抑制Na_v1.8的短干擾核酸組合物和方法

專利名稱：抑制Na_v1.8的短干擾核酸組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供單鏈或雙鏈短干擾核酸，所述干擾核酸可導(dǎo)致NavL 8鈉通道基因的 mRNA發(fā)生RNAi誘導(dǎo)的降解；本發(fā)明還提供含這種短干擾核酸的藥物組合物；含這種短干擾核酸的重組載體；抑制mRNA翻譯的方法；抑制多肽表達(dá)的方法；阻斷細(xì)胞膜電位的方法； 阻斷細(xì)胞鈉電流的方法；及抑制慢性疼痛的方法。
背景技術(shù)：
慢性疼痛是由AIDS、癌癥化療、糖尿病或外周神經(jīng)的直接物理?yè)p傷所誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病的主要癥狀。這種神經(jīng)性疼痛通常會(huì)使人高度衰弱，而且耐受治療干預(yù)。神經(jīng)性疼痛的動(dòng)物模式表明，神經(jīng)狀態(tài)維持中的突出特征是外周神經(jīng)中的感覺(jué)傳入神經(jīng)元在損傷后異常的、持續(xù)的超興奮性。此外，一個(gè)常見(jiàn)的臨床發(fā)現(xiàn)是諸如利多卡因這樣的廣譜鈉通道阻斷劑，可強(qiáng)烈地抑制神經(jīng)性疼痛。但仍不清楚各種鈉通道亞型在神經(jīng)性疼痛方面的相對(duì)貢獻(xiàn)。電壓門(mén)控鈉通道對(duì)在神經(jīng)元中起始和傳播動(dòng)作電位非常關(guān)鍵。另外，這些通道也參與神經(jīng)興奮性的調(diào)控。因此，電壓門(mén)控鈉通道在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)間傳遞疼痛信息方面具有重要作用。外周神經(jīng)損傷可引起鈉通道積累在損傷位點(diǎn)周?chē)某跫?jí)傳入膜上。這導(dǎo)致受損傳入及其周?chē)词軗p神經(jīng)元的重復(fù)放電以及興奮性增加。興奮性的增加在表達(dá)神經(jīng)性疼痛方面是非常關(guān)鍵的。在腦、神經(jīng)元和橫紋肌中至少鑒定出10種不同的鈉通道異構(gòu)體。鈉通道的主要成分是形成通道孔的260kDa的α-亞基。α -亞基由4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域DI、DII、DIII和DIV組成，每種又含有6個(gè)跨膜部分S1-S6。絕大多數(shù)鈉通道均與輔助型β-亞基β 1-β 4相連， 其平均分子量為30kDa。β -亞基可調(diào)控這些通道的表達(dá)水平及開(kāi)關(guān)。在PNS中主要表達(dá)3種鈉通道異構(gòu)體，即NavL 7,NavL 8和NavL 9。其中NavL 7廣泛存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)中，從而在khwarm細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中存在于所有類(lèi)型的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中。NavL 7對(duì)納摩爾量的河豚毒素敏感。NavL 8僅存在于感覺(jué)傳入神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中。NavL 8通道對(duì)河豚毒素高度耐受，IC50高于50 μ Μ。 NavL 9也在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的小纖維中表達(dá)，而且也耐受納摩爾濃度的河豚毒素，但半數(shù)最大阻斷量是約40 μ M河豚毒素。最近對(duì)尋找治療疼痛的治療性靶點(diǎn)的研究集中在在成熟的背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中所發(fā)現(xiàn)的抗河豚毒素的鈉通道。已知其一個(gè)重要部分是疼痛敏感的“傷害性感受器”。這種鈉通道的一種是NavL 8，以前被認(rèn)為是ΡΝ3或外周神經(jīng)鈉通道類(lèi)型3。已發(fā)現(xiàn)該通道在慢性疼痛疾病中，在背根神經(jīng)節(jié)中是上調(diào)的。另外，NavL 8的理化特性使該通道成為在損傷后維持外周神經(jīng)持續(xù)地重復(fù)放電的一種可能候選物。另外，NavL 8的表達(dá)被限制在背根神經(jīng)節(jié)的感覺(jué)神經(jīng)元外周，這表明阻斷該通道可能以最小副作用減輕神經(jīng)性疼痛。但由于目前可獲得的鈉通道阻斷劑不能區(qū)分鈉通道亞型，因此這種可能性沒(méi)有進(jìn)行藥理學(xué)檢測(cè)。已在神經(jīng)性疼痛的動(dòng)物模型中使用針對(duì)NavL 8表達(dá)的反義脫氧寡核苷酸來(lái)檢測(cè)該通道的選擇性衰減表達(dá)是否可減輕神經(jīng)性疼痛。參見(jiàn)Porreca等〃 A comparison of the potential role of the tetrοdotoxin-insensitive sodium channels, PN3/SNS and NaN/SNS2, in rat models of chronic pain " , Proc. Nat. Acad. ScL, vol.96, pp. 7640-7644(1999)。已發(fā)現(xiàn)通過(guò)反義脫氧寡核苷酸抑制NavL 8的表達(dá)可在其他動(dòng)物疼痛模型中抑制慢性疼痛。參見(jiàn)^shimura等〃 The involvement of the tetrodotoxin-resistant sodium channel NavL 8(PN3/SNS)in a rat model of visceral pain “ , J. Neuroscience, vol.21, pp.8690-8696(2001)；禾口 Khasar 等“A tetrodotoxin-resistant sodium current mediates inflammatory pain in the rat"， Neuroscience Letters, vol. 256, no. 1，pp. 17-20(1998)。進(jìn)一步的數(shù)據(jù)表明通過(guò)針對(duì) NavL 8的特異反義寡核苷酸選擇性敲減背根神經(jīng)節(jié)中的NavL 8蛋白抑制了由脊髓神經(jīng)連接損傷所引起的痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)超敏。參見(jiàn)Kim等〃 An experimental model for peripheral neuopathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat“， Pain, vol. 50，pp. 355-363 (1992)。以上數(shù)據(jù)表明NavL 8在幾種外周神經(jīng)性和發(fā)炎性疾病中的病理生理作用。