用于在乳酸菌中制備載脂蛋白基因產(chǎn)物的組合物和方法
【專利摘要】本
【發(fā)明內(nèi)容】
涉及用于在乳酸菌中制備重組載脂蛋白的組合物和方法。所述方法制備的重組載脂蛋白包括但：ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V以及ApoE的前原載脂蛋白形式；人類ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV以及ApoE的前體形式和成熟形式；以及活性多晶形式、異構(gòu)形式、變體和突變體以及截短形式，其中最常見的是ApoA-IM(APOA-IM)和ApoA-Ip(ApoA-Ip)。本
【發(fā)明內(nèi)容】
提供了表達載體、包含所述表達載體的宿主細胞以及使用所述載體在不產(chǎn)生內(nèi)毒素的細菌例如乳酸菌中制備感興趣的載脂蛋白的方法。
【專利說明】用于在乳酸菌中制備載脂蛋白基因產(chǎn)物的組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)計乳酸菌生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為用于在乳酸菌中制備載脂蛋白基因產(chǎn)物的組合物和方法
【背景技術(shù)】
[0002]循環(huán)膽固醇通過兩種主要的膽固醇載體V氐密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)來運輸。認為LDL負責(zé)從肝臟(在其中它被合成或獲自食物來源)運輸膽固醇至機體的肝外組織。認為血漿HDL顆粒作為組織膽固醇的清道夫(scavengers)在膽固醇調(diào)節(jié)中起主要作用。
[0003]動脈粥樣硬化是一種進行性疾病，其特征為動脈壁中膽固醇積聚。動脈粥樣硬化病變中沉積的脂質(zhì)主要來源于血漿LDL，因此，通常將LDL稱為“壞”膽固醇。相比之下，HDL血清水平與冠心病負相關(guān)，且因此，認為高血清水平的HDL是負危險因素。因此，通常將HDL稱為“好”膽固醇。HDL的保護機制的最新研究集中于HDL的主要組分一載脂蛋白A-1 (ApoA-1)。高血漿水平的ApoA-1與冠心病的缺無或減輕有關(guān)(Maciejko等，1983，NEnglJMed 309:385-89 ;Sedlis 等，1986，Circulation73:978-84)。然而，考慮到低的制備總產(chǎn)率，ApoA-1的治療用途和ApoA-1的已知變體以及重構(gòu)的HDL受治療給藥所需的大量載脂蛋白和蛋白質(zhì)制備的成本 限制。因此，需要開發(fā)用于制備可用于治療和/或預(yù)防冠狀動脈中膽固醇積聚的ApoA-1的可選方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本
【發(fā)明內(nèi)容】
提供了用于制備無內(nèi)毒素的重組載脂蛋白的組合物和方法?？墒褂帽疚乃龇椒ㄖ苽涞闹亟M載脂蛋白包括但不限于:ApoA-1、ApoA-1I, ApoA-1V, ApoA-V以及ApoE的前原載脂蛋白形式；人類ApoA-1、ApoA-11、ApoA-1V以及ApoE的前體形式和成熟形式；以及活性多晶形式、異構(gòu)形式、變體和突變體以及截短形式，其中最常見的是ApoA-1M(APOA-1M)和 ApoA-1p (ApoA-1p)。
[0005]在某些方面，本
【發(fā)明內(nèi)容】
提供了表達載體、包含所述表達載體的宿主細胞以及使用所述載體在不產(chǎn)生內(nèi)毒素的細菌例如乳酸菌中制備感興趣的載脂蛋白的方法。合適的乳酸菌包括但不限于乳球菌亞種(Lactococcusspp.)、鏈球菌亞種(Streptococcusspp.)、乳桿菌亞種(iactobacillus spp.)、明串珠菌亞種(ieuconostocspp.)、片球菌亞種(Prediococcusspp.)、短桿菌亞種(Brevibacteriumspp.)以及丙酸桿菌亞種(Propionibacteriumspp.)。合適的調(diào)控核苷酸序列與編碼載脂蛋白的核苷酸編碼序列操作性連接以在乳酸菌中表達載脂蛋白。調(diào)控核苷酸序列包括但不限于組成型啟動子和可調(diào)節(jié)(即誘導(dǎo)型)的啟動子。在某些實施方案中，調(diào)控序列包括乳酸菌調(diào)控序列。
[0006]在某些方面，所述方法包括構(gòu)建重組乳酸菌的步驟，所述重組乳酸菌包含編碼載脂蛋白并與合適的調(diào)控核苷酸序列操作性連接以控制編碼序列的表達的核苷酸序列，所述方法還包括在有效表達載脂蛋白的條件下培養(yǎng)所述重組乳酸菌和從所述乳酸菌或從培養(yǎng)基中收集載脂蛋白的步驟。
[0007]所述重組載脂蛋白可用于治療和/或預(yù)防多種疾病和病癥，包括血脂障礙，和/或與之有關(guān)的各種疾病、疾患和/或病癥。
[0008]在候選治療蛋白的高通量早期發(fā)現(xiàn)和高產(chǎn)率制備中，廣泛使用基于大腸桿菌(E.coli)的表達系統(tǒng)。然而，并非所有蛋白都能夠使用大腸桿菌作為宿主生物體高產(chǎn)率制備。另外，成功的大腸桿菌重組蛋白的表達/純化取決于能夠使純化的蛋白無污染物例如內(nèi)毒素的高保真系統(tǒng)。常檢測不到獲自大腸桿菌的純化蛋白樣品中內(nèi)毒素的存在。另外，常用于去除污染物的方法例如陰離子交換色譜不能去除內(nèi)毒素。見例如McKinstry等，2003，Biotechniques 35:724_6。
[0009]大腸桿菌中載脂蛋白A-1的產(chǎn)量低，去除內(nèi)毒素所需的純化步驟可甚至更加減低產(chǎn)率。根據(jù)大腸桿菌中表達的重組蛋白，消除污染的內(nèi)毒素并實現(xiàn)符合動態(tài)藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(cGMP)的純度水平是不可能的。因此，開發(fā)能夠使純化的重組載脂蛋白無內(nèi)毒素的大腸桿菌高保真度系統(tǒng)是不可能的。載脂蛋白在其他表達系統(tǒng)如酵母和昆蟲細胞中的產(chǎn)量也低。
