Plant Biol，9 :654-63)，其它激素，如生長(zhǎng)素、激動(dòng)素、乙烯、芥末酸和油菜素內(nèi)酯，對(duì)氣孔的開關(guān)也都有一定的影響(Acharya and Assmann，2009，Plant Mol Biol. 69 :4451-4462 ；Kim et al，2010，Annu Rev Plant Biol, 61 :561-591)。氣孔運(yùn)動(dòng)(開和關(guān))是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過(guò)程，有人認(rèn)為它是植物適應(yīng)環(huán)境變化的一種主動(dòng)調(diào)節(jié)，也有人認(rèn)為是被動(dòng)調(diào)節(jié)，并且都有一定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為支撐。無(wú)論是主動(dòng)調(diào)節(jié)還是被動(dòng)調(diào)節(jié)，人們都希望從調(diào)控氣孔開關(guān)運(yùn)動(dòng)入手，提高植物的節(jié)水抗旱能力和光合效率[李軍等，中國(guó)科學(xué)C輯生命科學(xué)，2004，34 ) :299-303]，從而提高植物、特別是作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。為此，鑒定、分離和功能研究保衛(wèi)細(xì)胞特異性基因及其主要調(diào)控者-啟動(dòng)子的研究在全世界展開。Zhao 等從 22000 多株擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離到 3X IO8 個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體，由此鑒定出1734種獨(dú)特蛋白[Zhao et al. 2008，Plant Cell,20(12) 3210-3226]。一些保衛(wèi)細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)和/或特異性表達(dá)的蛋白和/或其編碼基因，如擬南芥 Aktl (Sentenac et al, 1992, Science，256 :663-665)、Katl (Anderson et al, 1992, PNAS，89 :3736-3740)禾Π TPCl (RienmuIler et al，2010，Plant and Cell Physiol,51 91548-91554)以及馬鈴薯Kstl (MulIer-Roeber et al, 1995,EMBO J，14 :2409-2416)等陸續(xù)被鑒定和/或克隆。隨著這些基因的克隆，其主要調(diào)控區(qū)域-啟動(dòng)子的鑒定、分離、重組和功能研究方面，近年來(lái)取得了明顯的進(jìn)展。例如，Katl啟動(dòng)子(Nakamura et al,1995, Plant Physiol, 109 :371-374)、Kstl (Plesch et al，2000，Gene, 249 :83 89)、Abhl 啟動(dòng)子(Hugouvieux et al.，Cell, 2001,106 :477-487)、Chll 啟動(dòng)子(Guo et al.，Plant Cell，2001，13 :1761-1777)、0sml 啟動(dòng)子(Zhu et al. ,Plant Cell，2002，14 :3009-3028)、 Ostl 啟動(dòng)子(Mustilli et al.，Plant Cell，2002，14 :3089-3099)，Racl (Lemichez et al.，Genes Dev.，2001，15 :1808-1816)、SLACl 啟動(dòng)子(Vahisalu et al，2008，Nature， 452 :487-491)、CDeT6-19啟動(dòng)子以及擬南芥單加氧酶基因CYP86A2啟動(dòng)子(Taylor et al, 1995,Plant Journal,7(1) :129-134 ；Galbiati et al,2008,Plant Journal, 53 :750-762. Francia et al, 2008,Plant Signaling&Behavior, 3 (9) :684-686)等。然而，這些啟動(dòng)子雖然能夠驅(qū)動(dòng)其控制的基因在氣孔強(qiáng)勢(shì)表達(dá)，但同時(shí)也在它組織和器官有不同程度的表達(dá)。 也就是說(shuō)，它們還缺乏氣孔表達(dá)的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供植物氣孔特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的植物氣孔特異性啟動(dòng)子來(lái)源于陸地棉(Gossypium hirsutum L.)，是下述a)或b)或c)的DNA片段a)3'端至少含有序列表中序列1的第538-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第538位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為468至1005bp 的任意一個(gè)DNA片段；所述DNA分子具有啟動(dòng)子功能；b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的 DNA片段；c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次 5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。所述啟動(dòng)子的最后一位核苷酸是序列1的第1005位。所述啟動(dòng)子為下述1)-3)中任一種1)3'端至少含有序列表中序列1的第520-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第520位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為486至1005bp 的任意一個(gè)DNA片段；2)3'端至少含有序列表中序列1的第410-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第410位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為596至1005bp 的任意一個(gè)DNA片段；3)3'端至少含有序列表中序列1的第355-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第355位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為651至1005bp 的任意一個(gè)DNA片段。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子具體為下述al)_a5)中任一種al)核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子((ihSLSP)；a2)核苷酸序列為序列表中序列1的第355-1005位核苷酸所示DNA分子 (GhSLSP-F2)；a3)核苷酸序列為序列表中序列1的第410-1005位核苷酸所示DNA分子(GhSLSP-F3)；a4)核苷酸序列為序列表中序列1的第520-1005位核苷酸所示DNA分子 (GhSLSP-F4)；a5)核苷酸序列為序列表中序列1的第538-1005位核苷酸所示DNA分子 (GhSLSP-F5)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子具體為上述al)_a5)中任一種。本發(fā)明提供的植物氣孔特異性啟動(dòng)子，還可以是下述d)或e)或f)的DNA片段d) 3 ‘端至少含有序列表中序列1的第355-643位核苷酸序列((ihSLSPF2-SH)，并且從序列1的第355位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為 289至64;3bp的任意一個(gè)DNA片段；所述啟動(dòng)子的最后一位核苷酸是序列1的第643位；e)與d)或e)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段；f)在嚴(yán)格條件下與d)或e)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次 5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。所述啟動(dòng)子為下述bl)或b2)bl)核苷酸序列為序列表中序列1的第1-643位核苷酸所示的DNA分子 (GhSLSP-SH)；b2)核苷酸序列為序列表中序列1的第355-643位核苷酸所示DNA分子 (GhSLSPF2-SH)。