但反義寡核苷酸在治療上的用途由于其體內(nèi)的不穩(wěn)定性、有限的效率和可能產(chǎn)生 “脫靶”效應(yīng)而受到限制。由于沒(méi)有確定可特異阻斷NavL 8的小分子，因此在治療疼痛時(shí)仍然需要調(diào)控NavL 8的替代途徑。本發(fā)明通過(guò)提供特異敲減NavL 8表達(dá)的短干擾核酸和 siRNAs而滿足上述需求。siRNA由于高效的靶特異性、降低的脫靶可能性，其用途備受矚目，可進(jìn)行高效的抑制作用。代表短干擾RNA或小干擾RNA的siRNA是一種RNA干擾(RNAi) 方式。RNAi是一種通過(guò)降解細(xì)胞中特異的mRNA靶標(biāo)、從而敲減或下調(diào)編碼的蛋白的水平來(lái)研究基因功能的技術(shù)。siRNA的作用機(jī)制包括多步驟過(guò)程。首先，雙鏈RNA(dsRNA)被 RNase III家族成員識(shí)別，并被切割為21到23個(gè)核苷酸的siRNAs。然后，siRNAs整合到稱為RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的RNAi靶復(fù)合物中。RISC是一種可識(shí)別靶mRNA的雙功能螺旋酶和RNase。在識(shí)別靶mRNA后，RISC與mRNA結(jié)合，并松開(kāi)siRNA，這可使siRNA 的反義鏈通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)(Watson-Crick堿基配對(duì))而與靶mRNA結(jié)合。這可引起mRNA 的水解和破壞，導(dǎo)致蛋白表達(dá)降低。另外，siRNA顯然可進(jìn)行再循環(huán)，從而使一種siRNA分子可誘導(dǎo)切割約1000個(gè)mRNA分子。因此，siRNA介導(dǎo)的RNAi比目前已有的抑制靶基因表達(dá)的技術(shù)更有效。本文所包括的所有參考文獻(xiàn)、出版物、專利申請(qǐng)和專利均作為參考并入本文中。發(fā)明概述本發(fā)明涉及特異針對(duì)并引起NavL 8鈉通道基因的mRNA發(fā)生RNAi誘導(dǎo)的降解的短干擾核酸以及使用這種干擾核酸的方法。本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案提供了一種包含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
和11或其類(lèi)似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸。該分離或重組短干擾核酸可進(jìn)一步包括3'突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明一個(gè)選擇性的技術(shù)方案提供了一種包含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10和11或其類(lèi)似物的核苷酸序列、并進(jìn)一步包含其互補(bǔ)核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸，。該分離或重組短干擾核酸可進(jìn)一步包括3'突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。另一個(gè)技術(shù)方案提供了一種包含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11
或其類(lèi)似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸、進(jìn)一步包含其互補(bǔ)核苷酸序列，其中核苷酸序列和互補(bǔ)核苷酸序列可雜交形成雙鏈體。核苷酸序列和互補(bǔ)核苷酸序列各自均可進(jìn)一步含有3'突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。另外一個(gè)技術(shù)方案提供了一種包含有義鏈和反義鏈的分離或重組短干擾核酸，其中有義鏈和反義鏈可雜交形成雙鏈體，其中有義鏈含與靶序列基本同一的核苷酸序列，其中靶序列選自SEQ ID N0s:12-577。有義鏈和反義鏈可進(jìn)一步含有3‘突出端。還提供了一種含上述任何一種或多種短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案提供了一種含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和 11或其類(lèi)似物中一種或多種核苷酸序列的重組載體。另一個(gè)技術(shù)方案提供了一種抑制mRNA翻譯為多肽的方法，包括將能夠表達(dá)NavL 8 mRNA的細(xì)胞與一個(gè)或多個(gè)含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類(lèi)似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸相接觸。一個(gè)選擇性技術(shù)方案提供了一種抑制多肽表達(dá)的方法，包括將能夠表達(dá)NavL 8多肽的細(xì)胞與一個(gè)或多個(gè)含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類(lèi)似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸接觸。另一個(gè)選擇性技術(shù)方案提供了一種阻斷細(xì)胞中NavL 8來(lái)源的膜電位的方法，包括將表達(dá)NavL 8多肽的細(xì)胞與一個(gè)或多個(gè)含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11 或其類(lèi)似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸接觸。另外一個(gè)技術(shù)方案提供了一種阻斷細(xì)胞中NavL 8來(lái)源的鈉離子流的方法，包括將表達(dá)NavL 8多肽的細(xì)胞與一個(gè)或多個(gè)含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其類(lèi)似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸接觸。進(jìn)一步的技術(shù)方案提供了一種抑制慢性疼痛的方法，包括對(duì)患者給藥有效劑量的藥物組合物，所述藥物組合物含有一種或多種含選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 和11或其類(lèi)似物的核苷酸序列的分離或重組短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。上述分離或重組短干擾核酸可進(jìn)一步包含3'突出端。發(fā)明的詳細(xì)描述本文所有引用的出版物均作為參考并入本文中。定義本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指與有義鏈互補(bǔ)的核酸序列。
