專利名稱：球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微藻培養(yǎng)液，尤其是涉及一種球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法。
背景技術(shù)：
在赤潮的微生物防治研究領(lǐng)域中，藻液中細(xì)菌的存在對不可培養(yǎng)的溶藻微生物的純化，以及溶藻微生物和殺藻物質(zhì)的殺藻機(jī)制的研究帶來了極大困難，因此希望能夠通過對藻液進(jìn)行除菌處理來排除藻際環(huán)境細(xì)菌的干擾。目前報道的藻液除菌方法主要有①顯微鏡下挑取單個藻細(xì)胞，用無菌的藻培養(yǎng)基進(jìn)行反復(fù)洗滌，然后接種于藻培養(yǎng)基中，該法操作較為麻煩，需要一定的藻類分離經(jīng)驗(yàn)， 同時單個藻細(xì)胞的培養(yǎng)難度較大；②利用化學(xué)物質(zhì)殺滅細(xì)菌，包括十二烷基磺酸鈉(SDS) 等去垢劑，但化學(xué)物質(zhì)同時也會對藻造成傷害；③利用抗生素特異性的殺死細(xì)菌，這是最為簡便且廣泛使用的方法，其缺點(diǎn)是不同抗生素其作用的細(xì)菌不同，有些抗生素并不能完全殺死細(xì)菌，有些抗生素同時也會對藻造成傷害。為了測定SDS和抗生素對藻的抑制作用，需要一種快速而準(zhǔn)確的藻細(xì)胞密度測定方法。目前藻細(xì)胞計數(shù)的方法主要有(1.胡先文，董元彥，張新萍，葉發(fā)兵，可見分光光度法測定水華魚腥藻.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002 (03) :295-297 ；2.侯建軍，黃邦欽，戴相輝，赤潮藻細(xì)胞計數(shù)方法比較研究.中國公共衛(wèi)生，2004 (08) ；3.董正臻，董振芳，丁德文，快速測定藻類生物量的方法探討.海洋科學(xué)，2004 (11) =1-2,5 ；4. Imai, I.，Y. Ishida,K. Sakaguchi， Y. Hata, Algicidal marine bacteria isolated from northern Hiroshima Bay, Japan. Fisheries science. Tokyo, 1995. 61 (4) :628-636)光學(xué)顯微鏡直接計數(shù)法、可見光分光光度法、熒光分光光度法、葉綠素a測定法、流式細(xì)胞計數(shù)法、庫爾特計數(shù)法和活體熒光檢測技術(shù)等。顯微計數(shù)法工作量大，人為誤差也較大；葉綠素a含量測定法耗費(fèi)時間長；流式細(xì)胞計數(shù)法樣品需經(jīng)過一定的前處理，摸索出適合的儀器參數(shù)，同時流式細(xì)胞儀價格也較昂貴；庫爾特計數(shù)線性范圍較小，適用于藻密度較小時；活體熒光檢測技術(shù)一次只能對一個樣品進(jìn)行測定，多樣品時更換樣品的操作同樣繁瑣。利用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定的熒光光度法和分光光度法一次可以測定96個樣品，滿足快速測定的要求。SDS裂解細(xì)胞后產(chǎn)生的白色沉淀對吸光值的影響較大，對熒光值影響較小，且用熒光光度法測定的SDS處理藻液的藻細(xì)胞密度結(jié)果與肉眼觀察結(jié)果一致；抗生素處理藻液后不產(chǎn)生白色沉淀，不會干擾吸光值，且用分光光度法測定的抗生素處理藻液的藻細(xì)胞密度結(jié)果與肉眼觀察結(jié)果一致；因此本發(fā)明分別選用熒光光度法和分光光度法測定 SDS和抗生素處理藻液的藻細(xì)胞密度。此外，在各種除菌方法中，最重要的一步是如何以有效、準(zhǔn)確、可靠的手段來證實(shí)所獲得的體系內(nèi)是否真的無菌。報道的許多方法只是利用各種培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)， 一旦發(fā)現(xiàn)沒有細(xì)菌生長，就認(rèn)為是無菌的，考慮到大多數(shù)的微生物都是未可培養(yǎng)的，這個檢驗(yàn)結(jié)果并不可信；另外還有報道分別利用表面熒光顯微鏡觀察以及對真細(xì)菌和古細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增來檢驗(yàn)細(xì)菌是否存在(5. Su, J. Q.