專利名稱：淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，尤其涉及淡紫擬青霉(P. Iilacinus) 的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淡紫擬青霉(P. Iilacinus)屬半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青霉屬，廣泛分布于世界各地，具有功效高、寄主廣、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。淡紫擬青霉是目前防治植物寄生線蟲(chóng)的主要天敵真菌之一，極具研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。淡紫擬青霉是南方根結(jié)線蟲(chóng)與白色胞囊線蟲(chóng)卵的有效寄生菌，對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的卵寄生率高達(dá)60% -70%。對(duì)多種線蟲(chóng)都有防治效能， 其寄主有根結(jié)線蟲(chóng)、胞囊線蟲(chóng)、金色線蟲(chóng)、異皮線蟲(chóng)、甚至人畜腸道蛔蟲(chóng)，是防治根結(jié)線蟲(chóng)的生防制劑。淡紫擬青霉也能分泌毒素對(duì)線蟲(chóng)起毒殺作用。此外，還有部分淡紫擬青霉對(duì)植物病原菌具有拮抗效能。在淡紫擬青霉的培養(yǎng)過(guò)程中，尤其是在液體深層發(fā)酵過(guò)程中，淡紫擬青霉能分泌大量的對(duì)線蟲(chóng)起殺毒作用的毒素(CAYREL JC. et al. Study of the nematocidal properties of the culture filtrate of thenematophagous fungus Paecliomyces lilacimus(J). RevudedNematologie. 1989. 12 :331-336)?，F(xiàn)有的淡紫擬青霉的發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵工藝的研究還很不成熟，存在著許多急需解決的問(wèn)題，例如，隨著培養(yǎng)基的組成、碳源、氮源、C/N和濕度、光照、溫度等因子的改變而誘發(fā)的菌株變異問(wèn)題，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)速度加快但產(chǎn)孢量下降，其生防效果也隨之下降。采取合理的發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)和發(fā)酵工藝，不但可以有效解決菌株變異問(wèn)題，對(duì)于提高孢子產(chǎn)率進(jìn)而實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)也十分重要。因此，為了提高液體發(fā)酵中淡紫擬青霉的孢子產(chǎn)量，需要對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及液體發(fā)酵條件等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和篩選以最大限度的提高淡紫擬青霉的孢子產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，以產(chǎn)孢量為考核指標(biāo)，對(duì)淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的C、N源營(yíng)養(yǎng)需求，培養(yǎng)溫度，PH值條件，溶氧狀況等條件進(jìn)行優(yōu)化或考察，獲得液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成或最適宜的發(fā)酵條件，有效提高淡紫擬青霉的孢子產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本低，為大規(guī)模殺線菌劑的研制和規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的—種淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括制備淡紫擬青霉孢子懸浮液；制備淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)基；向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種淡紫擬青霉孢子懸浮液，發(fā)酵培養(yǎng)，即得；其中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一種或多種，優(yōu)選為葡萄糖、可溶性淀粉或玉米粉，更優(yōu)選為葡萄糖；其中，所述碳源的用量?jī)?yōu)選為40. Og/L。所述的氮源包括但不限于硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨或黃豆粉中的任一種或多種；優(yōu)選為硝酸鈉、硫酸銨或黃豆粉中的一種或多種；更優(yōu)選的，所述氮源由硝酸鈉、硫酸銨和黃豆粉組成；所述氮源的用量?jī)?yōu)選為10. 0-20. Og/L ；其中，NaNO3的用量?jī)?yōu)選為5. 0-10. Og/ L，進(jìn)一步優(yōu)選為5. 0-6. Og/L，更優(yōu)選為5. Og/L ； (NH4)2SO4的用量?jī)?yōu)選為2. 5-5. Og/L，進(jìn)一步優(yōu)選為2. 5-2. 8g/L，更優(yōu)選為2. 5g/L ；黃豆粉的用量?jī)?yōu)選為2. 5-5. Og/L，進(jìn)一步優(yōu)選為 2. 5-2. 8g/L，更優(yōu)選為 2. 5g/L。為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中還可含有無(wú)機(jī)鹽；其中，所述的無(wú)機(jī)鹽包括但不限于磷酸二氫鉀或七水硫酸鎂；所述無(wú)機(jī)鹽的用量?jī)?yōu)選為0. 5-1. 5g/L，更優(yōu)選為1. 5g/L。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值對(duì)于淡紫擬青霉的孢子產(chǎn)量有著非常顯著的影響，當(dāng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值為3-9時(shí)均能產(chǎn)孢；本發(fā)明通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值在5. 