[0010]本
【發(fā)明內(nèi)容】
提供了用于在不產(chǎn)生內(nèi)毒素的細菌如乳酸菌中制備重組載脂蛋白的組合物和方法。使用非內(nèi)毒素細菌例如乳酸菌制備載脂蛋白的優(yōu)點包括:(I)無內(nèi)毒素，內(nèi)毒素是大多數(shù)革蘭氏陰性細菌細胞壁的組分，但不作為細胞壁組分存在于乳酸菌中；(2)可利用不產(chǎn)生細胞外蛋白酶的乳酸菌菌株包括乳酸乳球菌株；(3)操作乳酸菌容易；(4)乳酸菌分泌穩(wěn)定且較易于純化的重組肽、多肽或蛋白的能力；(5)利用發(fā)酵代謝(即在缺乏氧氣的情況下發(fā)生發(fā)酵)，發(fā)酵代謝通過減輕或消除對避免集中的氧氣袋所需的特別設(shè)計的設(shè)備(如果存在，可減少細胞生長并減低產(chǎn)率)的需要來簡化蛋白生產(chǎn)的規(guī)模放大；(6)可利用誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)來增加表達的基因產(chǎn)物的產(chǎn)率；以及(7)乳酸菌在食品工業(yè)中安全使用的長久歷史，使得它們成為制備治療蛋白例如載脂蛋白的具有吸引力的克隆宿主。
[0011]根據(jù)上述，本
【發(fā)明內(nèi)容】
提供了用于在乳酸菌中表達載脂蛋白的組合物和方法。如本文所使用，術(shù)語“乳酸菌”是指革蘭氏陽性、微需氧或厭氧菌，
[0012]其發(fā)酵糖而產(chǎn)酸，包括作為主要產(chǎn)生的酸的乳酸。通常，所述方法和組合物利用工業(yè)上使用的乳酸菌，例如乳球菌亞種、鏈球菌亞種、乳桿菌亞種、明串珠菌亞種、片球菌亞種、短桿菌亞種以及丙酸桿菌亞種。屬于嚴格厭氧類的產(chǎn)乳酸菌一雙歧桿菌(即雙歧桿菌亞種(Bifidobateriumspp.),也可包括在乳酸菌家族中，其通常單獨或結(jié)合乳酸菌用作食品發(fā)酵劑。
[0013]應(yīng)知道其他不產(chǎn)生內(nèi)毒素的細菌包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他革蘭氏陽性細菌可用于制備重組載脂蛋白，使得重組載脂蛋白的制備范圍不限于上述的乳酸菌。
[0014]可將重組乳酸菌構(gòu)建成包含編碼載脂蛋白的核苷酸序列。使用本領(lǐng)域公知的方法可將編碼載脂蛋白的核苷酸序列任選連接至合適的調(diào)控核苷酸序列以調(diào)節(jié)編碼序列的表達(見例如 Sambrook 等，1989, MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, Cold Spring HarborLaboratoryPress, NY)。另外，已經(jīng)分析了來自不同乳酸桿菌種的許多已測序基因的密碼子使用模式，使得如果需要開發(fā)繞過密碼子偏倚的方法成為可能。見例如 Pouwels 和 Leunissen, 1994, NucleicAcidSRes.22:929_936。
[0015]乳酸菌中重組表達的載脂蛋白的性質(zhì)對于成功來說并非關(guān)鍵。實際上如本文所述提供治療性和/或預(yù)防性優(yōu)點的任何載脂蛋白和/或其衍生物或類似物可于乳酸菌家族包括的較多成員之一中表達。另外，任何。螺旋肽或肽類似物或因當(dāng)與脂質(zhì)結(jié)合時可激活LCAT或形成盤狀顆粒而“模擬”載脂蛋白(例如ApoA-1)活性的任何其他類型的分子可于乳酸菌中重組表達，并因此包括在“載脂蛋白”的定義中。合適的載脂蛋白的實例包括但不限于:ApoA-1、ApoA-11、ApoA-1V、ApoA-V 以及 ApoE 的前原載脂蛋白形式；人類 ApoA-1、ApoA-11、ApoA-1V以及ApoE的前體形式和成熟形式；以及活性多晶形式、異構(gòu)形式、變體和突變體以及截短形式，其中最常見的是ApoA-M(APOA-M)和ApoA-1p (ApoA-1p)。ApoA-頂是ApoA-1的 R173C 分子變體(見例如 Parolini 等，2003，JBiolChem.278(7):4740-6 ;Calabresi 等，1999, Biochemistry 38: 16307-14 ;以及 Calabresi 等，1997, Biochemistry36:12428-33)。ApoA-1p 是 ApoA-1 的 R151 分子變體(見例如 Daum等，1999，JMolMed.77(8):614-22)。也已知并也可以使用含有半胱氨酸殘基的載脂蛋白突變體(見例如美國公布2003/0181372)。載脂蛋白可為單體或二聚體形式，所述二聚體形式可為同二聚體或異二聚體。。載脂蛋白可包括對應(yīng)于利于其分離的元件例如His標(biāo)簽或設(shè)計用于其他目的的其他元件的殘基，只要當(dāng)載脂蛋白包括在絡(luò)合物中時保留某些生物活性。
[0016]在某些實施方案中，編碼載脂蛋白的核苷酸序列獲自人類。人類載脂蛋白序列的非限制性實例公開于美國專利N0.5，876，968,5, 643，757和5，990，081，以及W096/37608 ；它們的內(nèi)容通過引用完整并入本申請。
[0017]除了上述參考文獻以外，人類載脂蛋白的序列包括可于各序列數(shù)據(jù)庫獲得的序列，例如Genbank。例如人類ApoA-1的Genbank登錄號包括但不限于NP 000030和AAB59514、P02647、CAA30377 以及 AAA51746。人類 ApoA-1I 的 Genbank 登錄號包括但不限于NP 001634 和 P02652。人類 ApoA-1V 的 Genbank 登錄號包括但不限于 AAB50137、P06727、NP000473 以及 NP-OO1634。人類 ApoA-V 的 Genbank 登錄號包括但不限于 NP_443200、AAB59546以及Q6Q788。人類ApoE的Genbank登錄號包括但不限于Q6Q788、P02649、AAB50137、BAA96080、AAG27089、AAL82810、AAB59546、AAB59397、AAH03557、AAD02505、NP 000032 以及AAB59518。
