專利名稱：用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針的制作方法
用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針技術領域
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及染色體微缺失綜合征的分子探針，具體涉及用于診、 查染色體微缺失綜合征的分子組合探針。該探針可用于診斷、篩查常見的6種染色體微缺失綜合征。
背景技術：
據醫(yī)學研究報道，染色體微缺失綜合征尤其是常見的6種染色體微缺失綜合征分別為Williams 綜合征(Williams Syndrome, WS)、22qll 微缺失綜合征(22qll deletion syndrome, 22qlIDS)、Prader-ffilli 綜合征(PffS)、Angelman 綜合征(AS)、15ql3. 3 微缺失綜合征和Rett綜合癥(Rett syndrome, RTS);目前,上述微缺失綜合征的臨床診斷主要依靠臨床表現及相關的實驗室和影像學檢查，其中，遺傳學診斷以FISH檢查為金標準，可有效地檢出大部分缺失；但是，所述微缺失綜合征的診斷主要為出生后檢查，產前診斷檢出率很少。
所述的Williams綜合征(Williams Syndrome, WS)通常的臨床表現為心血管疾病(彈性蛋白動脈病，周圍肺動脈狹窄，主動脈瓣上狹窄，高血壓)，特殊面容，結締組織異常，智力低下，發(fā)育遲緩，代謝分泌異常(高血鈣，高鈣尿，甲狀腺功能減退，早熟)等癥狀; 有研究顯不，99%以上WS患者有Williams綜合征典型區(qū)域(Williams-Beuren syndrome critical region, WBSCR)包括ELN基因的連續(xù)缺失，臨床上通過FISH或目的區(qū)域突變分析檢測；所述的WBSCR的缺失和重復都可影響該區(qū)域基因組結構，缺失可導致非等位同源重組，研究還顯示，WB有95%缺 失1. 55Mb，5%缺失1. 84Mb。
GTF2I, GTF2IRD1和GTF2IRD2這3個基因位于WBSCR和鄰近低拷貝區(qū)(low copy region, LCR)調節(jié)區(qū)域；上述TFI1-1基因家族的成員可結合啟動子的不同區(qū)域和上游調節(jié)位點，在WB中起到重要作用；其中，ELN的缺失與結締組織異常包括心血管疾病相關；UMK1 在腦中表達，缺失會影響視覺建設性認識；STX1A由神經遞質釋放和胰島素分泌，異常與WS 中糖尿病相關；但是，FKBP6、TBL2在WS發(fā)生中所起到的作用目前還未知。
所述的22qll微缺失綜合征(22qlldeletion syndrome, 22qllDS)是指由人類染色體22qll. 21-22qll. 23區(qū)域雜合性缺失引起的一類臨床癥候群，包括DiGeorge綜合征、 腭心面綜合征、椎干異常面容綜合征，Cayler心面綜合征和Opitz綜合征等數個具有相同遺傳學基礎的臨床綜合征，是人類最常見的微缺失綜合征，其發(fā)生率為1: 4000(活產嬰兒)，男女發(fā)病率無明顯差異，大部分病人(90-95%)可檢測到22號染色體長臂近端染色體的微缺失。目前，有研究已在缺失區(qū)發(fā)現30多個基因，其中研究較多的基因有TBXl、 CRK0L、UfdlL、HIRA、CRKL、C0MT、PR0DH、ZDHHC8 等；TBX1 與心臟圓錐動脈干畸形、顱面畸形、 胸腺、甲狀旁腺發(fā)育不良等表型密切相關。目前，臨床診斷主要依靠臨床表現及相關的實驗室和影像學檢查，其中，遺傳學診斷以FISH檢查為金標準，可有效地檢出大部分缺失。
所述的Prader-Willi綜合征(PWS)，又稱張力減退-智力減退_性腺功能減退與肥胖綜合征，該綜合征為父源性染色體片段15qll. 2-ql3缺失(70% )、母源性15號染色體單親二體(uniparental disomy, UPD, > 25 % )和基因印跡缺陷(imprinting defect, ID，約< 5% )，上述三種突變都伴隨DNA異常甲基化。有研究發(fā)現有多個基因與 PWS相關，如SNRPN是導致PWS的關鍵基因，該基因父系遺傳，最初在大腦和心臟中表達； 所述的SNURF是雙功能蛋白控制DNA結合活性；NDN編碼DNA結合蛋白，抑蛋白(necdin homolog (mouse) ,NDN)缺失影響軸突分支生長,Ndn敲除小鼠的表型與PWS患者的缺陷非常相似。