本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)“慢性疼痛”定義為持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間的疼痛。 本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指與另一個(gè)核苷酸序列進(jìn)行Watson-Crick堿基配對(duì)
5的核苷酸序列，即嘌呤與嘧啶結(jié)合。例如，一個(gè)核苷酸序列可代表有義鏈，而其互補(bǔ)的核苷酸序列則表示反義鏈。本文所用術(shù)語(yǔ)“雙鏈體”是指兩個(gè)可雜交的互補(bǔ)核酸序列，例如有義鏈和反義鏈。本文所用術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”、“表達(dá)”和“表達(dá)”是指核酸通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生多肽的分子生物學(xué)過(guò)程，即在該過(guò)程中，遺傳信息從基因傳到蛋白質(zhì)，使基因的作用表現(xiàn)出來(lái)。術(shù)語(yǔ)“同源性，，和“同源的，，是指兩個(gè)核酸序列間的比較，當(dāng)序列進(jìn)行比對(duì)和比較時(shí)，它們具有相似性。兩個(gè)核酸序列間的同源性可通過(guò)序列比較或基于雜交的條件進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)考慮到核苷酸插入或缺失而進(jìn)行優(yōu)化比對(duì)時(shí)，如果兩個(gè)序列(或其互補(bǔ)鏈)的核苷酸殘基一樣，說(shuō)明具有核苷酸序列同源性。當(dāng)一個(gè)核苷酸序列可與另一個(gè)序列在選擇的雜交條件下進(jìn)行雜交時(shí)，則也存在同源性。在用來(lái)確定同源性的雜交中所用條件的嚴(yán)謹(jǐn)度依賴于諸如鹽濃度、溫度、是否存在有機(jī)溶劑及其他參數(shù)這樣的固素。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“敲減”是指降低mRNA表達(dá)水平，從而減少mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“敲除”是指抑制mRNA表達(dá)，從而使mRNA不能翻譯為蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語(yǔ)“mRNA”是指信使RNA。本文所用術(shù)語(yǔ)“膜電位”是指細(xì)胞膜兩側(cè)電荷的差異。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“疼痛”是指身體的疼痛，例如身體不舒服的感覺(jué)，從輕微的不適到極度難受或痛苦，通常是由疾病、損傷或脅迫造成的結(jié)果；或神經(jīng)上的疼痛，例如頭腦不適、精神沮悲痛、痛苦、焦慮或憂傷。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“RNAi ”是指RNA干擾，是一種通過(guò)降解細(xì)胞或生物中特異的mRNA 靶標(biāo)、從而敲除或敲減所編碼蛋白的水平來(lái)研究基因功能的技術(shù)。也稱為RNA沉默。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“有義鏈”是指核酸的編碼鏈。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“siRNA”是指短或小干擾核糖核酸，是RNA干擾中RNA沉默機(jī)制的一種類(lèi)型。本申請(qǐng)中所定義的“短干擾核酸”是指脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或二者聯(lián)合的短干擾段。該術(shù)語(yǔ)也包括核酸的修飾和非常規(guī)堿基。優(yōu)選地，短干擾核酸是siRNA。本文所用術(shù)語(yǔ)“鈉電流”是指一部分由鈉離子作用產(chǎn)生的細(xì)胞膜電位。術(shù)語(yǔ)“患者”是指人和非人動(dòng)物。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”是指通過(guò)諸如使用病毒來(lái)向細(xì)胞中導(dǎo)入核酸。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄”是指由雙鏈DNA合成單鏈RNA的分子生物學(xué)過(guò)程。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“翻譯”是指由mRNA合成多肽的分子生物學(xué)過(guò)程。本文所用術(shù)語(yǔ)“治療”是指疾病或紊亂的治療、預(yù)防或抑制方法，可產(chǎn)生任何臨床所要的或有益的效果，包括但不限定于，減輕一個(gè)或多個(gè)癥狀，降低、減緩或停止疾病或紊亂的發(fā)展。NavL 8 特征NavL 8鈉通道含一個(gè)α亞基和至少一個(gè)β亞基。NavL 8完整的開(kāi)放閱讀框的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列在本領(lǐng)域是已知的。例如，鼠NavL 8的核酸序列和氨基酸序列分別為美國(guó)專利No. 6，451，554中的SEQ ID NOs :1和2。NavL 8及其亞基的核酸序列和氨基酸序列也可在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，如以下表1所示。表 1
物種核酸序列的GenBank 序列號(hào)氨基酸序列的GenBank 序列號(hào)大鼠NM 017247NP 058943人AF 117907AAO 30863人NavL 8基因與鼠NavL 8基因具有較高的同源性，約為82%。因此，與可敲減鼠NavL 8鈉通道的鼠NavL 8短干擾核酸相對(duì)應(yīng)的人NavL 8短干擾核酸可能會(huì)有效敲減人 NavL 8鈉通道。核酸含針對(duì)NavL 8 mRNA的短干擾核酸的組合物和方法可用于敲減或敲除NavL 8鈉通道的表達(dá)，從而治療慢性疼痛。具體地，本發(fā)明的短干擾核酸可引起NavL 8 mRNA RNAi介導(dǎo)的破壞。在慢性疼痛疾病中，背根神經(jīng)節(jié)中的NavL 8鈉通道是上調(diào)的。因此，能夠敲減或敲除NavL 8 mRNA表達(dá)以及NavL 8功能的短干擾核酸序列可用于阻止或治療慢性疼痛。因此，本發(fā)明提供了分離的或重組的短干擾核酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“分離的”是指基本上是從通常在細(xì)胞或重組表達(dá)系統(tǒng)中所發(fā)現(xiàn)的其他成分中分離出來(lái)的核酸，例如RNA或 DNA分子或混合的多聚體。這些成分包括，但不限定于，核糖體、聚合酶、血清成分及旁側(cè)基因組序列。因此該術(shù)語(yǔ)包括從天然環(huán)境中分離出來(lái)的短干擾核酸，包括重組或克隆的短干擾核酸分離物及化學(xué)合成的類(lèi)似物或通過(guò)異源系統(tǒng)生物合成的類(lèi)似物。