[0018]實施方式:
[0019]在某些實施方案中，編碼載脂蛋白的核苷酸序列獲自非人類(見例如美國公布2004/0077541，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請)。載脂蛋白A-1蛋白已經(jīng)在許多非人類動物中得以鑒定，例如奶牛、馬、綿羊、猴子、狒狒、山羊、家兔、狗、刺猬、獾、小鼠、大鼠、貓、豚鼠、倉鼠、鴨、雞、鮭魚以及鰻魚
[0020]源自非人類動物種的載脂蛋白A-1蛋白具有相似大小(Mr-27，000-28，000)并具有相當(dāng)大的同一性(Smith 等，1978, AnnRevBiochem.47:751-7)。例如，牛 ApoA-1 蛋白包含241個氨基酸殘基并可形成一連串重復(fù)的兩親。螺旋區(qū)。螺旋區(qū)，通常存在于下列殘基之間:43-64 、65-86、87-97、98-119、120-141、142-163、164-184、185-206、207-217 以及 218-241 (見 Sparrow 等，1992, BiochimBiophyS Acta.1123:145-150,和 Swaney, 1980，Biochim BiophyS Acta617:489_5023。使用 BLAST 程序進行的人類 ApoA-1 蛋白(GenBank登錄號XM 52106或NM 000039)和牛ApoA-1蛋白(GenBank登錄號A56858)之間的氨基酸序列比較揭示這些序列具有77% fi勺同一性(Altschul等，1990，JMolBiOl.215(3):403-10)。[0021]豬(豬的)ApoA_I蛋白包含約264個氨基酸殘基，具有約30，280的分子量。GenBank登錄號S31394提供了具有30，254分子量的264個殘基的豬ApoA-1序列，而GenBank登錄號JT0672提供了具有30，320分子量的265個殘基的豬ApoA-1蛋白(還見 Weiler-Guttler 等，1990, JNeurochem.54(2):444-450 ;Trieu 等，1993, Gene 123(2):173-79 ;Trieu 等，1993，Genel34(2):267-70)。
[0022]雞ApoA-1前體具有264個氨基酸殘基，其序列在GenBank登錄號LPCHAl提供。Jackson等已描述了包含234個氨基酸殘基的母雞ApoA-1，它具有約28，000的分子量，并且由于存在異亮氨酸而不同于人類ApoA-1 (hckson等，1976, BiochimBiophysActa.420 (2):342-9)。Yang等描述了包含240個氨基酸殘基的成熟雞ApoA-1蛋白，它與人類的同一性低于 50 % (還見 Yang 等，1987，F(xiàn)EBS Lett.224(2):261-6, Shackelford 和Lebherz ;1983，JBiolChem.258(11):7175-7180, Banjerjee 等，1985，JCellBiollOl (4):1219-1226，Rajavashisth 等，1987，JBiolChem.262(15):7058-65, Ferrari 等，1987，Gene 60(1):39-46, Bhattacharyya 等，1991, Gene 104(2): 163-168 ;Lamon_Fava 等，1992,JLipidRes.33(6):831-42)。雞ApoA-1蛋白的圓二色性研究表明所述蛋白以脂質(zhì)游離態(tài)作為兩親。螺旋束構(gòu)成(Kiss等，1999,Biochemistry38 (14):4327-34)。雞、人類、家兔、狗以及大鼠的二級結(jié)構(gòu)特征比較提示人類ApoA-1的ApoA-1 二級結(jié)構(gòu)的良好保守性，尤其在所述蛋白的 N 端 2/3 (Yang 等，1987，F(xiàn)EBSLett.224(2):261-6)。
[0023]火雞的脂蛋白研究已經(jīng)鑒定了認為與人類ApoA-1和ApoA-1 I類似的ApoA類脂蛋白?；痣u的ApoA-1是具有約27，000分子量的主要的ApoA多肽(Kelley和Alaupovic,1976, Atherosclerosis 24(1-2): 155-75, Kelley 和 Alaupovic,1976,Atherosclerosis24(l-2):177-87)。鴨ApoA-1可包含約246個氨基酸殘基并具有約28，744 的分子量(GenBank 登錄號 A61448, Gu 等，1993，JProteinChem.12 (5):585-91)。
[0024]乳酸菌表達載體和調(diào)控序列
[0025]重組乳酸菌可包括操作性連接編碼核苷酸序列的至少一個組成型啟動子，或至少一個可調(diào)節(jié)啟動子。如本文所使用，術(shù)語“操作性連接”是指功能關(guān)聯(lián)的核苷酸序列元件的連接。例如，“操作性連接”的啟動子是指該調(diào)控元件在相對于核苷酸編碼序列的合適位置和方向以控制RNA聚合酶啟動和核酸表達(如它影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄)。啟動子區(qū)可基于任何原核細胞中存在的啟動子，且啟動子能夠在乳酸菌中起作用(如啟動操作性連
[0026]接的核酸序列的表達)，但在某些實施方案中，它衍生自乳酸菌。例如，在某些實施方案中，啟動子區(qū)可衍生自乳酸乳球菌的啟動子區(qū)，乳酸乳球菌包括乳酸乳球菌乳亞種，如命名為MG1363的菌株(在文獻中也稱為乳酸乳球菌乳脂亞種)(Nauta等，1997，NatBiotechnOl.15:980-983),和乳酸乳球菌乳酸亞種二乙酸變種(Lactococcus Iactissubspecies lactis biovar.Diacetylactis)。其他適用于重組乳酸菌構(gòu)建的啟動子區(qū)的實例公開于W094/16086，包括包含啟動子P170的區(qū)及其衍生物，其實例公開于W098/10079和美國申請公布N0.2002/0137140，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請。在某些實施方案中，用于表達重組載脂蛋白的乳酸菌可為其中細胞外管家蛋白酶HtrA被滅活的變體。見例如 Miyoshi 等，2002, AppIEnvironMicrobio 168:3141-3146,其內(nèi)容通過引用完整并入本申請。
