專利名稱：一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞分離培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是哺乳類動物雄性成體內(nèi)唯一可將遺傳信息傳遞給下一代的干細(xì)胞，它具有多潛能性，能被誘導(dǎo)分化成多種類型的細(xì)胞， 在一定情況下它還能生成擬胚體，是一種天然不用轉(zhuǎn)基因就能得到IPS細(xì)胞良好材料，而且它生成精子，完成基因的傳遞，伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起，它成為一種新的轉(zhuǎn)基因途徑。精子發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，是維持雄性生殖能力和生命延續(xù)的前提。深入了解精子發(fā)生的分子和細(xì)胞機(jī)理，保護(hù)瀕危動物物種以及治療人類因化療和放療引起的內(nèi)源性 SSCs損傷和恢復(fù)男性生育能力。精原干細(xì)胞技術(shù)與動物選種工作相結(jié)合，將會大規(guī)模的生產(chǎn)出優(yōu)良家畜。SSCs具有多潛能性并分化為來源于三胚層的多種組織細(xì)胞，精原干細(xì)胞為今后細(xì)胞替代療法和組織器官移植的來源成為可能。其在組織工程、細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域的運(yùn)用提供了研究基礎(chǔ)，對臨床醫(yī)學(xué)有較大應(yīng)用價值。精原干細(xì)胞不僅對生物學(xué)、生物學(xué)技術(shù)、醫(yī)學(xué)和發(fā)育學(xué)等方面的研究具有特殊的價值，使其成為近年來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。目前研究主要SSCs的分離方法主要集中在機(jī)械法和兩步酶法消化；而純化方法主要有差速貼壁法，percoll密度梯度離心法，自然重力沉降法，流式細(xì)胞術(shù)分選以及免疫磁珠等分選等方法，各種方法都存在著優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)需要來選擇。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的細(xì)胞分離培養(yǎng)中存在的不足，提供一種獲得細(xì)胞容易，培養(yǎng)時間短，細(xì)胞增殖快、狀態(tài)好且操作簡便，實(shí)驗(yàn)成本低的分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法，包括如下步驟
(1)將仔豬的睪丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗滌2 3次，去除血污；
(2)去掉睪丸白膜和結(jié)締組織，將剩下的睪丸組織剪成小塊，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中；
(3)加入10倍體積的PBS，用吸管吹打，靜置，待睪丸組織沉到底部后，棄上清；
(4)重復(fù)步驟(3)2 3次；
(5)加入10倍體積的膠原酶消化，于37！的水浴鍋100 rpm，然后用吸管吹打，直到看不到組織塊；
(6)加入5 10ml的PBS，吹打，在16 °C >600 rpm離心5 min，棄上清，收集底部細(xì)胞；
(7)用差異貼壁培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5XIO6個/ml，接種到事先用0. 1 %
3明膠包被的培養(yǎng)瓶中，在無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37 5 % CO2,飽和濕度。通過MTT法對比三種培養(yǎng)基，DMEM、DMEM-Fl2, α -MEM以及血清濃度5 %，10 %，15 %三種濃度培養(yǎng)效果，得出了 DMEM、15 %血清濃度最為適合豬SSCs的增殖培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)報道，添加非必需氨基酸；β -巰基乙醇，L-谷氨酰胺等是培養(yǎng)細(xì)胞基礎(chǔ)，起到了營養(yǎng)，抗氧化和能量物質(zhì)的作用。如表一所示
表1不同培養(yǎng)基和血清濃度對豬SSCs增殖率的影響
權(quán)利要求
1.一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將仔豬的睪丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗滌2 3次，去除血污；(2)去掉睪丸白膜和結(jié)締組織，將剩下的睪丸組織剪成小塊，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中；(3)加入10倍體積的PBS，用吸管吹打，靜置，待睪丸組織沉到底部后，棄上清；(4)重復(fù)步驟(3)2 3次；(5)加入10倍體積的膠原酶消化，于37！的水浴鍋100 rpm，然后用吸管吹打，直到看不到組織塊；(6)加入5 10ml的PBS，吹打，在16 °C >600 rpm離心5 min，棄上清，收集底部細(xì)胞；(7)用差異貼壁培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5XIO6個/ml，接種到事先用0. 1 % 明膠包被的培養(yǎng)瓶中，在無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37 5 % CO2，飽和濕度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法，其特征在于所述用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液主要成分為=DMEM 83 %，L-谷氨酰胺1 %，非必需氨基酸1 %，β-巰基乙醇55 μ Μ，胎牛血清15%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞的方法以及培養(yǎng)體系。本發(fā)明方法通過采用一步酶法來分離消化豬精原干細(xì)胞，替代目前主要采用的兩步酶消化方法，該方法獲得細(xì)胞容易，培養(yǎng)時間短，細(xì)胞增殖快、狀態(tài)好。通過本發(fā)明方法，解決了目前精原干細(xì)胞分離難、數(shù)量少、增殖慢、培養(yǎng)要求高的問題，為快速獲取大量豬精原干細(xì)胞提供了一種新的方法。而且本方法操作簡便，實(shí)驗(yàn)成本低，降低了實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N5/076GK102417893SQ20111027292
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者張守全, 白銀山 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)