充分純化的分子包括分子的分離形式。分離的核酸通常是分子的同源成分，但在某些技術(shù)方案中，也含有較小的異源性。 這種異源性典型地存在于核酸編碼序列的末端或?qū)λ枭锕δ芑蚧钚圆魂P(guān)鍵的區(qū)域。“重組的”短干擾核酸通過(guò)其生產(chǎn)方法或結(jié)構(gòu)來(lái)定義。因此某些重組核酸是通過(guò)使用涉及人工干預(yù)——例如操作或篩選的重組DNA技術(shù)制備的。其他是通過(guò)將兩個(gè)天然不相鄰的片段融合而制備的。包括載體和含使用任何合成寡核苷酸過(guò)程獲得的序列的核酸。短干擾核酸可以是單鏈或雙鏈的。單鏈短干擾核酸含有義鏈，而雙鏈短干擾核酸含有義鏈和反義鏈。優(yōu)選地，雙鏈短干擾核酸中的有義和反義鏈可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的 Watson-Crick堿基配對(duì)作用雜交而形成雙鏈體或通過(guò)單鏈發(fā)卡區(qū)連接。已知第二種形式的siRNA分子的發(fā)卡區(qū)可被“Dicer”蛋白或其等價(jià)物進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)切割，從而形成兩個(gè)獨(dú)立的堿基配對(duì)的RNA分子的siRNA。短干擾核酸的長(zhǎng)度為17到四個(gè)核苷酸，優(yōu)選地為19到25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為 21到23個(gè)核苷酸，最優(yōu)選地為21個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，短干擾核酸是siRNA。即，所有核苷酸在序列上是核糖核苷酸堿基。但本發(fā)明也包括小干擾核酸的類(lèi)似物。短干擾核酸的類(lèi)似物包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的增加、缺失、變換、替代或修飾。例如，短干擾核酸可被變換、替代或修飾以含一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸堿基或非常規(guī)堿基或這些任意組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的短干擾核酸的一條或兩條鏈含有3'突出端。本文所用“3'突出端”是指從短干擾核酸鏈的3'端延伸出來(lái)的至少一個(gè)未匹配的核苷酸。3'突出端可以從1到6個(gè)核苷酸(包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，優(yōu)選地為1到5個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為1到4個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選地為2到4個(gè)核苷酸，最優(yōu)選地為2個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案中，雙鏈體的有義和反義鏈含3 ‘突出端。雙鏈體每條鏈的突出端長(zhǎng)度可以相同或不同。更優(yōu)選地，3'突出端存在于雙鏈體的兩條鏈中，每條鏈的突出端長(zhǎng)度為2個(gè)核苷酸。例如，雙鏈體的每條鏈可含二胸腺嘧啶酸(“tt")或二尿嘧啶酸(“uu“)的3'突出端。為了增強(qiáng)短干擾核酸的穩(wěn)定性，3'突出端也是抗降解而穩(wěn)定的。在一個(gè)技術(shù)方案中，3'突出端通過(guò)含有諸如腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤核苷酸這樣的嘌呤核苷酸來(lái)穩(wěn)定。選擇性地， 通過(guò)修飾的類(lèi)似物替代嘧啶核苷酸，例如用2'-脫氧胸腺嘧啶替代在3'突出端的尿嘧啶核苷酸，可耐受且不影響RNAi降解的效率。特別是，2'-脫氧胸腺嘧啶中的2'羥基顯著地增強(qiáng)3'突出端在組織培養(yǎng)基中對(duì)核酸酶的抗性。短干擾核酸作用于NavL 8靶mRNA。本文所用的“作用于NavL 8靶mRNA”的短干擾核酸是指其有義鏈的核苷酸序列與靶mRNA相同或基本相同，并可誘導(dǎo)RNAi介導(dǎo)的mRNA降解的單鏈或雙鏈短干擾核酸。當(dāng)然，雙鏈siRNA的反義鏈的序列與siRNA有義鏈和靶mRNA互補(bǔ)。本文所用與靶序列“基本同一”的短干擾核酸是指與靶序列有1-4個(gè)核苷酸差異的核酸序列。例如，短干擾核酸可含有與靶序列有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)核苷酸差異的有義鏈——只要RNAi介導(dǎo)的靶mRNA降解是由短干擾核酸誘導(dǎo)的即可。本文所用的“靶mRNA”或“靶序列”是指人NavL 8 mRNA、NavL 8 mRNA的突變體或選擇的拼接形式，或關(guān)聯(lián)的(Cognate)NavL 8基因的mRNA。本文所用術(shù)語(yǔ)“突變體”是指與靶mRNA有核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸替代或核苷酸修飾這些差異的短干擾核酸。這種改變可包括例如諸如在短干擾核酸的末端或短干擾核酸一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸中增加非核苷酸材料；使短干擾核酸抗核酸酶消化的修飾；或用脫氧核糖核苷酸對(duì)短干擾核酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸進(jìn)行替代。本文所用術(shù)語(yǔ)“關(guān)聯(lián)的”是指來(lái)源于其他哺乳動(dòng)物種的核酸。 應(yīng)理解人NavL 8 mRNA可含有與其關(guān)聯(lián)物或突變體共有的靶序列。因此，含這種共有靶序列的單個(gè)短干擾核酸可誘導(dǎo)含共有靶序列的不同種類(lèi)RNA的RNAi介導(dǎo)的降解。本發(fā)明的短干擾核酸可作用于任何靶mRNA序列中約19_25個(gè)連續(xù)核苷酸片段。篩選短干擾核酸的靶序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。另外，靶mRNA上的靶序列可選自對(duì)應(yīng)于靶 mRNA的給定cDNA序列，優(yōu)選地從起始密碼子50到100個(gè)核苷酸下游——即以3 ‘方向開(kāi)始。不過(guò)靶序列可以位于5'或3'非翻譯區(qū)，或在臨近起始密碼子的區(qū)域。NavLS cDNA 序列中合適的靶序列如實(shí)施例1所示。本發(fā)明的短干擾核酸可含有部分純化的核酸，基本純化的核酸，合成的核酸或重組產(chǎn)生的核酸。本文術(shù)語(yǔ)“基本純化的”是指短干擾核酸不含其他污染蛋白、核酸及其它來(lái)源于初級(jí)原料生物或重組DNA表達(dá)系統(tǒng)的生物物質(zhì)。