[0027]在某些實施方案中，用于重組乳酸菌的啟動子可為可調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)型的啟動子。調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)啟動子的因素包括可調(diào)節(jié)啟動子序列活性的任何物理和化學(xué)因素，包括但不限于:物理條件，例如溫度和光線；化學(xué)物質(zhì)，例如IPTG、色氨酸、乳酸鹽或尼生素(nisin);以及環(huán)境或生長條件因素，如pH、培養(yǎng)溫度以及氧含量。調(diào)節(jié)啟動子活性的其他條件可尤其包括:引發(fā)熱休克基因表達的溫度變動；生長培養(yǎng)基的組成，例如離子強度/NaCl含量；細胞內(nèi)或培養(yǎng)基中代謝物的積聚，包括乳酸/乳酸鹽酸鹽；必需細胞成分或其前體的存在/缺無；以及細菌的生長期或生長率。見例如美國公布2002/0137140，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請。
[0028]已開發(fā)了用于乳酸菌的許多誘導(dǎo)型基因表達系統(tǒng)，見例如Kok，1996，AntonieVanLeeuwenhoek.70: 129-145 ；Kuipers 等，1997, TrendsBiotechnol 15:135-40 ；,1998, Mol Biotechnol 9:127-139 ；Kleerebezem 等，1997, ApplEnvironMicrobiOl.63:4581-4584。有用的乳酸菌表達系統(tǒng)包括NICE系統(tǒng)(de Ruyter等，1996，Appl EnvironMicrobiOl.62:3662-3667)，其基于來自調(diào)節(jié)乳酸乳球菌中抗微生物肽尼生素的生物合成的二組分系統(tǒng)的遺傳元件。其他有用的誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)包括使用來自乳酸乳球菌噬菌體f31 (O，Sullivan 等，1996, Biotechnology (N.Y.), 14:82-87 ；以及 Walker 和 Klaenhammer,1998，J B acteriol 180:921-931)和 rlt (Naut 等，1997，Nat BiotechnOl.15:980-983)的遺傳兀件-通過環(huán)境變化如 pH(Israelsen 等，1995, ApplEnvironMicrobiOl.61:2540-2547)、Zn2+(Llull 和 Poquet, 2004, Appl EnvironMicrobiOl.70:5398-5406)、鹽濃度(Sanders等，1998，MolGenGenet，257:681-685)以及宿主細胞產(chǎn)生的代謝物或通過宿主細胞生長過程中天然存在的條件誘導(dǎo)的啟動子。所述啟動子尤其包括PH誘導(dǎo)型的P170啟動子及其衍生物，如WO 94/16086、WO 98/10079、美國申請公布N0.2002/0137140以及Madsen 等，1999，Mol MicrobiOl.107:75-87 所公開的。
[0029]在某些實施方案中，可將編碼載脂蛋白的啟動子和核苷酸序列導(dǎo)入乳酸菌的自動復(fù)制的復(fù)制子上，例如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座 元件、噬菌體或粘粒。在某些實施方案中，可在下述條件下導(dǎo)入啟動子和載脂蛋白核苷酸編碼序列:即，其中載脂蛋白核苷酸編碼序列整合至乳酸菌細胞染色體，以提供載脂蛋白核苷酸編碼序列在細菌中的穩(wěn)定維持?？赏ㄟ^其中基于同源重組、轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)移以及噬茵體整合酶的整合系統(tǒng)產(chǎn)生整合。
[0030]在其他實施方案中，可在其中載脂蛋白核苷酸編碼序列操作性連接天然存在于所選宿主生物體染色體中的啟動子的位置將其導(dǎo)入乳酸菌細胞染色體。
[0031]在某些實施方案中，載脂蛋白核苷酸編碼序列操作性連接編碼能夠使基因產(chǎn)物自細菌分泌出和分泌至培養(yǎng)基的信號肽(SP)的核苷酸序列。適用于乳酸菌的信號肽(包括Usp45)公開于美國公布2002/0137140，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請。
[0032]在某些實施方案中，其他核苷酸序列，例如改進乳酸茵中異源蛋白產(chǎn)生和分泌的那些可用于本文所述的方法和組合物。例如，在某些實施方案中，編碼葡萄球菌核酸酶(Nuc)和合成肽LEISSTCDA的核苷酸序列可連接編碼載脂蛋白的核苷酸序列。見例如Nouaille等，2005，BrazJMedBiolRes.38:353_359，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請。