所述的Angelman綜合征(AS)，又稱愉快木偶綜合征，與PWS遺傳機制相似， 但15qll_ql3缺失是由母源性15號染色體引起(70% )，父源性15號染色體單親二體 (uniparental disomy, UPD占5-7% )，基因印跡缺陷約占3-5%, UBE3A基因突變占11% ; 上述的前三種突變均伴有DNA異常甲基化。該綜合征患兒出生時常正常，6個月以后很快出現嚴重的發(fā)育遲緩；其診斷依賴臨床特征和分子遺傳學/細胞遺傳學 檢測。當前系統(tǒng)分析源自雙親的特異性甲基化可檢測約78%的病例，其中包括了染色體15qll. 2_ql3片段的缺失、UH)和基因印跡缺陷。所述的UBE3A基因的序列分析可檢測另外約11%的突變，還有約 I %的病例有細胞遺傳學可見的染色體異常，三者相加可涵蓋90 %的AS病例，還有10 %的有典型臨床表型特征的病例尚不能從基因醫(yī)學上確認。上述AS病例分為以下五種類型1 型為母源性15qll_ql3缺失，占70% ；11型為父源性15號染色體UPD，占5% ；111型為印跡缺陷，約占5% ;IV型為UBE3A基因突變，占10% ;V型為未知型，占10%。
所述的15ql3. 3微缺失綜合征具有大范圍高風險的臨床表型，包括智力障礙，心臟異常，癲癇，自閉癥，以及精神分裂。缺失與典型綜合征沒有直接相關性，普遍存在行為異常，集中力低，多動，情緒波動以及激進或強迫行為；半數的15ql3.3缺失患者會智力低下。 所述的15ql3. 3缺失綜合征包括單一序列1. 5Mb缺失和500kb或更大片段重復。
目前，有研究發(fā)現，15q鄰近區(qū)域有一個高密度的低拷貝重復，2. OMb缺失導致6 個基因丟失MTMR15、TRPMU MTMR10, KLF13、0TUD7A 和 CHRNA7 ;所述的 15ql3. 3 微缺失中 CHRNA7單倍體不足可能是神經發(fā)育異常的致病因素；所述的CHRNA7編碼突觸離子通道蛋白，介導神經元信號轉導，是癲癇、精神分裂和極端行為的候選基因；KLF13是心臟基因表達和心臟形成的調節(jié)因子。
所述的Rett綜合癥(Rett syndrome, RTS)為X連鎖顯性遺傳病，是嚴重的神經系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，常累及女孩，發(fā)病率為1/10，000-1/15，000。RTS患兒早期發(fā)育正常，常在大約6-24個月左右起病，首先表現為頭圍生長減速或停滯，肌張力減退并且精神發(fā)育遲滯。有研究發(fā)現，該綜合癥的病因是Xq28上甲基化CpG結合蛋白2 (methyl-CpG binding protein-2, MECP2)基因突變。目前已發(fā)現MECP2基因有多種突變類型，包括點突變、堿基插入和缺失、外顯子重復或缺失等，不同類型的突變與癥狀嚴重性有關。國外有資料證明， 所述的MECP2基因存在10個左右的突變熱點，約占總突變的60% -70% ;通過對MECP2的整個編碼區(qū)進行雙向測序和/或突變掃描，可檢測80%的經典Rett綜合征和40%的不典型Rett綜合征患者。但是,通過MLPA方法可發(fā)現30%經測序分析未見突變的經典Rett綜合征患者的MECP2基因外顯子、多個外顯子和整個基因缺失，以及7%未發(fā)現突變的不典型 Rett綜合征患者的MECP2基因顯子、多個外顯子和整個基因缺失。
70年代，染色體G帶技術發(fā)現了顯微鏡下可見的染色體異常如缺失、重復、易位和倒置，從而明確了多種相關的染色體非平衡異常，但是傳統(tǒng)光學顯微鏡對于染色體結構異常的最大分辨率在5-10Mb，高分辨率顯帶技術也就在3-5Mb，而限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)分析，磁場凝膠電泳(PFGE)和熒光原位雜交(FISH)對于基因組的分辨率達到了 IO4-1O6水平。目前，以微陣列平臺為基礎的全基因組拷貝數變異分析技術的出現和迅速發(fā)展，使得定位和片斷大小的精確性進一步提升，為染色體異常疾病的病因的解釋做出了革命性的貢獻。
2004年兩個研究小組幾乎同時在Nature和Science上報道了人體內拷貝數變異 (Copy number variations, CNVs)現象的存在,其在整個基因組中覆蓋的核苷酸總數遠遠超過SNP的總數。所述的CNVs廣泛的存在于人類基因組，拷貝數的變化將影響一個較寬區(qū)域的基因組序列和很多可能基因的變化，故CNVs在研究人類遺傳性疾病方面的巨大潛力。 大量研究表明，精神性疾病、神經性疾病、先天性疾病等都存在人類基因組CNV的異常，其中，所述的CNVs主要指介于Ikb和3Mb的DNA片段多態(tài)性，其恰好處于顯微鏡和高分辨率觀測范圍之間，屬于亞微觀范疇，可通過如熒光定量PCR、FISH、MLPA及微陣列技術等進行檢測。