對(duì)(ihSLSP啟動(dòng)子(序列表中序列1)進(jìn)行5’端刪除分析得到的仍然具有氣孔特異性驅(qū)動(dòng)能力的啟動(dòng)子序列。其中，(ihSLSP-F5(序列表中序列1的第538-1005位核苷酸) 為(ihSLSP啟動(dòng)子5’端刪除直到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(序列表中序列1自5'端第634位核苷酸) 上游96bp仍具有氣孔特異性啟動(dòng)子活力的小片段，是(ihSLSP啟動(dòng)子的核心片段。對(duì)(ihSLSP(序列表中序列1)進(jìn)行3'端刪除分析得到的仍然具有氣孔特異性驅(qū)動(dòng)能力的啟動(dòng)子序列。其中，(ihSLSPF2-SH(序列表中序列1的第355-643位核苷酸序列)為 (ihSLSP啟動(dòng)子3'端刪除直到距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(序列表中序列1自5'端第634位核苷酸)9bp仍具有氣孔特異性啟動(dòng)子活力的小片段。GhSLSP啟動(dòng)子由1005個(gè)脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1，其中第603-608位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第634位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)， 635-1005位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(qū)(5 ‘ -UTR)。(ihSLSP-F2啟動(dòng)子由651個(gè)脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第 355-1005位。其中第603-608位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第634位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，635-1005位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(qū)(5' -UTR)。(ihSLSP-F3啟動(dòng)子由596個(gè)脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第 410-1005位。其中第603-608位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第634位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，635-1005位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(qū)(5' -UTR)。(ihSLSP-F4啟動(dòng)子由486個(gè)脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第520-1005位。其中第603-608位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第634位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，635-1005位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(qū)(5' -UTR)。(ihSLSP-F5啟動(dòng)子由468個(gè)脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第 538-1005位。其中第603-608位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第634位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，635-1005位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(qū)(5' -UTR)。(ihSLSP-SH啟動(dòng)子由643個(gè)脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第 1-643。其中第603-608位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第634位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，634-643位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(qū)(5 ‘ -UTR)。(ihSLSPF2-SH啟動(dòng)子由289個(gè)脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第355-643位。其中第603-608位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第634位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，634-643位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(qū)(5 ‘ -UTR)。從陸地棉(Gossypium hirsutum L.)中分別克隆得到(ihSLPS全長(zhǎng)啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行功能分析，產(chǎn)生了本發(fā)明。含有上述啟動(dòng)子的遺傳材料或獲得所述啟動(dòng)子的一個(gè)引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述遺傳材料為表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官。在所述表達(dá)盒中，所述氣孔特異性啟動(dòng)子的下游連接結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA的編碼DNA，用于驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表達(dá)。所述重組表達(dá)載體是含有上述表達(dá)盒，例如但不限于質(zhì)粒和病毒。所述重組表達(dá)載體也可為重組植物表達(dá)載體。所述重組植物表達(dá)載體含有上述表達(dá)盒并且能夠?qū)⑺龅谋磉_(dá)盒轉(zhuǎn)送進(jìn)入植物宿主細(xì)胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達(dá)盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體具體為在PBI121質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入所述啟動(dòng)子的核苷酸序列得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物器官或組織或細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無(wú)性系或其后代。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體使用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述引物對(duì)具體為下述cl)_c7)中的任一對(duì)cl)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c2)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列4所示DNA片段組成的引物對(duì)；c3)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7_21位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c4)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第H位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；