[0033]在某些實施方案中，被開發(fā)用于乳酸菌的表達載體可用于在乳酸菌中表達重組載月旨蛋白，包括但不限于pLF22 (見例如Trakanov等,2004, Microbiology 73: 170-175)和pTREX(見例如 Reuter 等，2003, ” VaccineProtocols, ”MethodsinMolecularMedicine 中87:101-114)。[0034]在不同實施方案中，可培養(yǎng)包含編碼載脂蛋白的核苷酸序列的乳酸菌(例如美國公布2002/0137140中公開的)以產(chǎn)生無內(nèi)毒素的載脂蛋白。所述方法包括在適于載脂蛋白表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的乳酸菌，以及從所轉(zhuǎn)化的乳酸菌收集載脂蛋白?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)技術(shù)收獲重組細胞和/或載脂蛋白。見例如美國申請公布N0.2002/0137140，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請。
[0035]在某些實施方案中，將短鏈?；字砑又劣糜谂囵B(yǎng)包含重組載脂蛋白的乳酸菌(如上所述)的培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)。乳酸菌可利用短鏈?；字鳛闋I養(yǎng)來源。另外，短鏈酰基磷脂可用作溶解所表達的載脂蛋白的助劑。可通過添加剪切?；?、釋放短鏈脂肪酸和短鏈IysoPL的磷脂酶容易地去除短鏈?；字?。由于短鏈脂肪酸和IysoPL可溶，可沉淀并純化載脂蛋白。
[0036]重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物
[0037]在某些實施方案中，本文所述的重組載脂蛋白可以以載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物形式配制和給藥。該方法具有幾個優(yōu)點，這是因為所述絡(luò)合物在循環(huán)中具有增加的牛衰期，特別當(dāng)所述絡(luò)合物具有與HDL尤其是原P.I或原P *2HDI群相似的大小和密度時?？赏ㄟ^下述許多方法中的任何方法來方便地制備載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物。還見美國專利N0.6，004，925，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請?？赏ㄟ^低壓凍干制備具有長儲存期的穩(wěn)定制劑。低壓凍干的載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物可用于制備藥物再配制的大體積制
[0038]劑(bulk)，或制備可在給藥 于受治療者之前通過使用無菌水或合適的緩沖液再水化而重新配制的各等份或劑量單位。
[0039]本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法可用于制備載脂蛋白-脂質(zhì)囊泡或絡(luò)合物。至此，可使用許多制備脂質(zhì)體或脂蛋白體的有用技術(shù)。例如，可將載脂蛋白和合適的脂質(zhì)一起超聲處理(使用浴槽式或探針式超聲儀)來形成絡(luò)合物。可選地，可使載脂蛋白和形成的脂質(zhì)囊泡結(jié)合而導(dǎo)致自發(fā)形成載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物。在又一些其他實施方案中，可通過去污劑透析方法形成載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物，例如將載脂蛋白、脂質(zhì)和去污劑的混合物進行透析以去除去污劑和重構(gòu)或形成載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物(見例如Jonas等，1986，MethodsinEnzymOl.128:553-582)。
[0040]盡管前述方法可行，但各方法表現(xiàn)其自身在成本、產(chǎn)率、重現(xiàn)性和安全性方面的特有的制備問題。用于制備具有與HDL相似特征的載脂蛋白-磷脂絡(luò)合物的簡單方法描述于美國專利N0.6，004, 925，其內(nèi)容通過引用完整并入本申請。
[0041]可將低壓凍干的產(chǎn)品重溶以獲得肽』旨質(zhì)絡(luò)合物的溶液或懸浮液。至此，使用水溶液再水化低壓凍干粉至合適的體積(常為便于靜脈注射的5mg肽/mi)。在某些實施方案中，使用磷酸鹽緩沖鹽水或生理鹽水溶液再水化低壓凍干粉。可將該混合物進行攪動或渦旋以利于再水化，在大多數(shù)情況下，可在等于或大于所述絡(luò)合物脂質(zhì)組分的相變溫度的溫度下進行重溶步驟。
[0042]可對所產(chǎn)生的重溶制品等份進行表征以證實所述制品中的所述絡(luò)合物具有所需大小分布，例如HDL的大小分布。用于該目的的示例方法為凝膠過濾色譜法。在下文所述的操作實施例中，使用PharmaciaSuperose6FPLC凝膠過濾色譜系統(tǒng)。所使用的緩沖液于50mM磷酸鹽緩沖液中含有150mMNaCl，pH為7.4。通常的樣品體積為20至200微升含有5mg肽/ml的絡(luò)合物。柱流速為0.5ml/min。一系列具有已知分子量和Stokes半徑的蛋白質(zhì)以及人類HDL可用作校準柱子的標(biāo)準。可通過254或280nm的吸光度或光散射波長來檢測蛋白和脂蛋白絡(luò)合物。
[0043]重組載脂蛋白可與多種脂質(zhì)絡(luò)合，包括飽和、不飽和、天然和合成的脂質(zhì)和/或磷月旨。合適的脂質(zhì)包括但不限于:小烷基鏈磷脂、卵磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿、二肉豆蘧?；字Ｄ憠A、二硬脂?；蚜字?、1-肉豆蘧酰基-2-棕櫚?；字Ｄ憠A、1-棕櫚?；?2-肉豆蘧?；字Ｄ憠A、1-棕櫚?；?2-硬脂?；蚜字?、1-硬脂?；?2-棕櫚酰基磷脂酰膽堿、二油?；字Ｄ憠A、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二月硅酰基磷脂酰甘油磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰
