專利名稱：多重pcr和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用多重PCR方法和多重酶切方法檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肉質(zhì)作為豬的數(shù)量性狀，受許多基因的調(diào)控，其中，氟烷、酸肉以及心臟脂肪酸基因是三個(gè)重要肉質(zhì)基因，這三個(gè)基因的突變均會(huì)對(duì)豬的肉質(zhì)產(chǎn)生很大影響。其中，氟烷基因的突變是由于氟烷基因cDNA中的C1843-G突變?yōu)門1843-A，使受體蛋白第615位精氨酸變?yōu)榘腚装彼?，從而?dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而引起豬應(yīng)激綜合癥的發(fā)生；酸肉基因的突變是由于在酸肉基因外顯子3中堿基G — A的突變抑制了磷酸蛋白激酶的活性，導(dǎo)致了終PH值低，顏色蒼白，有水分滲出的“漢普夏型豬肉”;豬心臟脂肪酸基因上存在限制性內(nèi)切酶1、Hae \\\、Hinf I的3個(gè)酶切多態(tài)性位點(diǎn)，這三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性均與肌間脂肪含量呈顯著相關(guān)。
目前，這三個(gè)基因已經(jīng)成為豬DNA標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種中的主要DNA標(biāo)記；檢測(cè)這三個(gè)基因的方法是傳統(tǒng)的PCR-RFLP。而傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法每次只能檢測(cè)一個(gè)基因， 檢測(cè)效率較低，本發(fā)明專利使用雙重PCR和雙重酶切的方法每次同時(shí)擴(kuò)增和酶切兩段DNA 片段，從而大大提高了豬肉質(zhì)基因多態(tài)性檢測(cè)的效率。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的各種問題，提出了一種多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，克服了上述缺陷，提高了檢測(cè)效率。
技術(shù)方案一種多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(I)、首先針對(duì)氟烷、酸肉以及心臟脂肪酸這三個(gè)肉質(zhì)基因的突變位點(diǎn)選擇引物和與酶切多態(tài)性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶，查找內(nèi)切酶在各種酶切緩沖液條件下的酶切效率，并據(jù)此列出酶切效率較高的多重酶切組合。
(2)、根據(jù)步驟(I)中所選擇的引物和所有的多重酶切組合，計(jì)算各酶切組合針對(duì)相應(yīng)的DNA擴(kuò)增片段突變前和突變后的酶切片段長(zhǎng)度，分析是否能夠辨認(rèn)因突變?cè)斐傻碾娪窘Y(jié)果改變。
(3)、篩選出步驟(2)中能夠辨認(rèn)出突變的酶切組合，在這些組合中選擇幾種，并構(gòu)建與所選擇的能夠辨認(rèn)出突變的酶切組合對(duì)應(yīng)的DNA片段的多重引物PCR擴(kuò)增體系和多重酶切體系。
上述步驟(3)中采用乂7#211內(nèi)切酶和歷ifl內(nèi)切酶對(duì)氟烷基因和心臟脂肪酸基因5’-上游區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙重酶切；采用沒srB rl內(nèi)切酶和#印1內(nèi)切酶對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切；最后使用Zfeelll 內(nèi)切酶對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單酶切。
首先對(duì)氟烷基因和心臟脂肪酸基因5’ -上游區(qū)的特異性片段進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增， 然后對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的特異性片段進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增；多重引物PCR反應(yīng)體系如下(μ L):1.反應(yīng)體系50 ；2.ddH20 25 ；3.buffer 8 ；4.dNTP 8 ；5.上游引物1:1 ；6.上游引物2:1 ；7.下游引物1:1 ；8.下游引物2:1 ；9.酶2 ;10.DNA 模板3 ；反應(yīng)條件為-MV /IOmin 預(yù)變性；94°C /35sec_61°C /35sec_72°C /35sec 35 個(gè)循環(huán)；72°C /IOmin延伸；檢測(cè)結(jié)果使用140V電壓，2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時(shí)間為35分鐘。
所述多重酶切總反應(yīng)體系為10μ 1，其中PCR產(chǎn)物5μ 1，兩種限制性內(nèi)切酶各O.5μ 1，雙蒸水3μ I，酶切溫度為37 °C，酶切時(shí)間12h ;檢測(cè)結(jié)果使用140V電壓，3%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時(shí)間為22分鐘。