c5)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7_34位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c6)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c7)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列4所示DNA片段組成的引物對(duì)。所述啟動(dòng)子在植物中啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述植物是陸生植物，優(yōu)選是雙子葉植物，更優(yōu)選是煙草；所述表達(dá)為氣孔特異性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子(包括GhSLSP-F2、GhSLSP_F3、GhSLSP_F4、 (ihSLSP-F5、(;hSLSP-SH和(ihSLSPF2-SH)均可啟動(dòng)報(bào)告基因⑶S在煙草的氣孔中特異表達(dá)， 而在其它花器官和營(yíng)養(yǎng)器官都沒有檢測(cè)到表達(dá)，這說(shuō)明本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子具有良好的氣孔特異性。同時(shí)經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)還證明該特異性能夠穩(wěn)定地傳遞給后代。將本發(fā)明的啟動(dòng)子下游銜接內(nèi)源基因、外源基因及其反義基因或能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的編碼DNA，構(gòu)建表達(dá)盒并與不同的表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到植物中，利用其氣孔異性表達(dá)活性，在氣孔中特異性表達(dá)其控制或指導(dǎo)的所述內(nèi)源基因、外源基因及其反義基因或小RNA。在轉(zhuǎn)基因植株中使其內(nèi)源基因、外源基因及其反義基因或能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的表達(dá)局限于氣孔中，排除了這些基因在植體其它組織或器官的表達(dá)。利用本發(fā)明的啟動(dòng)子的氣孔特異性表達(dá)活性，用含有本發(fā)明啟動(dòng)子或該啟動(dòng)子與內(nèi)源基因與外源基因及其反義基因、能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)編碼DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或宿主組織及其后代細(xì)胞，并由此再生完整的轉(zhuǎn)基因植株，培育耐旱、耐高或低濃度CO2、抗真菌病害和高光合效率的植物或作物品種。所述植物是顯花植物，包括但不限于陸生植物、被子植物和裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物、草本植物、藤本植物和木本植物、園林園藝植物和農(nóng)作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物以及有性和無(wú)性繁殖植物，優(yōu)選為陸生植物。本發(fā)明的氣孔特異性啟動(dòng)子可用于功能分析、鑒定和分離植物氣孔形成和發(fā)育所必須的基因和調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)的基因，同時(shí)可以用于培育耐旱、耐高或低CO2、抗真菌病害、高光合效率和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的植物或作物品種。具體可在本發(fā)明的氣孔特異性啟動(dòng)子下游銜接異源或同源基因或其反義基因或小RNA編碼DNA，并構(gòu)建到植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主植物，在其氣孔表達(dá)目的蛋白、抑制或干擾目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，以開或關(guān)氣孔或者增強(qiáng)或降低氣孔的開關(guān)程度。本發(fā)明分離的氣孔特異性啟動(dòng)子對(duì)植物氣孔生長(zhǎng)和發(fā)育基因的功能分析和鑒定、培育耐旱、耐高或低CO2、抗真菌病害、高光合效率和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的植物或作物品種等都具有重大的應(yīng)用前景。本發(fā)明這不僅對(duì)氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的分子生物學(xué)研究和氣孔運(yùn)動(dòng)等的理論研究具有重要的意義，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率進(jìn)而提高產(chǎn)量和品質(zhì)等方面具有重大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為(ihSLSP啟動(dòng)子全長(zhǎng)克隆的PCR產(chǎn)物電泳圖。其中泳道M為分子量標(biāo)記 λ DNA/EcoRI+Hind III ；泳道1為引物1和引物2雙引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2為引物1單引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3為引物2單引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4為無(wú)模板DNA的雙引物 PCR擴(kuò)增對(duì)照。圖2為外加酶切位點(diǎn)的(ihSLSP啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列圖。其中，下劃線部分為外加的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(5'端為HindIII，3'端為BamHI)，方框處為TATA盒；雙下劃線者為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖3為氣孔特異性啟動(dòng)子(ihSLSP驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因⑶S的植物表達(dá)載體圖譜。圖4為轉(zhuǎn)pBI-GhSLSP的煙草Ttl代植株P(guān)CR鑒定圖。其中，泳道M =DNA大小分子標(biāo)記XDNA/EcoRI+Hindlll ；泳道1_8 轉(zhuǎn)基因煙草Ttl代8個(gè)獨(dú)立的單株；泳道9 載體質(zhì)粒 (pBI-GhSLSP)對(duì)照；泳道10 未轉(zhuǎn)基因的煙草NC89對(duì)照；泳道11 蒸餾水為模板的對(duì)照。圖5為轉(zhuǎn)基因((ihSLSP-GUQ煙草Ttl代植株的葉片圓盤的⑶S染色圖。其中，A為轉(zhuǎn)(ihSLSP-GUS煙草Ttl代植株的葉圓盤；a為A所示葉圓盤的局部放大照片。圖6為轉(zhuǎn)基因((ihSLSP-GUS)煙草T1代植株幼苗⑶S染色圖。其中，A為T1代幼苗整株的GUS染色照片；a為A的真葉局部放大圖。圖7為氣孔特異性啟動(dòng)子(ihSLSP的5'端刪除和3'端刪除不同長(zhǎng)度后的各個(gè)片段(GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP_F4、GhSLSP_F5、GhSLSP-SH 和 GhSLSPF2_SH)與全長(zhǎng)啟動(dòng)子((ihSLSP-F)之間的關(guān)系示意圖。其中，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSQ上游(即左端)的數(shù)據(jù)-X表示(^hSFSL經(jīng)過(guò)5'端刪除后殘留的核苷酸片段的長(zhǎng)度。圖8氣孔特異性啟動(dòng)子(ihSLSP 5'端刪除和3'端刪除不同長(zhǎng)度后的各個(gè)片段的PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，泳道Ml和M2分別為DNA分子量標(biāo)記λ DNA/EcoRI+HindIII和 Marker 1 (IOObp 標(biāo)記)；泳道 1 至 6 分別為 GhSLSP、GhSLSP_F2、GhSLSP-SH、GhSLSP_F3、 GhSLSP-F4 和 GhSLSP-F5 的 HindIII 和 BamH I 雙酶切結(jié)果。圖9為氣孔特異性啟動(dòng)子(ihSLSP 5'端刪除和3'端刪除不同長(zhǎng)度后的各個(gè)片段驅(qū)動(dòng)⑶S基因在轉(zhuǎn)基因煙草Ttl植株表達(dá)的⑶S染色圖。