目前，臨床通常采用檢測基因組拷貝數變異的方法檢測上述染色體微缺失綜合征，但該方法存在以下缺點核型分析的分辨率有限，僅可以檢測到大于5Mb的重復/缺失; 定量PCR，通量低，不適于多位點的篩查檢測；FISH:每個探針僅能檢測一個位點，周期長， 成本高;Array平臺的芯片檢測，成本高于MLPA，不適用于大樣本的篩查。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供涉及染色體微缺失綜合征的分子探針，具體涉及用于診、查染色體微缺失綜合 征的分子組合探針。該探針可用于診斷、篩查常見的6種染色體微缺失綜合征。
本發(fā)明的分子組合探針為一種可用于MLPA實驗方法的探針，可針對臨床上單純依賴表型明確診斷較為困難、與智力發(fā)育相關的染色體微缺失綜合征(Williams綜合征、 22qll微缺失綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、15ql3. 3微缺失綜合征和 Rett綜合癥)進行經濟、快速的篩查。
具體而言，本發(fā)明的用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針，其特征在于，包括Williams綜合征、22qll微缺失綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、 15ql3. 3微缺失綜合征和Rett綜合癥的關鍵基因或關鍵區(qū)域內的基因，或重復/缺失片段內兩端的基因，以及滿足相應條件的探針序列和引物序列，和磷酸化標記。
本發(fā)明的組合探針可用于上述6種染色體微缺失患者的早期臨床診斷及篩查。
本發(fā)明中，所選擇的目的基因序列由http://Renome. ucsc. edu/CR1-bin/hRBlat 獲得，并區(qū)別標記編碼區(qū)、SNP及重復序列。
本發(fā)明中，所述的探針均由左半序列和右半序列組成，左半序列5’端至3’端依次為左通用引物序列、左半探針序列；右半序列5’端至3’端依次為憐酸標記、右半探針序列、右通用引物序列。左、右探針序列與靶序列相同，并可在連接酶的作用下直接相連；
本發(fā)明中，所述探針的左、右序列滿足如下條件(I)序列長度唯一性；(2)GC含量在50%左右；(3) Tm值彡70V ； (4)在連接位點不含SNP ； (5)無二級結構；(6)在人類基因組內無相同重復序列；(7)序列加通用引物，磷酸標記。
本發(fā)明中，所述的序列在人類基因組內是否為特異性序列，可通過http:// genome, uses, edu/cg1-bin/hgBlat在線講行檢測;GC含量檢測、Tm值檢測采用RawProbe 軟件;二級結構的檢測http://mfold. rna. albany. edu在線講行。本發(fā)明中，所述的序列由Intrviogen公司化學合成。
本發(fā)明中，所述的探針針對的基因分別為
(I)Williams Beuren 綜合征FKBP6、TBL2、STX1A、LIMKl ；
(2)22qll 微缺失綜合征CLTCL1、HIRA、TBXl、SNAP29、ZNF74 ；
(3) Prader-Wi 11 i/AngeIman 綜合征NDN、UBE3A、GABRB3、0CA2 ；
(4) 15ql3. 3 缺失綜合征TRPM1、KLF13 ；
(5) Rett 綜合征MECP2 ；
(6)以及兩個性別標志基因chX (HNRPH2)、chY (SRY)。
本發(fā)明中，所述的探針采用化學方法合成。
本發(fā)明中，合成后的序列，單個分裝，粉末試劑；按照每個序列所標記的nmol值， 加TE稀釋至100 μ M濃度儲存，取出10 μ I儲存液，加去離子滅菌水稀釋至I μ M作為工作液。將所有序列混合，加去離子滅菌水最終稀釋至lfmol/μ 1，制得工作濃度的探針混合液；
所述的探針混合液，可用于多重連續(xù)探針擴增技術；
本發(fā)明中，所述的試劑采用MRC公司的Ρ200探針空白試劑盒，其操作步驟為
I) DNA變性標記O. 2ml Eppendorf管或8聯管；加入5 μ I DNA，其中DNA總量在 150-200ng ;在PCR儀上啟動MLPA程序98°C 5分鐘，使DNA樣本變性，冷卻至25°C，取出；