[0044]肌醇、鞘磷脂、鞘脂、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蘧?；字８视?、二棕櫚?；字８视汀⒍蝉ヵ；字８视汀⒍王；字８视?、二肉豆蘧?；字?、二棕櫚基酰磷脂酸、二肉豆蘧?；字Ｒ掖及?、二棕櫚?；字Ｒ掖及贰⒍舛罐觉；字Ｒ掖及贰⒍貦磅；字＝z氨酸、腦磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、二棕櫚?；柿字?、二硬酯酰基鞘磷脂、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)糖苷、腦苷脂、二月桂?；字Ｄ憠A、(1，3)-D-甘露糖基_(1，3)甘油二酯、氨基苯基糖苷、3-膽固醇基-6’-(糖基巰基)己基醚糖脂，以及膽固醇及其衍生物。
[0045]在其他實施方案中，可通過使重組載脂蛋白與下列丈獻中公開的脂質(zhì)絡(luò)合而制備重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物:2005年3月24日提交的題為“ChargedLipoproteinComplexesandTheirUses"的序列號 60/665，180 的美國申請，和國際申請 N0.PCT/IB2006/000635。
[0046]藥物組合物
[0047]本
【發(fā)明內(nèi)容】
考 慮的藥物組合物包含本文所述的重組載脂蛋白，或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物作為適于體內(nèi)給藥和遞送的藥學(xué)上可接受的載體中的活性成分。在使用載脂蛋白模擬肽的實施方案中，載脂蛋白模擬肽可以以游離酸或堿形式或以藥學(xué)上可接受的鹽形式包括在組合物中。還可使用修飾的蛋白，例如酰胺化、酰化、乙?；蚓垡叶蓟牡鞍?。
[0048]可注射的組合物包括于水或油載體中的活性成分的無菌懸浮液、溶液或乳濁液。所述組合物還可包含配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于注射的組合物可以以單位劑量形式例如于安瓿或多劑量容器中提供，并可包含添加的防腐劑。對于輸注，可以于由可與帶電荷的脂蛋白絡(luò)合物相容的材料制成的輸注盒中提供組合物，所述材料例如乙烯醋酸乙烯酯(ethylenevinylacetate)或本領(lǐng)域已知的任何其他相容的材料。
[0049]可選地，可注射的組合物可以以粉末形式來提供，所述粉末形式在使用前使用合適的載體包括但不限于無菌無熱原水、緩沖液、葡萄糖液等重溶。至此，可低壓凍干重組載脂蛋白或可制備共低壓凍干的載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物。儲存的組合物可以以單位劑量形式提供并在體內(nèi)使用前重溶。
[0050]對于延長的遞送，可將活性成分配制成用于植入給藥的貯積(cbpot)組合物，例如皮下、皮內(nèi)或肌肉注射。因此，例如，重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物或單獨重組載脂蛋白可與合適的聚合物或疏水材料(如作為于可接受的油中的乳濁液)一起或于磷脂泡沫或離子交換樹脂中配制。
[0051]可選地，可使用制備成緩慢釋放活性成分的粘著盤或貼片用于經(jīng)皮吸收的透皮遞送系統(tǒng)。至此，滲透促進劑可用于促進活性成分的透皮滲透。通過將本文所述的帶電荷的絡(luò)合物摻入硝酸甘油片用于患有缺血性心臟病和高膽固醇血癥的患者來實現(xiàn)特定益處。
[0052]可選地，可使用導(dǎo)管或注樣器局部或壁內(nèi)(血管壁內(nèi))進行遞送(見例如美國申請公布 N0.2003/0109442)。
[0053]如果需要，可以以包裝或分配裝置提供所述組合物，所述包裝或分配裝置可包含含有活性成分的一種或多種單位劑量形式。所述包裝可包含例如金屬或塑料箔，例如泡罩。包裝或分配裝置可附帶用于給藥的說明書。
[0054]治療方法
[0055]本文所述的重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物和組合物可用于實際上其中脂蛋白絡(luò)合物已顯示有用的每一種目的。在某些實施方案中，所述絡(luò)合物和組合物可用于治療或預(yù)防血脂障礙和/或?qū)嶋H上與血脂障礙有關(guān)的任何疾病、病癥和/或疾患。如本文所使用，術(shù)語“血脂障礙”或“脂代謝障礙”是指血漿中脂質(zhì)水平異常升高或降低，包括但不限于與下列病癥有關(guān)的脂質(zhì)水平變化:冠心病、冠狀動脈疾病、心血管疾病、高血壓、再狹窄、血管或血管周圍疾病、脂代謝障礙病癥、異常脂蛋白血癥、高水平低密度脂蛋白膽固醇、高水平極低密度脂蛋白膽固醇、低水平高密度脂蛋白、高水平脂蛋白Lp(a)膽固醇、高水平載脂蛋白B、動脈粥樣硬化(包括動脈粥樣硬化的治療和預(yù)防)、高脂血癥、高膽固醇血癥、家族性高膽固醇血癥(PH)、家族性復(fù)合高脂血癥(PCH)、脂蛋白脂肪酶缺陷(例如高甘油二酸酷血癥、低脂蛋白血癥以及聞膽固醇血癥脂蛋白)。與血脂障礙有關(guān)的疾病包括但不限于冠心病、冠狀動脈疾病、急性冠狀動脈綜合征、心血管疾病、高drL ;Z、再狹窄、血管或血管周圍疾病、脂代謝障礙病癥、異常脂蛋白血癥、高水平低密度脂蛋白膽固醇、高水平極低密度脂蛋白膽固醇、低水平高密度脂蛋白、高水平脂蛋白Lp(a)膽固醇、高水平載脂蛋白B、動脈粥樣硬化(包括動脈粥樣硬化的治療和預(yù)防)、高脂血癥、高膽固醇血癥、家族性高膽固醇血癥(PH)、家族性復(fù)合高脂血癥(PCH)、脂蛋白脂肪酶缺陷(例如高甘油三酸酯血癥、ο低脂蛋白血癥以及聞膽固醇血癥脂蛋白)。
[0056]在某些實施方案中，所述方法包括一種治療或預(yù)防與血脂障礙有關(guān)的疾病的方法，其包括以下述一種量給藥于受治療者重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物:即給藥后有效實現(xiàn)游離或絡(luò)合的載脂蛋白血清水平在高于給藥前的基線(初始)水平約10mg/dL至300mg/dL的范圍內(nèi)至少一天的量。