其中F2表示(ihSLSP-F2在轉(zhuǎn)基因煙草Ttl植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖；F3表示(ihSLSP-F3在轉(zhuǎn)基因煙草Ttl植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖；F4表示(ihSLSP-F4在轉(zhuǎn)基因煙草Ttl植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖；F5表示(ihSLSP-F5在轉(zhuǎn)基因煙草Ttl植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖； F-SH表示(ihSLSPF-SH在轉(zhuǎn)基因煙草Ttl植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖；F2-SH表示 GhSLSPF2-SH在轉(zhuǎn)基因煙草Ttl植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖。F2至F2-SH共6個(gè)系列圖中，均是左側(cè)為葉圓盤的GUS染色圖，右側(cè)為左側(cè)圖片的局部放大圖。圖10為氣孔特異性啟動(dòng)子(ihSLSP 5'端刪除后的片段(ihSLSP-F2、(;hSLSP-F5和 GhSLSP-SH驅(qū)動(dòng)⑶S基因在轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株特異性表達(dá)的⑶S染色圖。其中F2表示 GhSLSP-F2在轉(zhuǎn)基因煙草T1植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖；F5表示(ihSLSP-F5在轉(zhuǎn)基因煙草T1植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖；F-SH表示(ihSLSP-SH在轉(zhuǎn)基因煙草T1 植株驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的⑶S染色圖；A為T1代幼苗整株的⑶S染色照片；a為A的真葉局部放大圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中所述的啟動(dòng)子核苷酸序列可以是其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸發(fā)生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分離的核苷酸序列的人工突變體或“天然”突變體，它保留其啟動(dòng)子功能；還可以是所述的核苷酸序列與其它啟動(dòng)子序列或啟動(dòng)子區(qū)保守調(diào)控序列 (“motif”或“box”)的融合序列。本發(fā)明中所述的“啟動(dòng)子”為具有TATA盒(TATAbox)的啟動(dòng)子；TATA盒或類似區(qū)域，定位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS，在核苷酸計(jì)數(shù)上為“+1”)上游并且具有指導(dǎo)RNA聚合酶在正確位置上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能，但不限于該區(qū)域附近的部分；此外，它還可含有與除RNA聚合酶以外的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的用于調(diào)節(jié)表達(dá)的另一個(gè)必須區(qū)域。本發(fā)明中所述的“啟動(dòng)子區(qū)域”定義為含有上文中定義的啟動(dòng)子的區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游至少 10個(gè)核苷酸的區(qū)域。本發(fā)明中所述的“啟動(dòng)子活性”是指當(dāng)以某種基因的可表達(dá)方式將其連接到啟動(dòng)子的下游，并導(dǎo)入到宿主中，該宿主顯示具有在宿主內(nèi)或宿主外生產(chǎn)該基因產(chǎn)物的能力和功能時(shí)，該啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性。通常，是將編碼容易定性或定量檢測(cè)的蛋白質(zhì)的基因(例如，報(bào)告基因)連接到該啟動(dòng)子的下游，將該基因?qū)胨拗鲀?nèi)，并檢測(cè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)，可確定特定啟動(dòng)子的活性或是否存在該啟動(dòng)子或者該啟動(dòng)子的效力。本發(fā)明中所述的結(jié)構(gòu)基因是指能夠編碼某種蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)功能的一段核苷酸序列，包括RNA 或DNA序列。所述的調(diào)節(jié)基因是指其編碼的某種RNA或蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)能夠?qū)ζ渌Y(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)或調(diào)控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正義基因包括上述的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。所述的反義基因是指與上述結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因編碼的RNA互補(bǔ)的RNA或DNA序列。所述的內(nèi)源基因是指來(lái)自宿主自身的基因，包括RNA或DNA 序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有編碼某種蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)功能， 包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，該序列與氣孔特異性啟動(dòng)子在正常情況不相結(jié)合。所述的小RNA是指分離自生物體的或人工合成的RNA序列片段，其長(zhǎng)度通常為20-26 個(gè)脫氧核苷酸或者在導(dǎo)入宿舍細(xì)胞后能夠被剪切成2046個(gè)脫氧核苷酸的RNA片段，它本身對(duì)生物體無(wú)毒或毒性極低。本發(fā)明中所述的轉(zhuǎn)化是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)胫参锛?xì)胞或植物組織的任何一種植物轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍等。本發(fā)明中所述的宿主細(xì)胞或宿主組織或宿主器官及其后代細(xì)胞是指所有植物細(xì)胞或植物組織或植物器官或由這些細(xì)胞、組織或器官通過(guò)組織分化或無(wú)性胚再生并且發(fā)育成熟的整體植株(包括種子)。術(shù)語(yǔ)“核酸序列，，或“核苷酸序列，，指含有天然存在的核苷酸或核苷單體的序列。 該序列也包括具有相似功能的非天然存在的單體或其部分的修飾的或取代的序列。術(shù)語(yǔ)“氣孔特異性啟動(dòng)子”是指能夠指導(dǎo)其控制下的基因僅僅在氣孔表達(dá)而在植體的其它組織不表達(dá)或按照常規(guī)方法檢測(cè)不到表達(dá)的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“具有75%或75%以上同源性的序列”是指與上述啟動(dòng)子的核苷酸序列相比有75%或75%以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，這些序列以基本相同的方式發(fā)揮作用并且能夠驅(qū)動(dòng)其下游基因的氣孔特異性表達(dá)，它們與上述啟動(dòng)子中序列的差異可能是由于局部結(jié)構(gòu)上的修飾或突變，包括人工突變和非人工突變。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以在分子生物學(xué)或基因工程實(shí)驗(yàn)指南，例如《Molecular Cloning)) (3rd Ed) (Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001)(以下簡(jiǎn)稱“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具體為在2XSSC，0. SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次。每次15min。