2)雜交反應制備雜交混合液，每個反應包括1. 5μ I的MLPA緩沖液(黃色管)+1. 5 μ I探針(黑色管)，充分混勻；在PCR儀到達25°C時，每管加3 μ I雜交混合液，混勻。繼續(xù)MLPA程序95°C I分鐘，后60°C雜交16-20小時；
3)連接反應制備連接混合液，每個反應包括3 μ I連接酶-65緩沖液A (透明色管)+3 μ I連接酶-65緩沖液B (白色)+25 μ I去離子水，充分混勻；每個反應加I μ I連接酶-65(綠色管)，輕柔混勻。繼續(xù)MLPA程序，在54°C暫停；在PCR儀到達54°C時，每管加 32 μ I連接混合液，混勻；繼續(xù)MLPA程序54°C 15分鐘(連接)，98°C 5分鐘使連接酶失活， 后在15°C暫停；
4) PCR反應標記新的PCR 8聯管。制備PCR緩沖混合液，每個反應包括4 μ I SALSAPCR緩沖液(紅色管)+26 μ I去離子水，充分混勻；在新的8聯管中，每管加入30 μ I PCR緩沖混合液；在室溫下，將10 μ I連接產物加入相應的新8聯管中；制備聚合酶混合液， 每個反應包括2 μ I SALSAPCR引物(棕色管)+2 μ I SALSA酶緩沖液(藍色管)+5. 5 μ I去離子水+0. 5 μ I SALSA聚合酶(橘紅色管)，輕柔混勻，使用前4°C保存；繼續(xù)MLPA程序，在 60°C暫停。在PCR儀到達60°C時，每管加10 μ I聚合酶混合液，混勻；立刻繼續(xù)MLPA程序 35個循環(huán)95°C 30秒、60°C 30秒、72°C 60秒，后72°C 20分鐘，在15°C暫停；
5)毛細管電泳檢測PCR產物。
上述技術方案中所有基本分子生物學操作均參照MRC公司的《Synthetic probe design))和((Protocol MLPA_v29》。
本發(fā)明的優(yōu)點是；
提供用多重連續(xù)探針擴增技術的組合探針，針對發(fā)病率相對較高、病因為染色體結構重復或缺失、臨床常規(guī)檢測方法難以確診的Williams綜合征、22qll微缺失綜合征、 Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、15ql3. 3微缺失綜合征和Rett綜合癥等6種綜合征進行臨床分子診斷篩查，其中的多重連接依賴式探針擴增法(Multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)能克服突光定量PCR的缺點，一次能夠分析多個序列，并具有更高的分辨率、靈敏度和可重復性的優(yōu)點。同時，所述的MLPA較微陣列技術和 FISH的檢測方法經濟、快捷，針對性更強，適合作為臨床的常規(guī)檢測方法。所述的探針可用于上述6種染色體微缺失綜合征的。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的組合探針進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發(fā)明的范圍內對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內。
圖1為本發(fā)明中探針序列模建圖，其中，藍色部分為通用引物序列，紫色部分為與靶序列結合部位。綠色為靶序列。
圖2為本發(fā)明中MLPA操作步驟PCR設定程序示意圖。
圖3為本發(fā)明中陰性病例檢測結果原始圖像，其中，淺色峰為每個位點正常人拷貝數水平，深色峰為病例拷貝數水平，檢測病例各位點拷貝數與正常對照相同。
圖4為本發(fā)明中陽性病例檢測結果原始圖像，其中，淺色峰為每個位點正常人拷貝數水平，深色峰為病例拷貝數水平，21號染色體涉及5個位點(箭頭指示)，拷貝數均低于正常對照。
具體實施方式
實施例1
常見染色體疾病及其關鍵基因的選擇
參考 http://www.ncb1.nlm.nih.Rov/sites/GeneTests/Review db = GeneTests中對WS、22Q11、PWS、AS、15ql3. 3微缺失和Rett綜合征6種綜合征的描述，根據該描述及已發(fā)表的相關文獻報道，選擇關鍵基因或關鍵區(qū)域。若尚未明確關鍵基因或關鍵區(qū)域，
(I)探針序列的設計
選擇的目的基因序列在http://Renome. ucsc. edu/CR1-bin/hRBlat獲得，并區(qū)別標記編碼區(qū)、SNP及重復序列。
針對每個目的基因，探針均由左半序列和右半序列組成，左半序列5’端至3’端依次為左通用引物序列、左半探針序列；右半序列5’端至3’端依次為憐酸標記、右半探針序列、右通用引物序列。左、右探針序列與目的基因的目的序列相同，并可在連接酶的作用下直接相連，如圖1所示。