，X. R. Yang, Τ. L. Zheng, H. S. Hong,An efficient method to obtain axenic cultures of Alexandrium tamarense—a PSP-producing dinoflagellate. Journal of Microbiological Methods,2007. 69(3) 425-430.)。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)真細(xì)菌16S rDNA保守性引物可以擴(kuò)增出球形棕囊藻的線粒體DNA片段，因此不能用該方法來檢測藻液中是否有菌存在。于是本發(fā)明同時利用微生物培養(yǎng)和表面熒光顯微鏡觀察的方法來檢測經(jīng)除菌處理的藻液及其傳代藻液中是否有菌存在，兩種檢測方法一起使用使檢驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法。本發(fā)明的具體步驟是1)取生長至對數(shù)期的藻液，離心，去上清；2)用f/2培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞，離心，去上清，重復(fù)此步驟2次，然后用f/2培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞；3)加入SDS和8種抗生素，所述8種抗生素為克林霉素、阿奇霉素、慶大霉素、卡那
霉素、鏈霉素、頭孢霉素、氨芐青霉素和利福霉素；4)光照培養(yǎng)，期間取處理藻液，離心，去上清，用f/2培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞，再離心， 去上清，除去殘留的SDS和抗生素，然后轉(zhuǎn)接到f/2培養(yǎng)基中，再光照培養(yǎng)；5)選取存活的、經(jīng)SDS和抗生素處理的轉(zhuǎn)接藻液，待其長到對數(shù)期后，利用微生物培養(yǎng)和表面熒光顯微鏡觀察的方法檢測其中是否有細(xì)菌存在。在步驟1)中，所述離心的條件可為2000rpm離心5min。在步驟2)中，所述離心的條件可為2000rpm離心5min。在步驟3)中，所述加入SDS和8種抗生素，最好是同時加入；所述SDS的終濃度可為0. 0025%，所述克林霉素的終濃度可為5mg/L，阿奇霉素的終濃度可為50mg/L，慶大霉素的終濃度可為100mg/L，卡那霉素的終濃度可為100mg/L，鏈霉素的終濃度可為1000mg/L， 頭孢霉素的終濃度可為500mg/L，氨芐青霉素的終濃度可為1000mg/L，利福霉素的終濃度可為lmg/L。在步驟4)中，所述光照培養(yǎng)的溫度可為20°C，光照培養(yǎng)的時間可為5天；所述離心和再離心的條件可為2000rpm離心5min。在步驟5)中，所述選取存活的、經(jīng)SDS和抗生素處理的轉(zhuǎn)接藻液，最好是選取存活的、經(jīng)SDS和抗生素處理最長時間的轉(zhuǎn)接藻液，所述處理最長時間可為5天。本發(fā)明利用無菌的f/2培養(yǎng)基對球形棕囊藻細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌，以去除部分細(xì)菌。本發(fā)明通過使蛋白質(zhì)變性來裂解細(xì)菌，從而除去藻液中的細(xì)菌，但同時它對藻細(xì)胞也有殺滅作用。因此本發(fā)明對球形棕囊藻藻液進(jìn)行除菌前，先測試其對SDS的耐受性，選擇較高濃度但抑藻率又不高于50%的SDS濃度用于藻液除菌，以盡可能除去細(xì)菌，同時又對藻的傷害不會太大。本發(fā)明采用的8種抗生素中，克林霉素、阿奇霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素和利福霉素通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成達(dá)到殺菌作用，頭孢霉素和氨芐青霉素通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成達(dá)到殺菌作用。