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定純度，典型地至少要高于50 %、優(yōu)選地至少高于75 %，更優(yōu)選地至少高于90 %，最優(yōu)選地至少約95 %的純度?？苫谫|(zhì)量或摩爾量估計(jì)純度。本發(fā)明的短干擾核酸可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)來(lái)獲得。另外，短干擾核酸也可通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的、互補(bǔ)的核酸分子，或具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的單個(gè)核酸分子來(lái)合成。例如，本發(fā)明的短干擾核酸可通過(guò)使用合適的保護(hù)性核糖核苷亞磷酰胺和傳統(tǒng)的DNA/RNA合成儀或其他已知的方法進(jìn)行化學(xué)合成。另外，短干擾核酸可由商品供應(yīng)商，例如 Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical(part of Perbio Science, Rockford, IL, USA)、 Glen Research(Sterling, VA, USA)、ChemGenes (Ashland, MA, USA)和 Cruachem(Glasgow，UK)來(lái)產(chǎn)生。選擇性地，短干擾核酸可通過(guò)諸如環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒這樣的重組表達(dá)載體、使用任何合適的啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)。重組表達(dá)載體典型地是含有編碼某種短干擾核酸的核酸的自我復(fù)制的DNA或RNA構(gòu)建體，通常與可在兼容的宿主細(xì)胞中調(diào)控核酸表達(dá)的合適的遺傳控制元件可操作連接在一起。遺傳控制元件包括原核啟動(dòng)子系統(tǒng)或真核啟動(dòng)子表達(dá)控制系統(tǒng)，典型地包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、可選的用來(lái)控制轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的操作子、提高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、編碼合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、翻譯起始位點(diǎn)、多聚腺苷酸位點(diǎn)、及終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)載體也含有可使載體在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)，或諸如可提供抗生素抗性的選擇基因。本發(fā)明所用的載體包括微生物質(zhì)粒、病毒、噬菌體、整合的DNA片段及其他利于核酸整合到宿主基因組中的工具。質(zhì)粒是常用的載體形式，但所有具有相同功能的其他形式的載體——它們?cè)诒绢I(lǐng)域是已知的——均適用于本文中。參見(jiàn)例如，Pouwels et al., Cloning Vectors :A Laboratory Manual,1985 and Supplements, Elsevier, N. Y. , and Rodriguez et al, (eds. ),Vectors :A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA0從質(zhì)粒中表達(dá)本發(fā)明短干擾核酸的合適的啟動(dòng)子包括，例如TO啟動(dòng)子、Hl RNA pol III啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。篩選其他合適的啟動(dòng)子屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。本發(fā)明的重組質(zhì)粒也含有在特定組織或特定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境表達(dá)短干擾核酸的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子。從重組質(zhì)粒表達(dá)的短干擾核酸可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行分離，或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明的短干擾核酸可以以兩個(gè)獨(dú)立的、互補(bǔ)的RNA分子， 或具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)的單個(gè)RNA分子從重組質(zhì)粒中表達(dá)。適于表達(dá)本發(fā)明的短干擾核酸的質(zhì)粒的篩選、向質(zhì)粒中插入表達(dá)短干擾核酸的核酸序列的方法及將重組質(zhì)粒遞送到目標(biāo)細(xì)胞中的方法均屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。例如參見(jiàn)，Tuschl，Nat。Biotechnol, vol. 20，pp.446-448(2002) ；Brummelkamp et al.，Science, vol. 296，pp.550-553(2002)； Miyagishi et al. ， Nat. Biotechnol. ， vol.20, ppl.497-500(2002) ；Paddison et al.， Genes Dev. , vol. 16, pp. 948-958(2002) ；Lee et al. , Nat. Biotechnol. , vol. 20, pp. 500-505(2002) ；Paul et al, Nat. Biotechnol.，vol. 20，pp. 505—508(2002)禾口 Sui et al. , Proc. Natl. Acad. ScL vol 99，2002，PP5515-5520).如實(shí)施例所示，質(zhì)?？珊性谌薝6 RNA啟動(dòng)子控制下、與polyT終止序列可操作連接的有義RNA鏈編碼序列，及在人U6 RNA啟動(dòng)子控制下、與polyT終止序列可操作連接的反義RNA鏈編碼序列。本文所用的“可操作連接”是指編碼有義和反義鏈的核酸序列與另一個(gè)序列相鄰。 優(yōu)選地，編碼有義和反義鏈的序列以5'方向與多聚T終止信號(hào)緊密相鄰。因此，在有義或反義序列從質(zhì)粒中轉(zhuǎn)錄時(shí)，多聚T終止信號(hào)起到終止轉(zhuǎn)錄的作用。本文所用“在啟動(dòng)子控制下”是指編碼有義和反義鏈的核酸序列位于啟動(dòng)子3' 端，從而可使啟動(dòng)子起始有義或反義編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