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。煙草Ttl代表示由愈傷組織得到的轉(zhuǎn)基因植株及其無(wú)性系,T1表示Ttl代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株和無(wú)性系。實(shí)施例1、陸地棉氣孔特異啟動(dòng)子SLSP((ihSLSP)的克隆與分離1、陸地棉總DNA的提取材料取自陸地棉(Gossypium hirsutum)品種“邯鄲5833” (河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，嫩葉片l_2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取總DNA。取1_5 μ 1 DNA樣品， 用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度和純度，用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性。 將提取的DNA于-20°C保存。2、PCR擴(kuò)增與擴(kuò)增片段的回收設(shè)計(jì)并合成如下兩條引物(引物1和引物幻擴(kuò)增陸地棉氣孔特異性啟動(dòng)子，為了方便以后的克隆和構(gòu)建，在兩條引物的5'端分別加入了限制性內(nèi)切酶Hind III和BamHI 的識(shí)別序列位點(diǎn)(下列引物序列中的下劃線序列)引物 1:5' -AAGCTTACAACTTTTCTCTACCAATCA-3‘ (Hind ΠΙ)(序列 2)；引物 2 5 ‘ -GGATCCGCTAGAGAAAAATGGGAAGGTGAG-3 ‘ (BamH I)(序列 3)。以步驟1提取的棉花基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)反應(yīng)體系為模板DNA 800ng ； 10 XEx buffer 2 μ 1 ；dNTP 混合物(2. 5mM) 2 μ 1 ； ExTaqDNA Polymerase (5U/μ 1) 0· 5 μ 1 ；引物 1 (10 μ Μ) 2 μ 1 ；引物 2 (10 μ Μ) 2 μ 1 ；無(wú)菌重蒸餾水(SddH2O)補(bǔ)足至20 μ 1。PCR反應(yīng)程序先94°C預(yù)變性5min ；然后94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 Imin, 30個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)果如圖1所示，PCR反應(yīng)完成后，取15 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下快速用一次性刀片小心切下位于DNA標(biāo)記IOOObp左右的特異片段，用DNA片段回收試劑盒回收并純化(北京鼎國(guó)公司產(chǎn)品)，溶于50μ1 ddH20中，-20°C保存?zhèn)溆谩?、回收片段的亞克隆與測(cè)序?qū)⑸鲜霾襟E2回收的片段插入到載體pBS-T載體(北京天根公司產(chǎn)品)。將得到的重組質(zhì)粒(含有上述從陸地棉擴(kuò)增的片段)通過(guò)“凍融法”轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5ci 感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的DH5 α在表面涂有IPTG和Χ-gal的含氨芐青霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上于37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌落，接入氨芐青霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中于37°C過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD6tltl為0. 8時(shí)，離心收集菌體，按小量堿裂解法(《分子克隆》第三版)提取質(zhì)粒，用限制性酶Hind III和BamHI雙酶切后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小大約分別為3000bp (載體帶)和1000bp(目標(biāo)帶) 兩條帶。將酶切驗(yàn)證正確的克隆和由此克隆提取的質(zhì)粒送交商業(yè)測(cè)序公司測(cè)序。將測(cè)序正確的載體命名為pBS-GhSLSP，其中插入片段(上述大約IOOObp的目標(biāo)帶)命名為(ihSLSP。 測(cè)序結(jié)果如圖2所示，在5'端和3'端分別含有引物1和引物2的序列，表明pBS-GhSLSP 中確實(shí)含有上述由陸地棉擴(kuò)增的DNA片段(ihSLSP。(ihSLSP的核苷酸序列為序列表中序列1。實(shí)施例2、陸地棉氣孔特異性啟動(dòng)子((ihSLSP)驅(qū)動(dòng)⑶S基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建將pBS-GhSLSP用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I雙酶切后，用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，切取IOOObp左右的帶((ihSLSP)，用DNA片段回收試劑盒(北京鼎國(guó)公司產(chǎn)品)回收并純化，獲得(ihSLSP。將純化的(ihSLSP與經(jīng)過(guò)Hind III和BamH I雙酶切的植物表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒(原Clontech公司產(chǎn)品)的大片段(大約為13. 9kb)相連，得到重組質(zhì)粒。將所得到重組質(zhì)粒用“凍融法”(《分子克隆》第三版)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5a。轉(zhuǎn)化的DH5 α在含卡那霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上于37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取平板上生長(zhǎng)的單菌落，接入含卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中于37°C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD6tltl值0. 6-0. 8時(shí)，離心收集菌體，按上述小量堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶 HindIII和BamH I雙酶切后，在1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小分別約為 13.91Λ(ρΒΙ121載體帶)和IOOObp ((ihSLSP)兩條帶，并且進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將酶切和測(cè)序表明含有氣孔特異性啟動(dòng)子(^hSLSP片段和pBI121酶切得到的大片段的重組表達(dá)載體命名為 pBI-GhSLSP。在重組表達(dá)載體pBI-GhSLSP中的⑶S基因，需要?dú)饪滋禺悊?dòng)子(ihSLSP驅(qū)動(dòng)表達(dá)。所構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體PBI-GhSLSP的圖譜見圖3。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)(ihSLSP煙草的獲得和鑒定1、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子的鑒定用CaCl2法(《分子克隆》第三版)制備根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404和GV3101 (美國(guó)Life Technology公司產(chǎn)品)的感受態(tài)細(xì)胞。利用凍融法(《分子克隆》第三版)將實(shí)施例2所得的重組表達(dá)載體(pBI-GhSLSP)轉(zhuǎn)入制備的LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的 LBA4404細(xì)胞接種到含有鏈霉素(Mr) 100mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基，置于在暗處培養(yǎng)48-7池，挑取平板上的單菌落，接入含有Mr 100mg/L和卡那霉素 50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基，在振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的濃度達(dá)到OD6tltl值0. 