上述的兩種限制性內(nèi)切酶為WWll+歷/ fl或fcrBrl+i&pl。
優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明提出了一種多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)通過本發(fā)明的檢測(cè)方法，可以同時(shí)使用一個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行兩段DNA序列的擴(kuò)增和酶切，提高了氟烷、酸肉以及心臟脂肪酸基因多態(tài)性的檢測(cè)效率。
圖1為氟烷基因和心臟脂肪酸基因5’ -上游區(qū)特異性片段雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖2為酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二二內(nèi)含子區(qū)特異性片段雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖3為氟烷基因 和心臟脂肪酸基因5’-上游區(qū)特異性片段雙重酶切結(jié)果。
圖4為酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二二內(nèi)含子區(qū)特異性片段雙重酶切結(jié)果。
圖5為酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二二內(nèi)含子區(qū)特異性片段ZfeeIII酶切結(jié)果。
圖6為本發(fā)明技術(shù)路線示意圖。
具體實(shí)施例方式術(shù)語解釋肉質(zhì)肉的感官品質(zhì)、深加工品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和衛(wèi)生質(zhì)量。其中，感官品質(zhì)是人的視覺、 嗅覺、味覺和觸覺等感覺器官對(duì)豬肉的綜合感受。豬肉的感官品質(zhì)常用肌肉PH值、肉色、滴水損失、嫩度、多汁性、風(fēng)味評(píng)分等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定。
肉質(zhì)基因調(diào)控肉質(zhì)性狀的基因，肉質(zhì)性狀一般為數(shù)量性狀，由多個(gè)主效基因和候選基因調(diào)控。分子標(biāo)記輔助選擇分子標(biāo)記輔助選擇(MAS,marker—assisted selection) 是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，它可以從分子水平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，進(jìn)行分子育種。
多重酶切多重酶切技術(shù)(Multiple enzyme digestion technology)是米用多個(gè)酶同時(shí)切割一個(gè)片段或同時(shí)切割多個(gè)片段，這幾種酶的反應(yīng)條件、緩沖液和反應(yīng)時(shí)間等都是是一樣的。
本發(fā)明所述的豬主要肉質(zhì)基因是指氟烷基因、酸肉基因以及心臟脂肪酸基因這三個(gè)基因。
下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明本發(fā)明提供了一種使用多重PCR方法和多重酶切方法對(duì)豬主要肉質(zhì)基因氟烷基因、酸肉基因以及心臟脂肪酸基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)的方法，技術(shù)路線如圖6中所示，其特征在于 首先針對(duì)氟烷、酸肉以及心臟脂肪酸這三個(gè)肉質(zhì)基因的突變位點(diǎn)選擇引物和與酶切多態(tài)性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶，查找這些內(nèi)切酶在各種酶切緩沖液條件下的酶切效率，并據(jù)此列出所有酶切效率較高的多重酶切組合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所選擇的引物和所有的多重酶切組合， 使用primer5軟件計(jì)算各酶切組合針對(duì)相應(yīng)的DNA擴(kuò)增片段突變前和突變后的酶切片段長(zhǎng)度，分析是否能夠辨認(rèn)因突變?cè)斐傻碾娪窘Y(jié)果改變。篩選出能夠辨認(rèn)出突變的酶切組合，在這些組合中選擇幾種，并構(gòu)建與之對(duì)應(yīng)的DNA片段的多重引物PCR擴(kuò)增體系和多重酶切體系O
引物的設(shè)計(jì)具體引物信息如下氟烷基因上游引物5’ -TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA -3’下游引物5’ -ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG -3’片段長(zhǎng)度659bp 退火溫度61°C酸肉基因上游引物5 ’ -GAGGCCCAAATAAGTCAATGTA-3 ’下游引物5’ -ACCGGGGTCAAATGCTC-3’片段長(zhǎng)度616bp退火溫度62°C心臟脂肪酸基因上游引物5’ -GGACCCAAGATGCCTACGCCG-3’(5 ’ -上游區(qū)) 下游引物5 ’ -CTGCAGCTTTGACCAAGAGG-3 ’片段長(zhǎng)度693bp 退火溫度59°C 心臟脂肪酸基因上游引物5’ -TTGCTTCGGTGTGTTTGAG-3’(第二內(nèi)含子區(qū))下游引物5’ -CAGGAATGGGAGTTATTGG-3’片段長(zhǎng)度816bp 退火溫度 63°C。