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短干擾核酸的表達(dá)可通過(guò)傳統(tǒng)的方法在原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行。原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性生物，例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。高等真核生物包括來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞——包括非哺乳動(dòng)物來(lái)源，例如昆蟲(chóng)細(xì)胞和鳥(niǎo)類(lèi)，以及哺乳動(dòng)物來(lái)源，例如人、靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)——的已建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系。多種合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是HEK293細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤/DRG細(xì)胞系ND7/23。本發(fā)明的短干擾核酸也可從重組的病毒載體表達(dá)。本發(fā)明的重組病毒載體含有編碼本發(fā)明的短干擾核酸的序列和任何適于表達(dá)短干擾核酸序列的啟動(dòng)子。從病毒載體中表達(dá)短干擾核酸的合適啟動(dòng)子包括，例如U6啟動(dòng)子、Hl RNApol III啟動(dòng)子和細(xì)胞巨病毒啟動(dòng)子。篩選其他合適啟動(dòng)子的方法屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。本發(fā)明的重組病毒載體也含有在特定組織或特定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中表達(dá)短干擾核酸的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子。在實(shí)施例5中詳細(xì)討論了將本發(fā)明的短干擾核酸遞送到體內(nèi)細(xì)胞的重組病毒載體的用途。本發(fā)明的短干擾核酸可以以兩個(gè)獨(dú)立的、互補(bǔ)的核酸分子，或具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)的單個(gè)核酸分子從重組病毒載體中表達(dá)?？墒褂萌魏慰山邮艽磉_(dá)的短干擾核酸的編碼序列的病毒載體，例如來(lái)源于腺病毒(AV)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒等的載體。另外，也可通過(guò)用外膜蛋白或來(lái)源于其他病毒的其他表面抗原假型包裝載體來(lái)修飾病毒載體的向性。適于本發(fā)明的重組病毒載體的篩選、向載體中插入表達(dá)短干擾核酸的核酸序列的方法及將病毒載體遞送到目標(biāo)細(xì)胞中的方法均屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇。例如參見(jiàn)， Domburg, Gene Therap., vol.2, pp. 301-310(1995) ；Eglitis, Biotechniq[upsilon]es, vol. 6,pp. 608-614(1988) ；Miller,Hum Gene Therap.，vol. l，pp. 5-14(1990)和Anderson, Nature, vol. 392，pp.25—30(1998)。優(yōu)選的病毒載體是來(lái)源于腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒的那些載體。在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明的短干擾核酸可從重組的含U6啟動(dòng)子的腺病毒載體中以單鏈核酸分子表達(dá)。優(yōu)選的病毒載體也可以是皰疹病毒載體。例如參見(jiàn)Burton，Ε. A. et al. , (2005) Curr. Op in. Mo I. Ther. . Aug 7 (4) :326-36 禾口 Yeomans D. D. et al. (2005) -Hum Gene Therap Feb :16(2) :271-7。以下作為示例而非限定，所表達(dá)的單鏈核酸分子可包含兩個(gè)通過(guò)單鏈發(fā)卡區(qū)連接的互補(bǔ)區(qū)。單鏈核酸分子可進(jìn)一步含有3'突出端。體外和體內(nèi)方法可通過(guò)測(cè)定細(xì)胞中RNA或蛋白水平的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)評(píng)估短干擾核酸引起RNAi介導(dǎo)的靶mRNA降解的能力。例如，可將短干擾核酸遞送到培養(yǎng)的細(xì)胞中，通過(guò)Northern印跡、 斑點(diǎn)印跡或定量RT-PCR測(cè)定靶mRNA的水平。選擇性地，培養(yǎng)細(xì)胞中NavL 8蛋白的水平可通過(guò)ELISA或Western印跡測(cè)定。在下面實(shí)施例2中描述了合適的用于測(cè)定本短干擾核酸對(duì)靶mRNA或蛋白水平的作用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。如上所述，本發(fā)明的短干擾核酸針對(duì)并引起NavL 8 mRNA或其選擇性拼接形式、突變體或關(guān)聯(lián)體的RNAi介導(dǎo)的降解。由本短干擾核酸引起的靶mRNA降解可降低NavL 8基因的功能基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供了一種在患者中抑制NavL 8表達(dá)的方法，一種抑制mRNA翻譯的方法，一種抑制多肽表達(dá)的方法，一種阻斷細(xì)胞中NavL 8來(lái)源的膜電位的方法，及一種阻斷細(xì)胞中NavL 8來(lái)源的鈉電流的方法。在本發(fā)明的方法中，阻斷包括但不限定于消除或降低NavL 8來(lái)源的膜電位或NavL 8來(lái)源的鈉電流。雖然這些方法在實(shí)施例中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述，但它們都具有一些共同特征。上述每種方法中的步驟均包括將細(xì)胞與短干擾核酸接觸。在體內(nèi)，接觸步驟包括對(duì)患者給藥作為藥物組合物的短干擾核酸。在體外，接觸步驟包括將細(xì)胞與短干擾核酸物理上臨近，從而使細(xì)胞和短干擾核酸可相互接觸。該接觸步驟可使短干擾核酸進(jìn)入細(xì)胞，并引起RNAi誘導(dǎo)的NavL 8鈉通道基因mRNA的降解。優(yōu)選地，接觸步驟使用序列為SEQ ID NOs :1-11的短干擾核酸。序列為SEQ ID NOs :1、2、3、5、10和11的短干擾核酸是優(yōu)選的。