4-0. 6時(shí)， 取少量菌液(1. 5-aiil)，按上述小量堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I雙酶切鑒定，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小大約分別為13. 91Λ(載體帶)和IOOObp ((ihSLSP)兩條帶，并測(cè)序鑒定。將酶切和測(cè)序鑒定表明含有(ihSLSP片段的轉(zhuǎn)入pBI-GhSLSP的LBA4404陽(yáng)性克隆命名為 LBA4404/pBI-GhSLSP。2、轉(zhuǎn)基因煙草的獲得1)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備挑取攜帶植物表達(dá)載體pB I-GhSLSP的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落(LBA4404/ pB I-GhSLSP)，接種于5ml含Mr 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)，取活化的農(nóng)桿菌液，按1 100的比例加入到含乂『100mg/L和Kan 50mg/L的 YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl值為0. 4-0. 6 ；5000rpm離心5min，收集菌體；用1/2MS0 液體培養(yǎng)基(MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+肌醇0. lg/L+蔗糖30g/L，pH5. 80)洗滌菌體一次，并將其稀釋到離心前菌液3倍體積的1/2MS液體培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備侵染用。2)煙草的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化植株的再生煙草的轉(zhuǎn)化根據(jù)葉盤法(HorschRB 等，1985，kience，227 :1229-1231)進(jìn)行。具體操作為選取約30天苗齡的煙草(品種“NC89”，種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院)無(wú)菌苗，切下鮮嫩濃綠的葉片，用直徑9mm的打孔器制取葉盤外植體；將新制備的外植體投入上步1) 已準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，侵染15min ；取出葉盤，用高壓滅菌的吸水紙吸除葉盤表面殘余的農(nóng)桿菌菌液，置于固體再生培養(yǎng)基(MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+肌醇0. lg/L+BA2. Omg/L+IAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉0. 7%,pH5. 8)上暗處共培養(yǎng)2天；將共培養(yǎng)的葉盤轉(zhuǎn)到含有羧芐青霉素(Carb) 500mg/L和Kan 50mg/L的固體再生培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每隔2_3周更換一次培養(yǎng)基，并逐漸降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽長(zhǎng)到1_1. 5cm時(shí)，將其切下?lián)Q到含有Carb 200mg/L和Kan50mg/L的固體生根培養(yǎng)基(MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+肌醇0. Ig/ L+IAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉0. 7%，pH5. 80)上誘導(dǎo)生根，獲得完整的具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因煙草Ttl代植株。3)轉(zhuǎn)基因煙草Ttl代植株的分子鑒定對(duì)步驟2)和3)得到的煙草Ttl代植株進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)SDS法和CTAB (《分子克隆》第三版)提取上述得到的具有Kan抗性基因的煙草Ttl代植株和未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照株(煙草品種“NC89”)的葉片基因組DNA，用氣孔特異性啟動(dòng)子(ihSLSP兩端特異性引物對(duì)(弓丨物 1和引物2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草Ttl代(圖4)擴(kuò)增得到大小約為IOOObp 的目標(biāo)帶，而未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株在相應(yīng)位置則沒有擴(kuò)增出此目的片段。這一結(jié)果初步表明氣孔特異性啟動(dòng)子(^hSLSP及其目標(biāo)基因已整合到煙草基因組中。實(shí)施例4、利用組織化學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中⑶S基因的表達(dá)，確定(ihSLSP啟動(dòng)子活性和特異性轉(zhuǎn)基因煙草⑶S基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè)按照J(rèn)efferson RA[1987, Plant Mol Biol Rep, 5 (4) :387-405]的方法進(jìn)行。將轉(zhuǎn)基因煙草Ttl代植株及其后代的新鮮的根、莖、 葉(葉圓盤)、花萼、花瓣、花絲、子房、柱頭和花藥在GUS染色液(X-GLuc溶液)中于37°C 染色12-1他，然后經(jīng)脫色液(乙醇冰醋酸=3 1)脫色后，在顯微鏡下觀測(cè)樣品并拍照。 未轉(zhuǎn)基因的受體品種植株同樣染色作為對(duì)照。煙草葉圓盤取自近葉柄處。轉(zhuǎn)入每個(gè)表達(dá)載體的煙草Ttl代植株和擬南芥T1植株均取10株以上的獨(dú)立轉(zhuǎn)化單株。轉(zhuǎn)基因Ttl代煙草的GUS染色的結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株(CK)的各個(gè)組織和器官都不能染色，但轉(zhuǎn)(^hSLSP的葉片保衛(wèi)細(xì)胞被深度染色，葉肉細(xì)胞、葉脈和表皮毛的染色較弱(圖5)。隨機(jī)取Ttl轉(zhuǎn)基因煙草的種子，用5%次氯酸鈉表面消毒后接種在含Kan 100mg/L 的固體MS培養(yǎng)基表面，在暗處發(fā)芽，發(fā)芽后光照條件改為1 光照/ 黑暗，溫度為對(duì)士 1°C，在此條件下篩選轉(zhuǎn)基因后代。在Kan抗性苗呈現(xiàn)3-4片真葉時(shí)，隨機(jī)取10株以上進(jìn)行整株⑶S染色。T1煙草幼苗的⑶S染色顯示，子葉和真葉的氣孔都被染成⑶S藍(lán)色， 幼根中軸也呈現(xiàn)弱的藍(lán)色(圖6)實(shí)施例5、氣孔特異性啟動(dòng)子的最短活性片段的分析對(duì)氣孔特異性啟動(dòng)子的最短活性片段的分析采用的是(ihSLSP啟動(dòng)子片段5'端和/或3'端刪除分析法。為了解析氣孔特異性啟動(dòng)子(^hSLSP的最短活性片段，我們?cè)O(shè)計(jì)了 4 個(gè) 5'端刪除片段(GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP-F4、GhSLSP-ra)和 2 個(gè) 3'端刪除片段((ihSLSP-SH和(ihSLSPF2-SH)。這6個(gè)部分片段間的關(guān)系及大小如圖7所示。1、氣孔特異性啟動(dòng)子5'端和/或3'端刪除片段的克隆與分離
根據(jù)(ihSLSP全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)并合成以下5條引物，其中上游引物(也稱5'端引物)4條(F2-F5)，下游引物(也稱3'端引物)1條(R2)。為了方便以后的克隆和構(gòu)建，在 4條上游引物(F2-F5)的5'端加入了限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別序列位點(diǎn)，在1條下游引物(R2)的3'端加入了限制性內(nèi)切酶BamH I的識(shí)別序列位點(diǎn)(下列引物序列中的下劃線序列)。這些引物如下F25'-CAATATGAAAAAGCTTGAGTGC-3 ‘(序列 4)