左、右序列滿足如下條件1)序列長度唯一性；2)GC含量在50%左右；3)Tm值 ^ 700C ；4)在連接位點不含SNP ；5)無二級結構；6)在人類基因組內無相同重復序列。
序列GC含量檢測、Tm值檢測采用Raw Probe軟件，如圖3所示；二級結構的檢測 http://mfold. rna. albany. edu在線進行,如圖4所示；在人類基因組內是否為特異性序歹lj，http: //genome, uses, edu/cg1-bin/hgBlat 在線進行檢測,如圖 5 所示。
(2)探針序列的合成
將設計好的序列，由Invitrogen公司合成。
實施例2
(I)陰性病例對照
選擇正常人群，QIAgen試劑盒提取全基因組DNA后，進行MLPA實驗，應用 Genemarker Demo1. 80版本軟件,進行數據分析。結果如圖3所示。
(2)陽性病例對照
選擇9例22qll綜合征，經商業(yè)化MLPA試劑盒檢測驗證，明確為22qll綜合征患者作為陽性對照，QIAgen試劑盒提取全基因組DNA后，進行MLPA實驗，應用GenemarkerDemo1. 80版本軟件，進行數據分析(如圖4所示)。
權利要求
1.用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針，其特征在于，包括Williams綜合征、22qll微缺失綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、15ql3. 3微缺失綜合征和Rett綜合癥的關鍵基因或關鍵區(qū)域內的基因，或重復/缺失片段內兩端的基因，以及滿足相應條件的探針序列和引物序列，和磷酸化標記。
2.按權利要求1所述的用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針，其特征在于，所述的探針序列由左半序列和右半序列組成，左半序列5’端至3’端依次為左通用引物序列、左半探針序列；右半序列5’端至3’端依次為憐酸標記、右半探針序列、右通用引物序列；所述的左、右探針序列與靶序列相同，并可在連接酶的作用下直接相連；所述探針的左、右序列滿足如下條件(1)序列長度唯一性；(2)GC含量在50%左右；(3)Tm 值≥ 700C ；(4)在連接位點不含SNP；(5)無二級結構；(6)在人類基因組內無相同重復序列；(7)序列加通用引物，磷酸標記。
3.按權利要求1所述的用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針，其特征在于，所述的探針序列針對的基因為(1)WilliamsBeuren 綜合征:FKBP6、TBL2、STX1A、UMKl ；(2)22qll微缺失綜合征CLTCL1、HIRA、TBX1、SNAP29、ZNF74 ；(3)Prader-Wi 11 i/AngeIman 綜合征NDN、UBEM、GABRB3、OCA2 ；(4)15ql3. 3 缺失綜合征TRPMU KLF13 ；(5)Rett 綜合征MECP2 ；(6)以及兩個性別標志基因chX(HNRPH2)、chY(SRY)。
4.按權利要求1所述的用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針，其特征在于，所述的探針采用化學方法合成。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及用于診、查染色體微缺失綜合征的分子組合探針。本發(fā)明選擇Williams綜合征、22q 11微缺失綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、15q13.3微缺失綜合征和Rett綜合癥的關鍵基因或關鍵區(qū)域內的基因、或重復/缺失片段內兩端的基因，根據所述的基因序列，選擇滿足相應條件的序列作為探針序列，在探針左半序列5’端和右半探針3’端加通用引物序列，并加磷酸化標記，制成可用于多重連續(xù)探針擴增技術的組合探針。本發(fā)明的組合探針能克服熒光定量PCR的缺點，一次分析多個序列，具有更高的分辨率、靈敏度和可重復性。可用于上述6種染色體微缺失綜合征的臨床分子診斷篩查。
文檔編號C12Q1/68GK103014142SQ20111028902
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月26日 優(yōu)先權日2011年9月26日
發(fā)明者馬端, 王慧君, 朱海濤, 錢琰琰 申請人:復旦大學