0-7. 0，尤其當(dāng)初始pH值為 5. 0-5. 5時(shí)，淡紫擬青霉的孢子產(chǎn)量相對(duì)較高；當(dāng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值是5. 0時(shí)，淡紫擬青霉的產(chǎn)孢量達(dá)到最高，相比于其它PH值的產(chǎn)孢量有顯著性差異。淡紫擬青霉對(duì)氧的需求有一定的限制，本發(fā)明人通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)基在搖瓶中的裝液量對(duì)于孢子產(chǎn)量也有一定的影響，搖瓶裝量對(duì)產(chǎn)孢量有顯著影響，在發(fā)酵過(guò)程中，裝量應(yīng)控制在合適的范圍內(nèi)，裝量過(guò)低、過(guò)高不但不適合產(chǎn)孢而且還會(huì)造成資源的浪費(fèi)。500mL的搖瓶中培養(yǎng)基的裝量為IOOmL和200mL時(shí)較適合產(chǎn)孢，裝量在50mL時(shí)產(chǎn)孢量較低，裝量在300mL和400mL時(shí)產(chǎn)孢量也顯著降低，最終，本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基的搖瓶裝量為200mL(500mL的搖瓶)(占搖瓶體積的40% (ν/ν))時(shí)，產(chǎn)孢子量為最尚ο孢子懸液的接種量對(duì)產(chǎn)孢量也有一定影響，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種量相對(duì)較低時(shí)，增加接種量產(chǎn)孢量明顯增加，當(dāng)接種量由1. 0%增加至2. 0%時(shí)，產(chǎn)孢量增加近1倍，而當(dāng)接種量由3. 0%增加至5. 0%時(shí)，產(chǎn)孢量增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)減弱。因此，在發(fā)酵過(guò)程中選擇3. 0% 5. 0%的接種量，尤其為4. 5% 5. 0%的接種量較為適宜，最有利于提高孢子產(chǎn)量。淡紫擬青霉在-30°C范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)產(chǎn)孢，但隨著溫度的升高，產(chǎn)孢高峰出現(xiàn)的時(shí)間相應(yīng)推遲，所以溫度過(guò)低或過(guò)高均不適宜孢子的產(chǎn)生。本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)中，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25°C _27°C較適宜產(chǎn)孢，進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度為 260C時(shí)最適宜產(chǎn)孢，在此溫度下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)孢量接近60 X IO7個(gè)/ml。此外，本發(fā)明人通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程轉(zhuǎn)速的高低對(duì)產(chǎn)孢量有非常顯著的影響。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，搖床轉(zhuǎn)速為80-250r/min時(shí)都可產(chǎn)孢。為了摸索出最適宜的轉(zhuǎn)速條件以最大限度的提高孢子產(chǎn)量，本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)速進(jìn)行了反復(fù)優(yōu)選，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180-M0r/min時(shí)較為適宜產(chǎn)孢，進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220r/min時(shí)， 產(chǎn)孢量達(dá)到最高。本發(fā)明對(duì)淡紫擬青霉的發(fā)酵培養(yǎng)的各工藝參數(shù)，包括培養(yǎng)基的組成成分和用量、 培養(yǎng)基的初始PH值、孢子懸液的接種量、發(fā)酵培養(yǎng)的溫度和轉(zhuǎn)速等，進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，最終摸索出了最適宜產(chǎn)孢的各工藝參數(shù)，本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)方法孢子產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對(duì)較低。
圖1基礎(chǔ)培養(yǎng)基試驗(yàn)各組產(chǎn)孢量比較結(jié)果。圖2基礎(chǔ)培養(yǎng)基試驗(yàn)各組生物量比較結(jié)果。圖3試驗(yàn)各組發(fā)酵終點(diǎn)PH值比較結(jié)果。圖4復(fù)合培養(yǎng)基條件下產(chǎn)孢量結(jié)果。圖5無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)孢量的影響。圖6搖瓶裝量對(duì)產(chǎn)孢量的影響。圖7接種量對(duì)產(chǎn)孢量的影響。圖8溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)例淡紫擬青霉液體發(fā)酵培養(yǎng)各工藝參數(shù)的優(yōu)化篩選實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法1. 1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選項(xiàng)1. 1. 1 菌種淡紫擬青霉(P. Iilacinus)菌株購(gòu)自中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為:cfcc 86080。1.1.2 材料C源葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，可溶性淀粉，玉米粉；N源硝酸鈉，硫酸銨，蛋白胨，黃豆粉；無(wú)機(jī)鹽磷酸二氫鉀，硫酸鎂；1.1.3 方法培養(yǎng)基組合對(duì)以上碳源，氮源進(jìn)行全排列組合，組成20種培養(yǎng)配方(見(jiàn)表1)。培養(yǎng)基配比(克/升，g/L)碳源40，氮源20，無(wú)機(jī)鹽0. 5。菌種制備取15mL質(zhì)量濃度為0. 005g/L的吐溫80倒入經(jīng)PDA培養(yǎng)5d的淡紫擬青霉平板中，用無(wú)菌水洗下孢子，振蕩，混勻制成孢子懸浮液。培養(yǎng)條件500mL三角瓶中裝入培養(yǎng)基200mL，121 °C濕熱滅菌30min，冷卻至室溫， 用體積濃度為0. 5mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)初始pH值為6. 0。在無(wú)菌條件下，接種孢子懸浮液，接種量為2% (ν/ν)，置25°C搖床160r/min培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)。表1 20組培養(yǎng)基C、N源配合