F35'-AAGCTTATTTTGGAAGATGAC-3 ‘(序列 5)
F45'-AAGCTTCTTTACATGCATCATGTGATCG-3 ‘(序列 6)
F55'-AAGCTTATCGTGGGGGACCCGAAACTTGGCATAC-3 ‘(序列 7)
R25'-GGATCCGTGGTTGGATGAGA CT-3 ‘(序列 8)。
按照實(shí)施例1所述方法，以實(shí)施例1鑒定正確的含有(^hSLSP全長(zhǎng)序列的
PBS-GhSLSP為模板，將上列4條上游引物(F2-F5)分別與引物2 (序列表中序列3)組合作為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到4條不同長(zhǎng)度的5'端刪除啟動(dòng)子片段；分別以全長(zhǎng)上游引物 (引物1，即序列表中序列2)或上述F2(序列4)，與R2(序列8)組合作為引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到2條不同長(zhǎng)度的3'端刪除啟動(dòng)子片段。圖11是以pBS-GhSLSP重組質(zhì)粒DNA為模板的PCR產(chǎn)物亞克隆的酶切鑒定圖(Hindlll+BamHI雙酶切)。對(duì)得到的啟動(dòng)子片段進(jìn)行回收。按照實(shí)施例1步驟3所述的方法進(jìn)行回收片段的亞克隆與測(cè)序。所得重組載體依照含有啟動(dòng)子片段的不同分別命名為pBS-GhSLSPF2、 pBS-GhSLSPF3、pBS_GhSLSPF4、pBS_GhSLSPF5、pBS-GhSLSP-SH、pBS_GhSLSP_SH2。測(cè)序結(jié)果表明以上6份質(zhì)粒中均含有(ihSLSP啟動(dòng)子5'端或3'端刪除后不同長(zhǎng)度后的片段。 GhSLSP-F2的核苷酸序列為序列表中序列1的第355-1005位，命名為(ihSLSP-F2啟動(dòng)子；(ihSLSP-F3的核苷酸序列為序列表中序列1的第410-1005位，命名為(ihSLSP-F3啟動(dòng)子；(ihSLSP-F4的核苷酸序列為序列表中序列1的第520-1005位，命名為(ihSLSP-F4啟動(dòng)子；(ihSLSP-F5的核苷酸序列為序列表中序列1的第538-1005位，命名為(ihSLSP-F5啟動(dòng)子fhSLSP-SH的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-643位，命名為(ihSLSP-SH啟動(dòng)子； GhSLSPF2-SH的核苷酸序列為序列表中序列1的第355-643位，命名為(ihSLSPF2-SH啟動(dòng)子。2、氣孔特異啟動(dòng)子各片段驅(qū)動(dòng)⑶S基因達(dá)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建氣孔特異啟動(dòng)子各片段驅(qū)動(dòng)GUS基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法同實(shí)施例2， 即將步驟 1 所得的 6 份質(zhì)粒(pBS-GhSLSPF2 至 pBS_GhSLSPF5、pBS-GhSLSP-SH 和 pBS-GhSLSPF2-SH)分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I雙酶切后，分別得到6個(gè)氣孔特異啟動(dòng)子片段，將這些片段回收后分別與經(jīng)過(guò)Hind III和BamH I雙酶切的植物表達(dá)載體PBI121的大片段(大約為13.91Λ)相連，得到重組質(zhì)粒。按照實(shí)施例2所述方法轉(zhuǎn)化，搖菌，小量堿裂解法提取質(zhì)粒，再分別用步驟1中各自克隆時(shí)所用的特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖8所示。PCR鑒定后再進(jìn)行測(cè)序鑒定，將PCR和測(cè)序表明含有預(yù)先設(shè)計(jì)的氣孔特異啟動(dòng)子片段(GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP_F4、GhSLSP_F5、GhSLSP-SH 或 GhSLSPF2-SH)與pBI121酶切得到的大片段用T4連接酶連接起來(lái)，得到重組表達(dá)載體，分別命名為 pBI-(ihSLSPF2、pBI-GhSLSPF3, pBI_GhSLSPF4、pBI-GhSLSPF5, pBI-GhSLSP-SH, pBI-GhSLSPF2-SH(簡(jiǎn)稱為 GhSLSPX-⑶S ；X = F2、F3、F4、F5、-SH 或 F2-SH)。
在上述6個(gè)植物表達(dá)載體中，⑶S基因由各氣孔特異啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)表達(dá)。3、轉(zhuǎn)氣孔特異性啟動(dòng)子片段煙草的獲得按照實(shí)施例3的方法分別將上述(ihSLSPX-GUS系列6個(gè)植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草(品種“NC89”，種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院)中，從而篩選獲得轉(zhuǎn)基因的煙草Ttl代植株。分別提取轉(zhuǎn)各表達(dá)載體的煙草Ttl代植株基因組DNA，用引物F2-F5 (序列分別為序列4、序列5、序列6、序列7)中任一個(gè)與引物2 (序列3)組成引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或者使用引物1(序列幻或引物F2(序列4)與引物R2(序列8)組成引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而分別檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的煙草中是否轉(zhuǎn)入了相應(yīng)的啟動(dòng)子。接著，將檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行 ⑶S基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè)(按照實(shí)施例4的方法)詳見步驟5。4、轉(zhuǎn)(ihSLSPX-GUS系列重組載體的煙草Ttl代植株中⑶S基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè)按照實(shí)施例4的方法分別對(duì)上述PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)(ihSLSPX-GUS系列重組表達(dá)載體的煙草Ttl代植株進(jìn)行⑶S基因表達(dá)的組織化學(xué)染色，每個(gè)啟動(dòng)子片段(ihSLSPX-GUS陽(yáng)性的植株均隨機(jī)取樣3-5個(gè)獨(dú)立單株，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的煙草為對(duì)照。轉(zhuǎn)基因煙草Ttl代的染色結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，(ihSLSP-F2(圖9F2)、 GhSLSP-F3 (圖9F!3)都能夠驅(qū)動(dòng)⑶S基因在保衛(wèi)細(xì)胞中特異性地強(qiáng)表達(dá)，盡管在葉肉細(xì)胞中似乎有微量的表達(dá)；(ihSLSP-F4能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在保衛(wèi)細(xì)胞完全特異性表達(dá)(圖9F4)，只是表達(dá)強(qiáng)度比(ihSLSP-F3要弱一些；(ihSLSP-F5能夠驅(qū)動(dòng)⑶S基因在保衛(wèi)細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在葉肉細(xì)胞的表達(dá)相對(duì)較弱(圖9F5) ；(ihSLSP-SH驅(qū)動(dòng)的GUS基因在保衛(wèi)細(xì)胞、葉肉和葉脈中都有表達(dá)，盡管在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)稍強(qiáng)(圖9F-SH) ；(ihSLSPF2-SH驅(qū)動(dòng)的⑶S基因在保衛(wèi)細(xì)胞中有微量表達(dá)，而且只能在局部有GUS著色(圖9F2-SH)。