由于一些抗生素對藻也有殺滅作用，因此本發(fā)明對球形棕囊藻藻液進(jìn)行除菌前，先測試其對各種抗生素的耐受性，選擇較高濃度但抑藻率又不高于 50%的抗生素濃度用于藻液除菌，以盡可能除去細(xì)菌，同時又對藻的傷害不會太大。本發(fā)明提供了一種新的操作簡單的藻液除菌方法，即通過重復(fù)洗滌、SDS和8種抗生素同時對藻液進(jìn)行處理，以獲得無菌的球形棕囊藻培養(yǎng)體系。有文獻(xiàn)報道利用高濃度的SDS對藻液進(jìn)行短時間除菌處理，但高濃度的SDS對藻的傷害很大；而本發(fā)明通過測試藻對SDS的耐受性，選擇了低濃度的SDS對藻液進(jìn)行長時間處理，對藻的傷害較小，亦能較好的除去藻液中的細(xì)菌。文獻(xiàn)報道利用抗生素除菌的方法是先分離、純化出藻液中的各種可培養(yǎng)細(xì)菌，測試幾種抗生素對這些細(xì)菌的抑制效果，然后選擇對這些細(xì)菌有抑制作用的抗生素對藻液進(jìn)行除菌處理，但是這些抗生素不一定對藻液中的不可培養(yǎng)細(xì)菌也具有殺滅作用，且該方法操作較繁瑣；而本發(fā)明選擇了多種殺菌效果較強(qiáng)的廣譜抗生素用于藻液除菌，通過測試藻對這些抗生素的耐受性，選擇了對藻傷害不大的較高的抗生素濃度對藻液進(jìn)行長時間處理，該方法操作簡便，避免了細(xì)菌分離及測試對各種抗生素的敏感性等的繁瑣操作，且高濃度抗生素的長時間處理具有很好的除菌效果。利用本發(fā)明的方法對藻液進(jìn)行除菌，操作簡便且效率高，從測試藻對SDS和抗生素的耐受性到除菌處理結(jié)束只需10天的時間，即可成功獲得無菌的藻培養(yǎng)體系。
圖1為除菌處理前的球形棕囊藻藻液經(jīng)STOR green I染色后，在藍(lán)色熒光激發(fā)下的熒光顯微照片。在圖1中，細(xì)菌(B)被染成亮綠色，藻細(xì)胞(A)則由于自身的紅色熒光和染料的綠色熒光疊加成為橙色。圖2為除菌處理后的球形棕囊藻藻液經(jīng)STOR green I染色后，在藍(lán)色熒光激發(fā)下的熒光顯微照片。在圖2中，只有藻細(xì)胞(A)而沒有細(xì)菌，表明在除菌處理后的藻液中沒有細(xì)菌。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1 測試球形棕囊藻對SDS的耐受性(1)在M孔細(xì)胞板中分裝生長至對數(shù)期的球形棕囊藻藻液，每孔分裝1. SmL ；(2)用f/2培養(yǎng)基將SDS(10%，m/v)稀釋至一系列濃度梯度，取200 μ L加入1. 8mL 藻液中，使藻液中 SDS 終濃度分別為0. 01%,0. 005%,0. 0025 %,0. 001%,0. 0005% (m/ ν) ,200 μ L f/2培養(yǎng)基加入1. SmL藻液中作為對照，每個處理濃度設(shè)置3個重復(fù)；(3)20°C光照培養(yǎng)5天；(4) 5天后，每孔混勻，從中取200 μ L藻液于96孔酶標(biāo)板中，200 μ L藻培養(yǎng)基作為空白對照，用酶標(biāo)儀檢測它們的熒光值(激發(fā)波長440nm，發(fā)射波長680nm)；(5)用下面的公式計算抑藻率
抑藻率=■組突光I處理組突光值χ100% ; 對照組熒光值(6)選擇抑藻率低于50%的SDS濃度用于藻液的除菌；
(7) SDS對藻液的抑制效果見表1。用于球形棕囊藻藻液除菌的SDS終濃度為0. 0025%。表ISDS對球形棕囊藻的抑制效果
權(quán)利要求
1.球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于其具體步驟是1)取生長至對數(shù)期的藻液，離心，去上清；2)用m培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞，離心，去上清，重復(fù)此步驟2次，然后用m培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞；3)加入十二烷基磺酸鈉和8種抗生素，所述8種抗生素為克林霉素、阿奇霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢霉素、氨芐青霉素和利福霉素；4)光照培養(yǎng)，期間取處理藻液，離心，去上清，用f/2培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞，再離心，去上清，除去殘留的十二烷基磺酸鈉和抗生素，然后轉(zhuǎn)接到f/2培養(yǎng)基中，再光照培養(yǎng)；5)選取存活的、經(jīng)十二烷基磺酸鈉和抗生素處理的轉(zhuǎn)接藻液，待其長到對數(shù)期后，利用微生物培養(yǎng)和表面熒光顯微鏡觀察的方法檢測其中是否有細(xì)菌存在。