權(quán)利要求
1.一種淡紫擬青霉(p. Hlacinus)的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括制備淡紫擬青霉孢子懸浮液；制備淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)基；向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種淡紫擬青霉孢子懸浮液，發(fā)酵培養(yǎng)；其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一種或多種；所述的氮源選自硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨或黃豆粉中的任一種或多種。
2.按照權(quán)利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述的碳源是葡萄糖；所述氮源由硝酸鈉、硫酸銨和黃豆粉組成。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述碳源的用量為 40. 0 g/L ；所述氮源的用量為10. 0-20. Og/L。
4.按照權(quán)利要求2所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述NaNO3的用量為 5. 0-10.0 g/L，優(yōu)選為 5.0-6. 0 g/L ；所述(NH4) 2S04 的用量為 2. 5_5. Og/L，優(yōu)選為 2. 5-2. 8 g/L ；所述黃豆粉的用量為2. 5-5. 0 g/L，優(yōu)選為2. 5-2. 8g/L。
5.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有無(wú)機(jī)鹽。
6.按照權(quán)利要求5所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述的無(wú)機(jī)鹽是磷酸二氫鉀或七水硫酸鎂；優(yōu)選的，所述無(wú)機(jī)鹽的用量為0. 5-1. 5 g/L。
7.按照權(quán)利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 PH值調(diào)為5. 0-7. 0后接種淡紫擬青霉孢子懸浮液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；優(yōu)選的，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值調(diào)為5. 0-5. 5后接種淡紫擬青霉孢子懸浮液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；更優(yōu)選的，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值調(diào)為5. 0后接種淡紫擬青霉孢子懸浮液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
8.按照權(quán)利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于按ν/ν計(jì)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝液體積占搖瓶體積的40%。
9.按照權(quán)利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于按ν/ν計(jì)，所述的接種量為 3. 0% -5. 0%，優(yōu)選為 4. 5% -5. 0%。
10.按照權(quán)利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為 發(fā)酵溫度為-30°C，優(yōu)選為25°C _27°C，更優(yōu)選為；搖床轉(zhuǎn)速為80-250 r/min，優(yōu)選為 180-240 r/min，更優(yōu)選為 220 r/min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括制備淡紫擬青霉孢子懸浮液；制備淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)基；向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種淡紫擬青霉孢子懸浮液，發(fā)酵培養(yǎng)；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一種或多種；所述的氮源選自硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨或黃豆粉中的任一種或多種。本發(fā)明對(duì)淡紫擬青霉的發(fā)酵培養(yǎng)的各工藝參數(shù)，包括培養(yǎng)基的組成成分和用量、培養(yǎng)基的初始pH值、孢子懸液的接種量、發(fā)酵培養(yǎng)的溫度和轉(zhuǎn)速等進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，獲得了最適宜產(chǎn)孢的各工藝參數(shù)。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)方法孢子產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對(duì)較低，適用于規(guī)?；a(chǎn)淡紫擬青霉菌劑。
文檔編號(hào)C12N3/00GK102286421SQ201110274968
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者劉春秀, 樸春根, 李永, 林彩麗, 汪來(lái)發(fā), 王曦茁, 田國(guó)忠, 郭民偉 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所