5、轉(zhuǎn)(ihSLSPX-GUS系列重組載體的煙草T1代植株中⑶S基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè)取GhSLSP-F2、GhSLSP_F5和GhSLSP-SH轉(zhuǎn)基因煙草Tci植株的種子，用5%次氯酸鈉表面消毒后接種在含Kan 100mg/L的固體MS培養(yǎng)基表面，在M 士 1 °C暗處發(fā)芽，發(fā)芽后光照條件改為16h光照/8h黑暗，溫度為M±1°C，在此條件下篩選轉(zhuǎn)基因后代。在Kan抗性苗呈現(xiàn)3-4片真葉時(shí)，每個(gè)構(gòu)建隨機(jī)取10株以上進(jìn)行整株GUS染色。T1代煙草幼苗的GUS 染色顯示(圖10)，轉(zhuǎn)(ihSLSP-F2的T1代煙草子葉和真葉的氣孔都被染成很深的⑶S藍(lán)色， 幼根中軸也呈現(xiàn)弱的藍(lán)色(圖10M)；轉(zhuǎn)(ihSLSP-F5的T1代煙草子葉和真葉的氣孔都被染成淺的GUS藍(lán)色，幼根未見染色(圖10F5) ’轉(zhuǎn)(ihSLSP-SH的T1代煙草幼苗子葉和真葉的氣孔僅僅有部分能被GUS染色，而去染色成極淺；幼根沒有觀察到染色(圖10F-SH)。上述的實(shí)施例結(jié)果表明并且確證，本發(fā)明所提供的棉花氣孔特異性啟動(dòng)子(ihSLSP 及其 5 ‘端和 3 ‘端刪除后的啟動(dòng)子((ihSLSP-F2、GhSLSP-F3, GhSLSP-F4, GhSLSP-F5, GhSLSP F-SH和(ihSLSPF2-SH)不僅具有良好的氣孔特異性，而且該特異性能夠穩(wěn)定地傳遞給后代。因此，本發(fā)明所提供的分離自陸地棉的啟動(dòng)子(^hSLSP是一個(gè)穩(wěn)定、驅(qū)動(dòng)力和特異性都很強(qiáng)的氣孔特異性啟動(dòng)子。
1權(quán)利要求
1.DNA分子，是下述a)或b)或c)的DNA片段a)3'端至少含有序列表中序列1的第538-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第538 位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為468至1005bp的任意一個(gè)DNA片段；所述DNA分子具有啟動(dòng)子功能；b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段；c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列1的第1005位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為下述1)_3)中任一種1)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第520-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第520位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為486 至1005bp的任意一個(gè)DNA片段；2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第410-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第410位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為596 至1005bp的任意一個(gè)DNA片段；3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第355-1005位核苷酸序列，并且從序列1的第355位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為651 至1005bp的任意一個(gè)DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為下述 al)-a5)中任一種al)核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子； a2)核苷酸序列為序列表中序列1的第355-1005位核苷酸所示DNA分子； a3)核苷酸序列為序列表中序列1的第410-1005位核苷酸所示DNA分子； a4)核苷酸序列為序列表中序列1的第520-1005位核苷酸所示DNA分子； a5)核苷酸序列為序列表中序列1的第538-1005位核苷酸所示DNA分子。
5.DNA分子，是下述d)或e)或f)的DNA片段d)3'端至少含有序列表中序列1的第355-643位核苷酸序列，并且從序列1的第355 位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為觀9至643bp的任意一個(gè)DNA片段；所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列1的第643位；e)與d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段；f)在嚴(yán)格條件下與d)或e)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為下述bl)或1^2) bl)核苷酸序列為序列表中序列1的第1-643位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列為序列表中序列1的第355-643位核苷酸所示DNA分子。
7.含有權(quán)利要求1-6中任一所述DNA分子的遺傳材料，或獲得權(quán)利要求1-6中任一所述DNA分子的一個(gè)引物對(duì)；所述遺傳材料為表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)為下述cl)-c7)中的任一對(duì)cl)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c2)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列4所示DNA片段組成的引物對(duì)；c3)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7_21位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c4)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第7- 位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c5)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7_34位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c6)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對(duì)；c7)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列4所示DNA片段組成的引物對(duì)。
9.權(quán)利要求1-6中任一所述DNA分子在植物中啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物是陸生植物，優(yōu)選是雙子葉植物，更優(yōu)選是煙草；所述表達(dá)為氣孔特異性表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了植物氣孔特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子具有下述核苷酸序列的核酸1)序列表中的序列1；2)將序列表中序列1的核苷酸序列經(jīng)過(guò)5’端刪除和/或3’端刪除后，并且仍然具有氣孔特異性啟動(dòng)子功能的核苷酸序列；3)將1)或2)中核苷酸序列的一個(gè)或幾個(gè)脫氧核苷酸殘基經(jīng)過(guò)取代、添加或缺失，且具有氣孔特異性啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子不僅具有良好的氣孔特異性，而且該特異性能夠穩(wěn)定地傳遞給后代。這不僅對(duì)氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的分子生物學(xué)研究和氣孔運(yùn)動(dòng)等的理論研究具有重要的意義，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率進(jìn)而提高產(chǎn)量和品質(zhì)等方面具有重大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102367439SQ20111033693
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者肖興國(guó), 韓蕾 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)