序列為SEQ ID NOs 2和5的短干擾核酸是更優(yōu)選的。序列為SEQ ID NOs :1和3的短干擾核酸是最優(yōu)選的。也可在本發(fā)明的方法中使用序列為SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的一個(gè)或多個(gè)短干擾核酸。以下作為示例而非限定，可在本發(fā)明的方法中使用序列為SEQ ID NOs :1、2、3、5、10和11的一個(gè)或多個(gè)短干擾核酸。另外，在本方法的操作中，應(yīng)理解可對(duì)細(xì)胞或患者同時(shí)或順序給藥本發(fā)明的多個(gè)短干擾核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了與一個(gè)或多個(gè)蛋白和/或靶核酸復(fù)合在一起的本發(fā)明的短干擾核酸以及含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的短干擾核酸的細(xì)胞。藥物組合物本發(fā)明的短干擾核酸和siRNAs可用于治療慢性疼痛。本發(fā)明的各種化合物可作為藥物組合物。例如，藥物組合物可含有單鏈短干擾核酸、具有3'突出端的單鏈短干擾核酸、雙鏈短干擾核酸、每條鏈均具有3'突出端的雙鏈短干擾核酸。優(yōu)選地，藥物組合物含有序列為SEQ ID NOs 1-11的短干擾核酸。序列為SEQ ID NOs :2和5的短干擾核酸是更優(yōu)選的。序列為SEQ ID NOs :1和3的短干擾核酸是最優(yōu)選的?？稍诒景l(fā)明的藥物組合物中使用序列為SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的一個(gè)或多個(gè)短干擾核酸。以下作為示例而非限定，可在本發(fā)明的藥物組合物中使用序列為SEQ ID NOs :1、2、3、5、10和11 的一個(gè)或多個(gè)短干擾核酸。治療性給藥這種物質(zhì)的典型流程是本領(lǐng)域已知的。雖然本發(fā)明的組合物可以以簡(jiǎn)單的溶液給藥，但更典型地是與其他物質(zhì)——例如載體，優(yōu)選地是藥學(xué)上可接受的載體——聯(lián)合給藥。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指任何適于將本發(fā)明的成分遞送給患者的相容的、無(wú)毒的物質(zhì)。例如，無(wú)菌水、乙醇、脂肪、蠟和惰性固體可包括在載體中。藥學(xué)上可接受的佐劑，例如緩沖劑和分散劑也可包括在藥物組合物中。通常，這種藥物用于腸道夕卜給藥的成分是己知的；例如 Remington' s Pharmaceutical Science, 17th Ed。 (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)?？山o藥治療性配方。配方典型地含有至少一種活性成分及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。配方可包括適于口服、直腸、鼻、透皮或腸道外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈和皮內(nèi))給藥的那些。配方可以單位劑量的形式存在或通過(guò)任何制藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法制備。 參見(jiàn)例如 Gilman et al. (eds.) (1990)，The Pharmacological Bases of Therapeutics， 8th Ed.，Pergamon Press ；and Remington ' s Pharmaceutical Sciences，supra， Easton, Penn. ；Avis et al. (eds.) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms !Parenteral Medications Dekker，New York ；Lieberman et al. (eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms !Tablets DekkeriNew York ；and Lieberman et al. (eds.) (1990)，Pharmaceutical Dosage Forms :Disperse Systems Dekker, New York0在實(shí)施例中，本發(fā)明的任何短干擾核酸或載體可通過(guò)透皮給藥。透皮成分可采用面霜、洗液、氣溶膠和/或乳劑形式，可包括在基于此目的的本領(lǐng)域中常用的基質(zhì)或儲(chǔ)液囊類(lèi)型的透皮貼劑中。參見(jiàn)例如，Remington' s Pharmaceutical Science, 17th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)。治療應(yīng)用中的給藥方案可通過(guò)參與的醫(yī)生、考慮各種可能改變治療性物質(zhì)作用的因素——例如患者的癥狀、體重、性別和飲食，感染的嚴(yán)重性、住院時(shí)間及其它臨床因素來(lái)確定。通常，治療劑量從低水平逐漸增加，以獲得最佳安全性和有效性。通常，日常劑量范圍為每千克體重100-500 μ g。典型地，劑量范圍為每千克體重150-250 μ g。優(yōu)選地，劑量為每千克體重200 μ g。在給藥后可根據(jù)更小的分子大小和可能降低的半衰期(清除時(shí)間) 對(duì)劑量進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的組合物的“有效劑量”是可減輕患者慢性疼痛的量。慢性疼痛包括一個(gè)或多個(gè)以下特征疼痛持續(xù)3個(gè)月以上，通過(guò)常規(guī)藥物治療沒(méi)有完全消除的疼痛，或超過(guò)正常恢復(fù)期的疼痛。慢性疼痛的例子包括，但不限定于，慢性神經(jīng)性疼痛和慢性發(fā)炎性疼痛。慢性神經(jīng)性和/或慢性發(fā)炎性疾病的例子包括，但不限定于皰疹后神經(jīng)痛、痛性糖尿病神經(jīng)病、神經(jīng)根病變、神經(jīng)壓迫性損傷(例如腕管綜合征、三叉神經(jīng)痛、腫瘤相關(guān)的神經(jīng)壓迫)、上下腰痛(例如來(lái)自椎間盤(pán)損傷、強(qiáng)直性脊柱炎或未知的病理學(xué)疾病)、I型或II型復(fù)雜性區(qū)域性疼痛綜合癥、神經(jīng)損傷性疼痛(例如截肢后幻肢痛、其它截肢后引起的疼痛癥狀)、神經(jīng)根性撕脫傷、Hiv-相關(guān)的疼痛、化療方案引起的神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病、坐骨神經(jīng)痛、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)過(guò)敏和進(jìn)行性灼傷痛(例如傷口相關(guān)的疼痛， 包括但不限定于手術(shù)后疼痛)、關(guān)節(jié)痛、風(fēng)濕和骨關(guān)節(jié)炎痛、纖維肌痛、燒傷痛、神經(jīng)炎、坐骨神經(jīng)痛、肌腱炎、骨痛、偏頭痛、泌尿生殖器痛、和膀胱反射性亢進(jìn)引起的神經(jīng)性疾病。