[0057]在其他實施方案中，所述方法包括一種治療或預(yù)防與血脂障礙有關(guān)的疾病的方法，其包括以下述一種量給藥于受治療者重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物:即給藥后有效實現(xiàn)HDL-膽固醇部分的循環(huán)血漿濃度高于給藥前的初始HDL-膽固醇部分至少約10%至少一天的量。
[0058]在其他實施方案中，所述方法包括一種治療或預(yù)防與血脂障礙有關(guān)的疾病的方法，其包括以下述一種量給藥于受治療者本文所述的帶電荷的脂蛋白絡(luò)合物或組合物:即有效實現(xiàn)HDL-膽固醇部分的循環(huán)血漿濃度在給藥后5分鐘和I天之間為30和300mg/dL之間的量。
[0059]在其他實 施方案中，所述方法包括一種治療或預(yù)防與血脂障礙有關(guān)的疾病的方法，其包括以下述一種量給藥于受治療者重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物:即有效實現(xiàn)膽固醇酯的循環(huán)血漿濃度在給藥后5分鐘和I天之間為30和300mg/dL之間的量。[0060]在其他實施方案中，所述方法包括一種治療或防御與血脂障礙有關(guān)的疾病的方法，其包括以下述一種量給藥于受治療者重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物:即給藥后有效實現(xiàn)糞便膽固醇的分泌增加高于給藥前基線(初始)水平至少約10%至少一天。
[0061 ] 本文所述的重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物或組合物可單獨使用或與其他藥物的聯(lián)合治療用于治療或預(yù)防前述病癥。所述治療包括但不限于有關(guān)藥物的同時或順序給藥。例如，在高膽固醇血癥或動脈粥樣硬化的治療中，重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物可與一種或多種目前使用的降低膽固醇的治療一起給藥，例如膽汁酸樹脂、尼克酸、他汀類(statins)、膽固醇吸收的抑制劑和/或貝特類(fibrates)。這樣聯(lián)合方案可產(chǎn)生特別有益的治療作用，這是由于每一種藥物作用于膽固醇合成和運輸中的不同靶，即，膽汁酸樹脂影響膽固醇再循環(huán)、乳糜微粒和LDL群，尼克酸主要影響VLDL和LDL群；他汀類抑制膽固醇合成，減小LDL群(并也許增加LDL受體表達)；而本文所述的帶電荷的脂蛋白絡(luò)合物影響!^!"，增加HDL并促進膽固醇外流。
[0062]在其他實施方案中，重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物可結(jié)合貝特類使用來治療或預(yù)防下述疾病:冠心病、冠狀動脈疾病、心血管疾病、高血壓、再狹窄、血管或血管周圍疾病、脂代謝障礙病癥、異常脂蛋白血癥、高水平低密度脂蛋白膽固醇、高水平極低密度脂蛋白膽固醇、低水平高密度脂蛋白、高水平脂蛋白Lp(a)膽固醇、高水平載脂蛋白B、動脈粥樣硬化(包括動脈粥樣硬化的治療和預(yù)防)、高脂血癥、高膽固醇血癥、家族性高膽固醇血癥(PH)、家族性復(fù)合高脂血癥(PCH)、脂蛋白脂肪酶缺陷(例如高甘油三酸酯血癥、ο低脂蛋白血癥以及聞膽 固醇血癥脂蛋白)。
[0063]可通過確保循環(huán)中生物利用度的任何合適途徑進行重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物的給藥。例如，可以以增加小HDL部分的劑量進行重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物給藥，小HDL部分例如原P、原丫和原P樣HDL部分，01①L部分、HDL3和/或HDL2部分。
[0064]在某些實施方案中，所述劑量可有效實現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊減小，如通過例如磁共振成像(MRl)或血管內(nèi)超聲(IVUS)的成像技術(shù)測量的。IVUS跟蹤的參數(shù)包括但不限于粥樣斑體積自基線的變化百分數(shù)和總的粥樣斑體積的變化。Mm跟蹤的參數(shù)包括但不限于IVUS的那些和脂質(zhì)組成以及斑塊的鈣化。
[0065]可使用患者作為其自身對照，時間O相對最后輸注結(jié)束時的時間t，或在最后輸注之后的幾周內(nèi)，或在治療開始的3個月、6個月或I年之內(nèi)測量斑塊的退化。
[0066]可通過胃腸外給藥途徑最佳實現(xiàn)給藥，包括靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)(IM)，皮內(nèi)、皮下(SC)以及腹膜內(nèi)(IP)注射。在某些實施方案中，通過注樣器、滲透器或?qū)Ч芙o藥。在某些實施方案中，通過注射、皮下可植入泵或通過貯積制劑以實現(xiàn)等于通過胃腸外給藥獲得的循環(huán)血清濃度的量進行帶電荷的脂蛋白絡(luò)合物的給藥。所述絡(luò)合物也可在例如支架或其他裝置中被吸收。
[0067]可通過多種不同治療方案實現(xiàn)給藥。例如，可在一天期間注射不到每日毒性劑量的累積總體積定時進行幾次靜脈內(nèi)注射給藥。可選地，可約每3至15天、優(yōu)選約每5至10天和最優(yōu)選約每10天進行一次靜脈內(nèi)注射。
[0068]在又一個可選實施方案中，可進行逐漸擴大的劑量的給藥，從每次50_200mg之間的劑量約1-5次給藥開始，然后是每次200mg和Ig之間的重復(fù)給藥。根據(jù)患者的需要，可通過超過I小時的時間緩慢輸注、通過I小時或更少時間的快速輸注或通過單次快速濃注進行給藥。