2.如權(quán)利要求1所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于在步驟1)中，所述離心的條件為2000rpm離心5min。
3.如權(quán)利要求1所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于在步驟幻中，所述離心的條件為2000rpm離心5min。
4.如權(quán)利要求1所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于在步驟幻中，所述加入十二烷基磺酸鈉和8種抗生素，是同時加入。
5.如權(quán)利要求1所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于在步驟幻中，所述十二烷基磺酸鈉的終濃度為0. 0025%，所述克林霉素的終濃度為5mg/L，阿奇霉素的終濃度為50mg/L，慶大霉素的終濃度為100mg/L，卡那霉素的終濃度為100mg/L，鏈霉素的終濃度為1000mg/L，頭孢霉素的終濃度為500mg/L，氨芐青霉素的終濃度為1000mg/L，利福霉素的終濃度為lmg/L。
6.如權(quán)利要求1所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于在步驟4)中，所述光照培養(yǎng)的溫度為20°C，光照培養(yǎng)的時間為5天。
7.如權(quán)利要求1所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于在步驟4)中，所述離心和再離心的條件為2000rpm離心5min。
8.如權(quán)利要求1所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于在步驟幻中，所述選取存活的、經(jīng)十二烷基磺酸鈉和抗生素處理的轉(zhuǎn)接藻液，是選取存活的、經(jīng)十二烷基磺酸鈉和抗生素處理最長時間的轉(zhuǎn)接藻液。
9.如權(quán)利要求8所述的球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，其特征在于所述處理最長時間為5天。
全文摘要
球形棕囊藻培養(yǎng)液的除菌方法，涉及一種微藻培養(yǎng)液。取生長至對數(shù)期的藻液，離心，去上清；用f/2培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞，離心，去上清，重復(fù)2次，用f/2培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞；加入SDS和抗生素，抗生素為克林霉素、阿奇霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢霉素、氨芐青霉素和利福霉素；光照培養(yǎng)，期間取處理藻液離心去上清，用f/2培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞，再離心去上清，除去殘留的SDS和抗生素，轉(zhuǎn)接到f/2培養(yǎng)基中，再光照培養(yǎng)；選取存活的、經(jīng)SDS和抗生素處理的轉(zhuǎn)接藻液，待其長到對數(shù)期后，檢測其中是否有細(xì)菌存在。操作簡便，避免細(xì)菌分離及測試對抗生素的敏感性等的繁瑣操作，且高濃度抗生素的長時間處理具有很好除菌效果。
文檔編號C12N1/12GK102391954SQ20111032930
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者周艷艷, 蘇建強(qiáng), 鄭天凌, 鄭小偉, 黃麗萍 申請人:廈門大學(xué)