內(nèi)切酶的選擇查找本發(fā)明所用的內(nèi)切酶在使用各種不同buffer的情況下的酶切效率，如表一所示表一各內(nèi)切酶在使用不同buffer情況下的酶切效率(％)
權(quán)利要求
1.一種多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行 (1)、首先針對(duì)氟烷、酸肉以及心臟脂肪酸這三個(gè)肉質(zhì)基因的突變位點(diǎn)選擇引物和與酶切多態(tài)性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶，查找內(nèi)切酶在各種酶切緩沖液條件下的酶切效率，并據(jù)此列出酶切效率較高的多重酶切組合； (2)、根據(jù)步驟(I)中所選擇的引物和所有的多重酶切組合，計(jì)算各酶切組合針對(duì)相應(yīng)的DNA擴(kuò)增片段突變前和突變后的酶切片段長(zhǎng)度，分析是否能夠辨認(rèn)因突變?cè)斐傻碾娪窘Y(jié)果改變； (3)、篩選出能夠辨認(rèn)出突變的酶切組合，在這些組合中選擇幾種，并構(gòu)建與之對(duì)應(yīng)的DNA片段的多重引物PCR擴(kuò)增體系和多重酶切體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，其特征在于步驟(3)中采用內(nèi)切酶和內(nèi)切酶對(duì)氟烷基因和心臟脂肪酸基因5’ -上游區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙重酶切；采用沒srBrl內(nèi)切酶和#印1內(nèi)切酶對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切；最后使用Zfeelll內(nèi)切酶對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單酶切。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，其特征在于首先對(duì)氟烷基因和心臟脂肪酸基因5’-上游區(qū)的特異性片段進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，然后對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的特異性片段進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增； 多重引物PCR反應(yīng)體系如下(μ L): 1.反應(yīng)體系50 ； 2.ddH20 25 ； 3.buffer 8 ； 4.dNTP 8 ； 5.上游引物1:1 ； 6.上游引物2:1 ； 7.下游引物1:1 ； 8.下游引物2:1 ； 9.酶2 ; 10.DNA 模板3 ； 反應(yīng)條件為-MV /IOmin 預(yù)變性；94°C /35sec_61°C /35sec_72°C /35sec 35 個(gè)循環(huán)；72°C /IOmin延伸；檢測(cè)結(jié)果使用140V電壓，2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時(shí)間為35分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，其特征在于所述多重酶切總反應(yīng)體系為10 μ 1，其中PCR產(chǎn)物5 μ 1，兩種限制性內(nèi)切酶各O.5μ1，雙蒸水3μ1，酶切溫度為37 °C，酶切時(shí)間12h ;檢測(cè)結(jié)果使用140V電壓，3%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時(shí)間為22分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，其特征在于所述的兩種限制性內(nèi)切酶為或iferBrl+ife/71。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多重PCR和多重酶切檢測(cè)豬主要肉質(zhì)基因多態(tài)性的方法，采用Alw21l內(nèi)切酶和Hinfl內(nèi)切酶對(duì)氟烷基因和心臟脂肪酸基因5’-上游區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙重酶切；采用BsrBrl內(nèi)切酶和Mspl內(nèi)切酶對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，最后使用Haelll內(nèi)切酶對(duì)酸肉基因和心臟脂肪酸基因第二內(nèi)含子區(qū)的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單酶切。通過該檢測(cè)方法，可以同時(shí)使用一個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行兩段DNA序列的擴(kuò)增和酶切，大大提高了氟烷、酸肉以及心臟脂肪酸基因多態(tài)性的檢測(cè)效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103031363SQ20111029896
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者印崇, 邢沈陽, 孫博興, 趙志輝 申請(qǐng)人:印崇