[0069]在某些實施方案中，可作為一系列注射且然后停止6個月至I年，然后開始另一系列來進行給藥?？扇缓竺磕昊蛎?至5年進行維持系列的注射。該系列注射可經(jīng)I天(灌注以維持絡(luò)合物的特定血漿水平)、幾天(如經(jīng)8天的4次注射)或幾周(如經(jīng)4周的4次注射)進行，且然后在6個月至I年之后再開始?？墒褂闷渌o藥途徑。例如，可通過口服給藥途徑(包括但不限于食入、口腔和舌下途徑)實現(xiàn)通過胃腸道的吸收，條件是合適的制劑(例如腸衣)可用于避免或最小化活性成分的降解，例如在口腔粘膜、胃和/或小腸中的嚴格環(huán)境中。可選地，經(jīng)粘膜組織的給藥例如陰道和直腸給藥方式可用于避免或最小化胃腸道中的降解。在其他實施方案中，本發(fā)明的制劑可經(jīng)皮給藥(例如透皮)或通過吸入給藥。應(yīng)理解優(yōu)選的途徑可根據(jù)受者的病癥、年齡和順應(yīng)性而不同。
[0070]重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物或組合物的實際劑量可根據(jù)給藥途徑而不同。
[0071]不同重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物的毒性和治療功效可使用細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏袦y定LD50(群體半數(shù)致死劑量)和ED50(群體半數(shù)治療有效劑量)的標(biāo)準藥學(xué)操作來測定。毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數(shù)并可表示為LD50/ED50比值。優(yōu)選表現(xiàn)大治療指數(shù)的重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物。所跟蹤的參數(shù)的非限制性實例包括肝功能轉(zhuǎn)氨酶(不超過正?；€水平2X)。這表明太多的膽固醇被帶到肝臟且肝臟不能同化這樣的量。還可檢測對紅細胞的作用，這是因為膽固醇自紅細胞的動員導(dǎo)致它們變得脆弱或影響它們的形狀。
[0072]可在醫(yī)學(xué)行動(如預(yù)防性治療)之前幾天至幾周或在醫(yī)學(xué)行動過程中或之后治療患者。給藥可伴隨或同時使用其他侵入性治療，例如血管成形術(shù)、頸動脈切開術(shù)、旋切術(shù)(rotoblader)或器官移植(例如心臟、腎臟、肝臟等)。
[0073]在某些實施方案中，將重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物給藥于其膽固醇合成受抑制素(statin)或膽固醇合成抑制劑控制的患者。在其他實施方案中，將重組載脂蛋白和/或重組載脂蛋白-脂質(zhì)絡(luò)合物給藥于使用結(jié)合樹脂例如半合成樹脂如考來烯胺(cholestyramine)或纖維素如植物纖維素捕獲膽鹽和膽固醇來增加膽汁酸分泌和降低血液膽固醇濃度而進行治療的患者。
[0074]任何公布的引用為其內(nèi)容于提交日期之前，且不應(yīng)理解為承認由于先前發(fā)明而使本發(fā)明不享受早于這些公布的權(quán)利。
[0075]對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不背離其精神和范圍的情況下可進行本發(fā)明的許多修改和變動。所述的具體實施方案僅通過舉例方式提供，并且本發(fā)明僅受附屬權(quán)利要求的術(shù)語及這些權(quán)利要求被授權(quán)的等同物的整個范圍的限制。
【權(quán)利要求】
1.一種能夠在乳酸菌中表達的表達載體，其包含編碼載脂蛋白的核苷酸編碼序列，和與其操作性連接以控制所述核苷酸編碼序列表達的一個或多個調(diào)控核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達載體，其中所述核苷酸編碼序列編碼人類載脂蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的表達載體，其中所述核苷酸編碼序列編碼選自下列的人類載脂蛋白:前原載脂蛋白、前原ApoA1、原ApoA1、ApoA1、前原ApoAI 1、原ApoAI 1、ApoAI 1、前原 ApoA-1V、原 ApoAIV、ApoAIV、ApoAV、前原 ApoE> 原 ApoE> ApoE> 前原 ApoAIMiIano> 原ApoAIMiIano、ApoAIMiIano、前原 ApoAIParis、原 ApoAIParis 以及 ApoAIParis0
4.根據(jù)權(quán)利要求1的表達載體，其中所述調(diào)控核苷酸序列之一包含與所述核苷酸編碼序列操作性連接的組成型啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的表達載體，其中所述調(diào)控核苷酸序列之一包含與所述核苷酸編碼序列操作性連接的可調(diào)節(jié)啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的表達載體，其中所述啟動子衍生自乳酸菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的表達載體，其中所述啟動子受選自pH、溫度和氧氣的因素的調(diào)節(jié)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的表達載體，其中所述可調(diào)節(jié)啟動子是P170啟動子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的表達載體，其中所述載體是自動復(fù)制的復(fù)制子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的表達載體,`其中所述載體選自質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座元件、曬菌體或粘粒。
【文檔編號】C12R1/01GK103757043SQ201110317900
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月19日
【發(fā)明者】劉念 申請人:劉念