實(shí)施例通過(guò)下述以本發(fā)明的示例提供的非限制性實(shí)施例可更好理解本發(fā)明。以下實(shí)施例是為了用于更詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。除非特別說(shuō)明，以下給出的固體混合物中的固體、液體中的液體及液體中的固體的百分比分別基于wt/wt、vol/vol和 wt/vol。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)通常維持無(wú)菌狀態(tài)。材料和通用方法使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法，如Maniatis et al.，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press ； Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, (2d ed. ), Vols 1-3, 1989, Cold Spring Harbor Press, NY ；Ausubel et al. , Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY 或 Ausubel, et al. (1987 and Supplements), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York ；禾口 lnnis et al. (eds. )PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, N. Y 中所述。實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明針對(duì)NavL 8的siRNAs的設(shè)計(jì)。針對(duì)鼠和人NavL 8編碼序列的推定的SiRNA序列通過(guò)Tuschr s預(yù)測(cè)原則進(jìn)行鑒定。參見(jiàn)Tuschl等〃 Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro“ ，Genes Dev.，vol.13, no. 24, pp. 3191-3197 (Dec. 15，1999)；和 Elbashir et al.， “ Duplexes of 21—nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells" , Nature, vol.411,pp. 494-498(2001)。表2確定了針對(duì)人NavL 8編碼序列的推定的siRNA序列。也列出靶序列、每個(gè)靶序列在基因中的位置及靶序列中鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶的百分比。表3確定了針對(duì)鼠NavL 8編碼序列的推定的siRNA序列。也列出靶序列和每個(gè)靶序列在基因中的位置。表2人 PN3 siRNAs
權(quán)利要求
1.一種分離的或重組的短干擾核酸或其類(lèi)似物，其中，所述的短干擾核酸含有選自SEQ ID NOs :2、3、4、5、6、7、8、9、10 或 11 的核苷酸序列；優(yōu)選地，所述的分離的或重組的短干擾核酸包含選自SEQ ID NOs :2、3、5、9和10的核苷酸序列；優(yōu)選地，所述的分離的或重組的短干擾核酸進(jìn)一步包含3'突出端。
2.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的短干擾核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
3.權(quán)利要求1的分離的或重組的短干擾核酸，其進(jìn)一步包含其互補(bǔ)的核苷酸序列；優(yōu)選地，所述的互補(bǔ)核苷酸序列，進(jìn)一步包含3'突出端。
4.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求3的短干擾核酸和其互補(bǔ)核苷酸序列，以及藥學(xué)上可接受的載體。
5.權(quán)利要求3的分離的或重組的短干擾核酸，其中所述核苷酸序列和所述互補(bǔ)核苷酸序列可雜交形成雙鏈體；優(yōu)選地，所述核苷酸序列進(jìn)一步包含3’突出端，而且所述互補(bǔ)核苷酸序列進(jìn)一步包含 3’突出端。
6.一種藥物組合物包含權(quán)利要求5的雙鏈體以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.一種含有義鏈和反義鏈的分離的或重組的短干擾核酸，其中所述有義鏈和所述反義鏈雜交形成雙鏈體，其中所述有義鏈含有與靶序列基本同一的核苷酸序列，其中所述靶序列選自 SEQ ID NOs :12-577 ；優(yōu)選地，所述有義鏈進(jìn)一步包含3’突出端，且所述反義鏈進(jìn)一步包含3’突出端。
8.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求7的雙鏈體以及藥學(xué)上可接受的載體。
9.一種含權(quán)利要求1的核苷酸序列的重組載體。
10.一種抑制mRNA翻譯為多肽的方法，包括將可表達(dá)NavL 8 mRNA的細(xì)胞與權(quán)利要求 1的短干擾核酸相接觸。
11.一種抑制多肽表達(dá)的方法，包括將可表達(dá)NavL 8多肽的細(xì)胞與權(quán)利要求1的短干擾核酸相接觸。
12.—種阻斷細(xì)胞中膜電位的方法，包括將表達(dá)NavL 8多肽的細(xì)胞與權(quán)利要求1的短干擾核酸相接觸。
13.—種阻斷細(xì)胞中鈉電流的方法，包括將表達(dá)NavL 8多肽的細(xì)胞與權(quán)利要求1的短干擾核酸相接觸。
14.一種抑制慢性疼痛的方法，包括對(duì)所需患者給藥有效劑量的權(quán)利要求2、4、6或8的藥物組合物。
15.權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)短干擾核酸在制備抑制慢性疼痛的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了可導(dǎo)致Nav1.8鈉通道基因的mRNA發(fā)生RNAi誘導(dǎo)降解的單鏈或雙鏈短干擾核酸，含這種短干擾核酸的藥物組合物；含這種短干擾核酸的重組載體；抑制mRNA翻譯的方法；抑制多肽表達(dá)的方法；阻斷細(xì)胞膜電位的方法；阻斷細(xì)胞鈉電流的方法；及抑制慢性疼痛的方法。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102352355SQ20111028870
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2005年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日
發(fā)明者J·C·亨特, S·戈?duì)柛呖? T·普里斯特利 申請(qǐng)人:先靈公司, 坎吉有限公司